Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

El objetivo general de este procedimiento es realizar un experimento de micro ARN y microarrays. Esto se logra adquiriendo primero portaobjetos de microarrays impresos que contienen una biblioteca de sondas de micro ARN y preparando muestras de ARN con la calidad y cantidad adecuadas. A continuación, la muestra de ARN y ADN controlada A se marcan con tintes fluorescentes.

A continuación, los ácidos nucleicos marcados se añaden a un portaobjetos de microarray para su hibridación. Finalmente, el portaobjetos del microarray se lava y escanea y el portaobjetos se regenera. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión de microARN en todo el genoma a través del análisis del portaobjetos para las intensidades de hibridación de las sondas de microARN individuales.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la expresión génica, como por ejemplo cómo las condiciones fisiológicas normales o las condiciones patológicas diferenciales afectan a las necesidades de microexpresión a escala global. La calidad de la fabricación de microarrays es uno de los factores más críticos para el éxito de un experimento de microarrays. Después de aislar el ARN utilizando un método que conserva los ARN pequeños y los suspende en una concentración igual o superior a dos miligramos por mililitro, etiquete el ARN en un volumen de reacción de 20 microlitros mezclando primero unos 25 microgramos de ARN total con 0,5 microgramos de cinco primos P-C-U-D-Y 5 4 7 3 primos en un tampón X HEPs suplementado con T cuatro ARN ligasa 1D TT, y un TP. Si hay menos ARN disponible, reduzca la cantidad de ARN y la reacción.

Si el ARN está muy diluido, agregue un portador como levadura, ARNt para ayudar con la precipitación, incube la reacción en hielo dentro de un refrigerador durante dos a 24 horas. A continuación, agregue acetato de sodio a 0,3 molar, y luego tres volúmenes de etanol y precipite el ARN durante la noche a menos 20 grados centígrados. Para usar los portaobjetos por primera vez, hibridéelos previamente en una solución filtrada de tres XSSC, 0.1% SDS y 0.2% BSA durante 30 a 60 minutos a 37 grados Celsius.

A continuación, sumerja los toboganes en agua unas cuantas veces. Luego, en isopropanol, seque los portaobjetos con una centrífuga con un adaptador de portaobjetos a 100 veces G durante cinco minutos a 22 grados centígrados. Enjuague las tiras elevadoras con agua.

Luego, en etanol antes de secar al aire, coloque un portaobjetos dentro de una base de cámara de hibridación de microarrays y un deslizador de elevación en la parte superior del portaobjetos para que el deslizamiento del elevador cubra el área de la sonda y sus tiras blancas. Póngase en contacto con el portaobjetos en la oscuridad, centrifugue el ARN marcado precipitado, lávelo una vez con etanol al 70% y seque el pellet al aire. El pellet debe ser de color rojizo.

Prepare una solución de hibridación utilizando un 15 a un 100 de volumen del ADN de referencia marcado purificado por muestra de ARN Disuelva completamente la pastilla de ARN con aproximadamente 60 microlitros de la solución de hibridación para asegurarse de que la solución de hibridación no se seque. Durante la incubación, agregue 20 microlitros de agua a cada uno de los pozos humidificadores. En la base de la cámara de hibridación de microarrays.

Agregue la mezcla de ARN marcado y ADN de referencia al portaobjetos. Con una punta de pipeta fina, toque suavemente el borde del deslizamiento del elevador y a través de la succión. Permita que la solución entre en el espacio entre el deslizamiento del elevador y el deslizamiento.

Coloque la tapa de la cámara de hibridación sobre la base. A continuación, selle la cámara con clips metálicos. Coloque toda la cámara dentro de la bolsa de plástico que viene con el casete de la cámara.

Finalmente, coloque el casete de la cámara dentro de un recipiente con una toalla de papel húmeda. Luego cubra el recipiente con una envoltura de plástico y colóquelo dentro de una incubadora de cultivo celular húmedo a 37 grados centígrados durante aproximadamente 24 horas. Para procesar las correderas después de la hibridación, desmonte los casetes de la cámara uno por uno, sumerja una corredera y su deslizador elevador en dos XSSC a 22 grados centígrados.

El deslizamiento del elevador se caerá naturalmente del tobogán, lave los toboganes en 0.8 XSSC dos veces, luego tres veces en 0.4 XSSC durante un total de uno a dos minutos. Seque los portaobjetos con una centrífuga con un adaptador de portaobjetos. A continuación, escanee las diapositivas con un escáner de microarrays y utilice un programa como blue fuse para cuantificar las intensidades de los archivos de imagen.

Inspeccione las manchas individuales para excluir las manchas anormales que suelen surgir de la impresión de portaobjetos de poros o de la manipulación de portaobjetos después de la hibridación. Para el análisis y la presentación de los datos, utilice programas como gene springing y excel para reutilizar el microarray. Pese el portaobjetos enjuagándolo con agua, luego sumergiéndolo en un plato de tinción de precalentar un milimolar de NAOH y 0.1 XSSC a 62 grados Celsius durante 10 a 20 minutos.

Repita la incubación por segunda vez. Lave los portaobjetos varias veces en agua durante un máximo de 60 minutos agitándolos suavemente a 22 grados centígrados. Seque los portaobjetos con una centrífuga y guárdelos a 22 grados centígrados.

Los portaobjetos se pueden utilizar sin hibridación previa. Esta figura muestra una imagen escaneada de un microarray que demuestra señales de hibridación muy precisas y fuertes. Las manchas rojas fueron el resultado de la hibridación de las manchas verdes del ADN de referencia de la muestra de ARN marcada con DY 5 47, y las manchas amarillas fueron el resultado de la hibridación del ADN y el ARN con las mismas sondas.

Los coeficientes de correlación de Pearson entre las réplicas técnicas de la hibridación de microarrays son de aproximadamente 0,99, lo que indica una excelente reproducibilidad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de microrrayos personalizado, no solo para cuantificar la micronasa, sino también para cuantificar otros tipos de ácido nucleico como los ARNm.