Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

El objetivo general de este procedimiento es permitir una configuración automatizada rápida y fiable de matrices basadas en QPCR. Esto se logra preparando primero los conjuntos de cebadores para la matriz y configurando las mezclas maestras de muestra que se van a filtrar. A continuación, se utiliza una configuración de PCR robótica automatizada o un sistema de pipeta electrónica de matriz para tomar muestras con precisión, la mezcla maestra y los conjuntos de cebadores de Eloqua en cada pocillo de una placa de 384 pocillos.

Una vez preparadas, las reacciones de PCR de 384 pocillos se ejecutan con el programa de PCR basado en ciberseguridad de 80 80 cicladores de luz. El paso final del procedimiento es analizar los datos de QPCR y determinar los niveles de expresión relativos para cada par de cebadores probados, cada uno de los cuales se dirige a un ARNm específico. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en la expresión de grandes conjuntos de ARNm.

Por lo tanto, las matrices desarrolladas específicamente pueden dirigirse a perfiles completos de pre micro ARN, vías específicas o moléculas clave para la infección viral a través de perfiles basados en QPCR. Hola, soy Dirk DMA del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Hoy le mostraremos cómo configurar QQPC rra en tiempo real y le mostraremos dos métodos.

Uno, usando pipeta irregular y otro usando un robot. Utilizamos esta tecnología para medir pre microRNAs y microRNAs maduros en tumores humanos. La demostración de hoy estará a cargo de Pauline Chu y Kristen bu.

Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, recupere las placas de cebadores que contengan 186 pares de cebadores en un 96. Formato de pozo a 0,5 picaMoles almacenados a menos 20 grados centígrados.

Después de descongelar las placas a temperatura ambiente, vértice y centrifugue brevemente. Además, descongele el verde cibernético dos veces, mezcla de PCR a temperatura ambiente para la configuración de cada placa de cebado de 96 pocillos, se necesitarán cuatro tubos de mezcla maestra. Prepare la mezcla maestra combinando cuatro microlitros de mezcla verde cibernética, tres microlitros de agua de grado PCR y de 10 a 20 nanogramos de muestra de ADN o CDNA por reacción en cada uno de los cuatro tubos de einor de dos mililitros.

Cada tubo debe contener suficiente mezcla maestra para aproximadamente 100 reacciones, permitiendo el exceso para los residuos de pipeteo. Vórtice los tubos de einor para mezclar. Comience la configuración del ensayo de micro ARN precursor utilizando el robot libre Tecan EVO con inicialización del robot y carga del programa de desgaste EVO.

A continuación, enjuague el robot tres veces con 30 mililitros de líquido del sistema para limpiar el sistema de burbujas de aire que interferirán con la precisión del pipeteo. A continuación, configure la plataforma del robot para que incluya una placa de 384 pocillos y una placa de cebado de 96 pocillos. El maestro mezcla un comedero que contiene un 2% de lejía, un sistema lleno, un contenedor de fluido y un contenedor de residuos vacío.

Comience la ejecución automatizada del robot seleccionando ejecutar dos veces al final del programa. Retire la placa de pocillos 384 y selle con un ciclador de luz cuatro láminas de techo 80. A continuación, centrifuga la placa.

Coloque brevemente la placa sellada de 384 pocillos en la posición uno del hotel. A continuación, repita este proceso para la placa de cebado dos con nuevas mezclas maestras y una nueva placa de 384 pocillos. Coloque la placa 384 world sellada resultante en la posición dos del hotel.

Abra un nuevo programa de desgaste EVO para cargar el ciclador ligero desde el hotel y configure los parámetros de ciclo. A continuación, seleccione ejecutar dos veces. Freedom Evo cargará automáticamente cada placa en el ciclador de luz y ejecutará el programa de ciclismo HRM cyber green one.

Una vez completado. Revise y analice los resultados tal y como se describe en el protocolo escrito como alternativa al uso del robot. Se puede utilizar una pipeta electrónica multicanal de matriz para comenzar a colocar el contenido del tubo de mezcla maestro en un depósito.

Configure la pipeta electrónica para aspirar 16 microlitros de mezcla maestra con dos pasos de dispensación de ocho microlitros seguidos de un paso de purga. Después de configurar la pipeta, aspire 16 microlitros de mezcla maestra y comience a dispensar en una placa de rueda 384. Dispense los primeros ocho microlitros en cada dos filas de la primera columna usando las filas de la A a la O, dejando la siguiente columna vacía.

Dispense los segundos ocho microlitros en las mismas filas de la columna tres. A continuación, purgue sobre un contenedor de residuos y deseche las puntas siguiendo este patrón de dejar filas y columnas alternas. Dispense a través de la placa durante cinco ciclos más para pipetear la mezcla maestra dos.

Utilice las mismas filas que la mezcla maestra uno, pero comience con la columna dos. Repita este procedimiento para las mezclas maestras tres y cuatro, comenzando con las columnas uno y dos respectivamente, pero esta vez usando la cita de la rosa B a P.Her de la placa de cebador. Configure una pipeta electrónica para aspirar dos microlitros y dispense dos microlitros con un paso de purga a continuación.

Transfiera dos microlitros de cebadores de la columna de una fila A a H de una placa de cebador de 96 pocillos a cada otra columna de remo, una de las placas de 384 pocillos, purgue un contenedor de desechos y deseche las puntas. Repita este patrón para la imprimación quatt para las tres mezclas maestras restantes de las columnas uno y dos. A continuación, continúe este proceso para las columnas dos a 12 de la placa de cebador de 96 pocillos, moviéndose cada dos columnas de la placa de 384 pocillos para cada columna de cebador.

A continuación, selle las placas con un techo de ciclador ligero, papel de aluminio y centrífuga. Brevemente después de la centrifugación. Coloque las placas en un ciclador de luz four 80 y cicle las placas utilizando el formato de detección HRM de color verde cibernético.

Usando las mismas condiciones de ciclo que antes, repita este procedimiento usando la placa de imprimación dos Eloqua en una placa nueva de 384 pocillos usando mezclas maestras recién preparadas. Las firmas de micro ARN precursores emergen a través de la creación de perfiles utilizando una nueva matriz basada en QPCR. Se calculó el CT delta promedio normalizado a U seis y los valores estandarizados se cargaron en la matriz.

Software menor que produce tres clústeres distintos que se muestran como mapas de calor. La expresión relativa de cada micro ARN precursor se muestra en rojo y azul representan un aumento y disminución en la expresión relativa respectivamente. La intensidad del color indica el grado de cambio de expresión.

La mayoría de los microARN precursores sufrieron cambios pequeños e insignificantes, como se esperaba. Sin embargo, una pequeña porción de microARN precursores aumentó significativamente a lo largo del experimento en el curso del tiempo. Además, el nivel relativo de algunos microARN precursores disminuyó drásticamente.

En algunos casos. También se agrupan en el análisis del mapa de calor. Dependiendo del experimento, pueden surgir grupos que dependan de la infección viral, de la expresión específica del tipo de célula de microARN precursores o de microARN precursores que estén regulados por una molécula común o una vía de señalización.

Se muestran los umbrales de ciclo promedio o cts de una muestra negativa del virus del herpes asociado al sarcoma de Posey que se ejecuta cuatro veces. Es importante destacar que el antígeno nuclear asociado al virus del herpes de Kaposi o KSHV Lana no se detectó en esta muestra mediante la matriz de QPCR de alta sensibilidad. Sin embargo, tanto el control interno U six como el let seven a, un micro ARN precursor humano altamente expresado, se expresaron a niveles detectables.

Finalmente, como se esperaba, el testigo negativo de agua de grado PCR no arrojó producto A-Q-P-C-R. Un análisis de la curva de fusión para dos cebadores diferentes. Usando el mismo muestreo se muestra duplicado.

Está claro que la temperatura de fusión es diferente para los dos pares de cebadores, pero la muestra se funde exactamente a la misma temperatura para cada réplica. Los signos de una muestra defectuosa o potencialmente contaminada pueden incluir varios picos de fusión, lo que sugiere la presencia de dos fuentes diferentes de entrada. Acabamos de mostrarte cómo configurar experimentos QPCR en tiempo real utilizando un robot.

Es importante que incluya todos los controles y la mayor cantidad posible de genes de limpieza. Así que gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.