Protocolos para la inoculación dentro de la vagina y toma de muestras en el modelo experimental de ratón de Candida Vaginitis

El objetivo general de este procedimiento es demostrar los problemas de procedimiento específicos asociados con el uso del modelo animal experimental de candidiasis vaginal como medio para cuantificar la carga fúngica vaginal, y también utilizar células vaginales o linfoides en ensayos específicos como ensayos inmunológicos e histológicos. Esto se logrará demostrando primero la técnica de inoculación vaginal en ratones tratados con estrógenos. A continuación, tras la eutanasia del ratón, se realizará un lavado vaginal para recuperar la cándida.

A continuación, se extraerá el tejido vaginal y/o los ganglios linfáticos que drenan la vagina. El líquido de lavado se puede observar microscópicamente para mostrar la cándida asociada con las células epiteliales vaginales o en agar para cuantificar la carga fúngica vaginal. También se puede utilizar un frotis de la fracción celular para teñir las células epiteliales y las células linfoides.

Por lo tanto, la principal ventaja de demostrar esta técnica es que los usuarios del modelo animal de vaginitis pueden hacerlo de la manera más eficiente y efectiva. Y las preguntas clave que se están respondiendo a través de la técnica se encuentran en el campo de la vaginitis y la ecología y responden a preguntas clave como las respuestas inmunitarias del huésped, la distribución celular, la eficacia de los fármacos, la eficacia inmunoterapéutica y también los efectos de la inmunización y la demostración de la técnica. Hoy será un estudiante de posgrado en mi laboratorio, junco yano, para infectar a un ratón con C albicans tres días después de administrar una inyección de beta estradiol.

Comience estabilizando el mouse sobre una superficie plana gRED para que lo agarre. A continuación, sujeta la base de la cola con dos dedos y levanta la cadera hacia arriba para que la abertura vaginal mire hacia ti. Inserte la punta de la pipeta a unos cinco milímetros de profundidad en el lumen vaginal y pipetee hasta 20 microlitros de la suspensión de inóculo.

Complete este paso lo más rápido y suavemente posible para minimizar la angustia en el mouse. Después del período de incubación deseado, eutanasiar al animal de acuerdo con el protocolo de su instalación. Luego, con dos dedos, sostenga el ratón hacia abajo por la base de la cola para que la abertura vaginal quede expuesta con una pipeta.

Introducir 100 microlitros de PBS estéril en la luz vaginal, y con aspiración y agitación repetidas, realizar el lavado. Si la punta de la pipeta se obstruye con células, dispense las células obstruccionistas y continúe devastando con el PBS restante. Recoja el líquido de lavado en un tubo de microcentrífuga.

Después del procedimiento de lavado vaginal, coloque al ratón boca arriba y sature el área de la ingle con etanol al 70%. Con un par de fórceps, levante el orificio urinario hacia arriba para que la abertura vaginal quede expuesta. Inserte un par de pinzas curvas en la luz vaginal y ubique el cuello uterino mientras mantiene un agarre firme con las pinzas.

Extraiga el cuello uterino a través de la cavidad vaginal, extirpe la vagina en la base de la abertura vaginal y luego extraiga el cuello uterino de la vagina con tijeras quirúrgicas. Debido a que el tejido vaginal está involutivo, inviértalo para mantener la orientación original o ábralo en forma de sábana haciendo una incisión lateral para la extirpación del ganglio lumbar con el animal boca arriba. Saturar el abdomen con etanol al 70%.

Haga una incisión lateral desde la parte inferior del abdomen hasta el tórax y exponga los órganos internos con un par de pinzas en ambas manos. Mueva los intestinos hacia arriba para que los vasos sanguíneos centrales se vuelvan visibles. Localiza la vena inferior y la aorta abdominal.

Se pueden identificar un par de ganglios linfáticos lumbares adyacentes a la aorta abdominal ubicados aproximadamente a medio camino entre el origen de las arterias renal e ilíaca común. Estos ganglios linfáticos se pueden distinguir visualmente del tejido graso por su textura elástica y son más claros y de color más opaco en comparación con el tejido graso. También son notablemente más grandes en los animales infectados en comparación con los no inoculados.

Los animales extirparon los ganglios linfáticos colocando micropinzas debajo del ganglio y luego tiraron suavemente hacia arriba para separarlos del tejido circundante. Después de extirpar el tejido, transfiera los ganglios linfáticos a una pantalla de malla de alambre estéril colocada dentro de una placa de Petri de vidrio estéril que contiene aproximadamente 10 mililitros de la solución salina equilibrada de Hank. Para aislar las células linfoides, consulte el protocolo escrito.

Las fracciones celulares del líquido de lavado vaginal de ratones inoculados al menos cuatro días antes suelen consistir en células epiteliales de Candida e infiltrados celulares, como se muestra aquí mediante microscopía de montaje húmedo. La cándida se puede identificar por la presencia de PHA y levadura. Aquí se tiñen las preparaciones de frotis de líquido de lavado vaginal.

Utilizando la técnica de Papanicolaou para examinar las células epiteliales y los leucocitos infiltrantes, de los cuales las células principales son neutrófilos, como se pueden identificar por los lóbulos tracleares. Se detectan muy pocos neutrófilos, si es que hay alguno, en ratones no inoculados. Esta figura muestra un ejemplo de carga fúngica vaginal.

El líquido de lavado vaginal se recolecta en puntos de tiempo específicos y se cultiva para la enumeración de UFC. En este ejemplo, el líquido se recolectó al quinto día después de la inoculación, en serie, se diluyó en placa y se incubó durante 48 horas. A continuación, se cuentan las colonias y se calcula la carga fúngica vaginal: la colonización vaginal o la infección por cándida persisten durante semanas en ratones inoculados tratados con estrógeno.

Mientras que la cándida no logra establecer la colonización vaginal en ratones inoculados no tratados con estrógeno, los ratones no inoculados tratados con estrógeno permanecen negativos para la cándida durante todo el tiempo. Además, los lavados vaginales se pueden realizar una vez en ratones separados en cada punto de tiempo o longitudinalmente en los mismos ratones bajo anestesia. Al intentar este procedimiento, es importante recordar sujetar a los animales de forma segura para evitar traumatismos en la vagina, y tómese el tiempo necesario para lavarlos a fondo y obtener una carga fúngica vaginal precisa al extraer los tejidos vaginales.

Use PBS para evitar que se deshidraten, y tenga cuidado de no dañar las venas y arterias principales al extirpar los ganglios linfáticos y mientras procesa las células de los ganglios linfáticos, manténgalos en hielo o a cuatro grados para mantener la viabilidad celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo emplear el modelo experimental de ratón de vaginitis por cándida para cuantificar de manera reproducible la carga fúngica vaginal y extirpar tejidos vaginales o linfoides para ensayos inmunológicos o histológicos específicos.