Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para la visualización de eventos exocíticos

Comience con un plato con fondo de vidrio que contenga neuronas corticales embrionarias en una fluorescencia de reflexión interna total o una platina de microscopio TIRF.

Estas neuronas expresan una proteína fluorescente verde sensible al pH o un marcador de vesícula marcado con GFP que emite fluorescencia en pH extracelular neutro pero permanece no fluorescente en vesículas ácidas.

Tras la fusión de vesículas con la membrana plasmática, la exposición al pH extracelular induce fluorescencia, marcando el evento de exocitosis.

Seleccione el objetivo y establezca el índice de refracción para que coincida con la neurona.

Dirija el rayo láser en ángulo con respecto al vidrio, lo que provoca una reflexión interna total y genera una onda evanescente. Esta onda excita selectivamente los marcadores de GFP cerca de la membrana plasmática.

Establezca la profundidad de penetración de TIRF para excluir los marcadores GFP por encima del campo evanescente.

Primero, use iluminación de epifluorescencia de campo amplio para localizar neuronas que expresan GFP.

Luego, cambie a iluminación TIRF para excitación específica de membrana.

Adquiera imágenes de lapso de tiempo para registrar el evento de fusión de vesículas y visualizar la exocitosis.

Después de configurar el microscopio TIRF y la muestra y encontrar un plano focal neuronal de acuerdo con el protocolo de texto, inicie el software láser y conéctese al software de control láser. Establezca la iluminación en campo amplio y seleccione el objetivo. A continuación, establezca el índice de refracción de la muestra y ajuste la intensidad del láser desmarcando el TTL para el láser 491.

La optimización de los parámetros de imagen es importante durante la obtención de imágenes de vesículas exocíticas intactas en el piso para evitar la deriva del enfoque y la fototoxicidad, al tiempo que produce imágenes de alta relación señal-ruido suficientes para el análisis.

Ajuste el control deslizante a 100 y, a continuación, vuelva a bajarlo a un valor entre 20 y 40. Luego vuelva a verificar TTL. A continuación, vuelva a centrarse en la muestra con iluminación de luz transmitida.

Luego, en el software de imágenes, seleccione la iluminación láser 491 y abra el obturador. Coloque el condensador boca abajo en el banco óptico para no rayar la lente. Ajuste con precisión el punto focal del láser en el techo.

Y con el condensador retirado, centre la punta en el centro del diafragma de campo cerrado. Luego reemplace el condensador. Y en el software TIRF, establezca la profundidad de penetración en 110 nanómetros. A continuación, cambie de la iluminación de campo amplio al modo de iluminación TIRF para obtener imágenes.

Ahora, utilizando epifluorescencia de campo amplio, encuentre células que expresan florina VAMP2 a través de los ojos. Luego, para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad, ajuste los parámetros de imagen para maximizar la relación señal-ruido y el rango dinámico utilizando un tiempo de exposición e intensidad láser mínimos. Establezca el enfoque automático continuo por celda. A continuación, adquiera un conjunto de imágenes de lapso de tiempo con la adquisición cada 0,5 segundos durante 5 minutos.