Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para la visualización de eventos exocíticos

Comience con un plato con fondo de vidrio que contenga neuronas corticales embrionarias en una fluorescencia de reflexión interna total o una platina de microscopio TIRF.

Estas neuronas expresan una proteína fluorescente verde sensible al pH o un marcador de vesícula marcado con GFP que emite fluorescencia en pH extracelular neutro pero permanece no fluorescente en vesículas ácidas.

Tras la fusión de vesículas con la membrana plasmática, la exposición al pH extracelular induce fluorescencia, marcando el evento de exocitosis.

Seleccione el objetivo y establezca el índice de refracción para que coincida con la neurona.

Dirija el rayo láser en ángulo con respecto al vidrio, lo que provoca una reflexión interna total y genera una onda evanescente. Esta onda excita selectivamente los marcadores de GFP cerca de la membrana plasmática.

Establezca la profundidad de penetración de TIRF para excluir los marcadores GFP por encima del campo evanescente.

Primero, use iluminación de epifluorescencia de campo amplio para localizar neuronas que expresan GFP.

Luego, cambie a iluminación TIRF para excitación específica de membrana.

Adquiera imágenes de lapso de tiempo para registrar el evento de fusión de v