Obtención de imágenes celulares mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total

Comience con una configuración de microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) con una cámara de imágenes cubierta que contiene un cubreobjetos de vidrio con células de neuroblastoma humano adheridas en un tampón.

Estas células expresan fluoróforos específicos de las membranas de las vesículas sinápticas.

En el modo de epifluorescencia, seleccione una celda para obtener imágenes.

En el modo TIRF, a través del objetivo, dirige un láser a la muestra, apareciendo como un punto en la cubierta.

Ajuste el ángulo para exceder el ángulo crítico en la interfaz entre el cubreobjetos de vidrio de alto índice de refracción y la muestra de menor índice de refracción, lo que provoca una reflexión interna total (TIR), que se ve como una línea delgada.

TIR genera una onda evanescente que excita los fluoróforos en la membrana más cercana.

La fluorescencia emitida es recogida por el objetivo y captada por una cámara.

Ajuste para obtener una imagen de alto contraste de la membrana celular cerca del cubreobjetos.

Optimice la configuración de adquisición para minimizar el fotoblanqueo y establecer la frecuencia de muestreo.

Comience la adquisición de imágenes TIRF para visualizar vesículas sinápticas fusionadas.

En el modo de epifluorescencia, concéntrese en el cubreobjetos y elija células transfectadas colocadas en el centro de la cámara. Bajo el control del software, cambie a la iluminación del césped en modo en vivo. Para establecer la configuración del césped, verifique la posición del haz que emerge del objetivo en la cubierta de muestra. Cuando el haz se coloca en el centro de la lente del objetivo, se ve un punto en el centro de la cubierta de muestra de césped y se obtiene una imagen de la célula en modo de epifluorescencia.

Para alcanzar el ángulo crítico, mueva el punto enfocado en la dirección Y usando el tornillo de ajuste de ángulo en el control deslizante de césped. Cuando el haz converge en el plano de la muestra en un ángulo mayor que el ángulo crítico, el punto desaparece y se evidencia una línea recta, delgada y enfocada en el medio de la cubierta de la muestra. Para ajustar el ángulo del césped, use una muestra de celda.

Vea la imagen de fluorescencia en el video. En esta etapa, todavía se puede ver una imagen similar a la epifluorescencia. Mueva suavemente el tornillo hasta lograr la condición de césped. Aquí, solo un plano óptico de la célula está enfocado, lo que da como resultado una imagen plana con alto contraste.

Para realizar imágenes de muestra, configure el experimento de lapso de tiempo de un solo canal. Los tiempos de exposición adecuados son de entre 40 y 80 milisegundos. Adquiera imágenes con una frecuencia de muestreo de 1 o 2 hercios.