Protocolos para la inoculación dentro de la vagina y toma de muestras en el modelo experimental de ratón de Candida Vaginitis

El objetivo general de este procedimiento es demostrar problemas específicos relacionados con el uso del modelo animal experimental de candidiasis vaginal como medio para cuantificar la carga fúngica vaginal, y también utilizar células vaginales o linfoides en ensayos específicos, como ensayos inmunológicos e histológicos. Esto se logrará primero demostrando la técnica de inoculación vaginal en ratones tratados con estrógeno. A continuación, tras la eutanasia del ratón, se realizará un lavado vaginal para recuperar Candida.

Luego se extraerá el tejido vaginal y/o los ganglios linfáticos drenantes vaginales. El líquido de lavado se puede observar microscópicamente para mostrar Candida asociada con células epiteliales vaginales o sembrarse en agar para cuantificar la carga fúngica vaginal. También se puede utilizar un frotis de la fracción celular para teñir células epiteliales y células linfoides.

Por lo tanto, la principal ventaja de demostrar esta técnica es que los usuarios del modelo animal de vaginitis puedan realizarla de la manera más eficiente y efectiva posible. Y las preguntas clave que se responden mediante esta técnica pertenecen al campo de la vaginitis y la ecología, y abordan cuestiones fundamentales como las respuestas inmunitarias del huésped, la distribución celular, la eficacia de fármacos, la eficacia de inmunoterapias, así como los efectos de la inmunización y la demostración de la técnica. Hoy, una estudiante de posgrado de mi laboratorio, Junco Yano, infectará un ratón con C albicans tres días después de administrar una inyección de beta-estradiol.

Comience estabilizando el ratón sobre una superficie plana de color rojo para que pueda agarrarse. Luego sostenga la base de la cola con dos dedos y levante la cadera hacia arriba de modo que la abertura vaginal quede orientada hacia usted. Introduzca la punta de la pipeta aproximadamente cinco milímetros dentro de la luz vaginal y aspire hasta 20 microlitros de la suspensión del inóculo.

Complete este paso lo más rápido y suavemente posible para minimizar el malestar en el ratón. Después del período de incubación deseado, sacrifique al animal según el protocolo de su instalación. Luego, con dos dedos, sostenga al ratón hacia abajo por la base de la cola de manera que la abertura vaginal quede expuesta con una pipeta.

Introduzca 100 microlitros de PBS estéril en la luz vaginal y, mediante aspiraciones y agitaciones repetidas, realice una lavado. Si la punta de la pipeta se obstruye con células, expulse las células que causan el bloqueo y continúe el lavado con el PBS restante. Recoja el líquido de lavado en un tubo pequeño para microcentrífuga.

Después del procedimiento de lavado vaginal, coloque al ratón boca arriba y sature el área inguinal con etanol al 70 %. Usando un par de pinzas, levante hacia arriba el orificio urinario para exponer la abertura vaginal. Introduzca un par de pinzas curvas en la luz vaginal y localice el cuello uterino mientras mantiene un agarre firme con las pinzas.

Extraiga el cuello uterino a través de la cavidad vaginal, reseque la vagina en la base de la abertura vaginal y luego retire el cuello uterino de la vagina con tijeras quirúrgicas. Debido a que el tejido vaginal está involucionado, inviértalo para mantener la orientación original o ábralo en forma de lámina realizando una incisión lateral para la extirpación del nódulo lumbar con el animal en posición supina. Sature el abdomen con etanol al 70%.

Realice una incisión lateral comenzando desde el abdomen inferior hasta el pecho y exponga los órganos internos utilizando un par de pinzas en ambas manos. Mueva los intestinos hacia arriba para que los vasos sanguíneos centrales queden visibles. Localice la vena cava inferior y la aorta abdominal.

Un par de ganglios linfáticos lumbares puede identificarse adyacente a la aorta abdominal, ubicado aproximadamente a mitad de camino entre el origen de las arterias renales y las arterias ilíacas comunes. Estos ganglios linfáticos pueden distinguirse visualmente del tejido adiposo por su textura elástica y son más claros y opacos en color en comparación con el tejido adiposo. También son notablemente más grandes en animales infectados en comparación con los no inoculados.

Los animales extirparon los ganglios linfáticos colocando pinzas microquirúrgicas debajo del ganglio y luego levantándolos suavemente para separarlos del tejido circundante. Después de extirpar el tejido, transfiera los ganglios linfáticos a una malla metálica estéril colocada dentro de una placa de Petri de vidrio estéril que contenga aproximadamente 10 mililitros de solución salina equilibrada de Hank. Para aislar las células linfoides, consulte el protocolo escrito.

Las fracciones celulares del líquido de lavado vaginal de ratones inoculados al menos cuatro días antes generalmente consisten en células epiteliales de Candida e infiltrados celulares, como se muestra aquí mediante microscopía en fresco. Candida puede identificarse por la presencia de hifas así como de levaduras. Aquí se tiñen preparaciones en frotis del líquido de lavado vaginal.

Uso de la técnica de frotis de Papanicolaou para examinar las células epiteliales y los leucocitos infiltrantes, cuyas células principales son los neutrófilos, identificables por sus núcleos en lobulillos traslúcidos. Se detectan muy pocos neutrófilos, si es que hay alguno, en ratones no inoculados. Esta figura muestra un ejemplo de carga fúngica vaginal.

Se recoge el líquido de lavado vaginal en puntos temporales específicos y se cultiva para la enumeración de UFC. En este ejemplo, el líquido se recogió el día cinco posterior a la inoculación, se diluyó en serie, se sembró en placas y se incubó durante 48 horas. Luego se cuentan las colonias y se calcula la carga fúngica vaginal. La colonización o infección vaginal con Candida persiste durante semanas en ratones inoculados tratados con estrógeno.

Aunque Candida no logra establecer colonización vaginal en ratones inoculados sin tratamiento con estrógeno, los ratones tratados con estrógeno pero no inoculados permanecen negativos para Candida durante todo el período. Además, las lavados vaginales pueden realizarse una sola vez en ratones diferentes en cada punto temporal o de forma longitudinal en los mismos ratones bajo anestesia. Al realizar este procedimiento, es importante recordar restringir firmemente a los animales para evitar traumatismos en la vagina, y tómese el tiempo necesario para realizar un lavado completo y obtener una carga fúngica vaginal precisa al extraer los tejidos vaginales.

Utilice PBS estático para evitar que se deshidraten, y tenga cuidado de no dañar las venas y arterias principales al extraer los ganglios linfáticos y al procesar las células de los ganglios linfáticos; manténgalos en hielo o a cuatro grados para preservar la viabilidad celular. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo emplear el modelo experimental de ratón de candidiasis vaginal para cuantificar de manera reproducible la carga fúngica vaginal y extraer tejidos vaginales o linfoides para ensayos inmunológicos o histológicos específicos.