Dos tipos de ensayos para la detección de espermatozoides quimioatracción rana

Aquí se describen dos métodos diferentes para evaluar la quimiotaxis espermática en el ensayo de dos cámaras. Primero, se dispensan espermatozoides de rana activados en insertos con fondos de membrana porosa colocados en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Luego, una vez que los espermatozoides están en su lugar, se añade cuidadosamente un quimioatractivo al fondo del pocillo para iniciar un gradiente quimiotáctico.

A continuación, los espermatozoides se incuban para permitir que las células tengan tiempo de atravesar la membrana porosa en respuesta al gradiente quimiotáctico. Finalmente, se retira el inserto y se cuentan los espermatozoides que han migrado hacia el fondo del pocillo en el ensayo de dos cámaras mediante un hemocitómetro. En última instancia, la actividad de los quimioatractivos para espermatozoides puede compararse y cuantificarse, por ejemplo, mediante un análisis de curva de respuesta a la dosis para el ensayo de seguimiento en cámara Zigman.

Primero se aplica un cubreobjetos a la cámara zigman con aceite de silicona y se coloca boca abajo sobre la abertura circular de un microscopio. Luego, un lado de la trth de la cámara se llena con espermatozoides de rana activados. A continuación, el otro lado de la trth se llena con la solución de quimioatractivo.

Después de cinco minutos, se forma el gradiente quimiotáctico y, en ese momento, se puede grabar en video a los espermatozoides nadando a lo largo del gradiente. En última instancia, las imágenes obtenidas del ensayo de rastreo en la cámara de Zigmund se pueden analizar para determinar la velocidad de los espermatozoides y los patrones quimécinéticos, así como las trayectorias del desplazamiento espermático en respuesta a un gradiente de quimioatractivo. Estos dos métodos para detectar la quimiotaxis espermática son complementarios y producen tipos diferentes de datos.

El ensayo de dos cámaras permite que los espermatozoides atraviesen una membrana porosa, lo que posibilita la cuantificación de la respuesta de los espermatozoides a un quimioatractivo. La demostración visual del ensayo de dos cámaras es fundamental porque los pasos iniciales de adición de espermatozoides y quimioatractivo, así como los pasos finales de eliminación de los espermatozoides y de los insertos, requieren una precisión exacta en la manipulación de la micropipeta. El ensayo con cámara de Zigmond utiliza video para registrar el movimiento de los espermatozoides en un gradiente quimiotáctico.

Esto permite la determinación de parámetros dinámicos como la velocidad y la dirección. La principal ventaja del ensayo de seguimiento en la cámara de Zigmund frente al ensayo de dos cámaras es que se puede visualizar y analizar la natación de los espermatozoides mediante una serie de parámetros dinámicos. Lave los espermatozoides de un testículo de rana perforando agujeros en un extremo e inyectando tampón con una jeringa y aguja en el extremo opuesto.

Después de extraer los espermatozoides de los testículos de la rana, estime el número de células recolectadas mediante hemocitometría. Luego, diluya la suspensión de espermatozoides con tampón ringer de ovocito para obtener una densidad de espermatozoides de dos veces 10 a la siete células por mililitro. Evalúe la motilidad de los espermatozoides diluyendo cinco microlitros de esperma uno a 10 con tampón F1 y visualizando el movimiento mediante óptica de contraste de fases.

A continuación, pipetee 700 microlitros de tampón F1 en cada pocillo de una placa de cultivo celular de plástico de 24 pocillos. Luego, diluya 100 microlitros de la suspensión de espermatozoides con 900 microlitros de tampón F1 a temperatura ambiente en un tubo pequeño para centrífuga para activar la motilidad espermática mediante choque osmótico por cada ensayo que se realice. Coloque un inserto de 12 milímetros de diámetro externo y porosidad de 12 micrómetros en un pocillo lleno de tampón, asegurándose de que el inserto quede colocado de forma excéntrica, dejando un espacio a un lado.

Luego, utilizando una micropipeta con punta cortada, transfiera inmediatamente 400 microlitros de espermatozoides con motilidad activada al pocillo; aplique la suspensión de espermatozoides sobre la pared del inserto, permitiendo que escurra hacia el filtro ubicado en la base del inserto. A continuación, pipetee cuidadosamente 50 microlitros del agente quimioatractivo en cada pocillo de la placa, en el espacio entre el pocillo y el inserto descentrado.

Teniendo cuidado de depositar la gota en el punto donde se encuentran la pared lateral y el fondo del pocillo. Retire la pipeta sin perturbar el sistema. Después de haber preparado todos los ensayos.

Deje la placa a temperatura ambiente hasta que el primer ensayo iniciado haya incubado durante 50 minutos. Luego, primero, sostenga cuidadosamente el inserto con una mano. Detenga el ensayo eliminando la mayor parte o toda la suspensión de espermatozoides de la cámara superior mediante una micropipeta.

Una vez que el esperma se haya transferido desde la cámara superior, retire inmediatamente el inserto y deséchelo. Ahora mezcle las suspensiones de esperma en cada pocillo para resuspender cualquier esperma que se haya sedimentado en el fondo. A continuación, transfiera toda la suspensión de esperma de cada pocillo a tubos individuales de microcentrífuga.

Añada formaldehído hasta una concentración final de 0,5 % volumen por volumen. Pelote los espermatozoides fijados en cada tubo. Gire en una microcentrífuga personal utilizando el botón de pulsación de diez segundos.

Luego, retire todo el sobrenadante excepto 100 microlitros de cada tubo y resuspenda el precipitado en ese volumen. A continuación, diluya 20 microlitros de la suspensión de espermatozoides, uno a 10 con agua destilada, y cuente los espermatozoides en un hemocitómetro. Utilizando el objetivo de 40 x de un microscopio invertido, el ensayo con dos cámaras proporciona resultados cuantitativos apropiados para estudios de respuesta a dosis o para comparaciones entre atrayentes.

Por ejemplo, el agua de huevo de rana contiene el quimioatractante espermático alluring, como se muestra con los símbolos rojos. El agua de huevo produce un aumento y luego una disminución en el número de espermatozoides que cruzan la membrana porosa a medida que se incrementa la dosis del quimioatractante espermático. En contraste, la albúmina sérica bovina, representada por los símbolos blancos, tiene poco efecto en el mismo rango de dosis.

Antes de comenzar el ensayo en la cámara de zigman, primero confirme que la estación de trabajo del microscopio invertido esté preparada para la grabación de video. Configure el microscopio. Inicie el software de control de la cámara para adquirir siete cuadros por segundo.

Verifique que la cámara esté enfocada en la plataforma de observación y que la salida se esté enviando al monitor del ordenador. A continuación, compruebe que el campo microscópico incluya la mayor parte o la totalidad del ancho de la plataforma de observación. Luego prepare una suspensión de espermatozoides de rana en tampón oocyte ringer's y un quimioatractivo diluido a la concentración adecuada con tampón F1, y almacene ambos en hielo hasta su uso.

Luego, comenzando con una cámara de Zigmund limpia y seca. Utilice una micropipeta para colocar una línea de aproximadamente cuatro microlitros de aceite de silicona, a unos cinco milímetros de distancia y paralela al borde exterior de cada trth. A continuación, coloque un cubreobjetos de 22 por 40 milímetros sobre la cámara, permitiendo que el aceite de silicona se extienda uniformemente hasta el borde exterior de cada trth.

Ahora invierta la cámara y colóquela sobre el orificio circular grande en la platina del microscopio. Teniendo cuidado de que el cubreobjetos no haga contacto con la platina, active 20 microlitros del esperma xap en tampón ringer de ovocito mezclando uno a 10 con tampón F1 a temperatura ambiente. Usando una micropipeta con la punta cortada, aspire inmediatamente 70 microlitros del esperma con motilidad activada.

Luego, sostenga la micropipeta en un ángulo bajo y coloque la punta en la abertura lateral. Llene el trth y el puente por acción capilar. A continuación, llene el trth opuesto de la misma manera utilizando una solución quimioatractiva, ya que los espermatozoides xap tienen una vida útil de motilidad limitada.

Comience a grabar en un plazo de tres minutos y continúe durante cinco minutos. El ensayo de rastreo en la cámara zigman permite la microscopía de video de espermatozoides nadando en un gradiente de quimioatractivo. Esta película muestra una grabación de espermatozoides nadando en la plataforma de observación, con sus trayectorias trazadas en rojo como se muestra en este diagrama.

Las trayectorias del esperma constan de segmentos, cada uno indicado con una flecha que representa el desplazamiento del espermatozoide entre cuadros sucesivos de la película. Los segmentos de la trayectoria trazan el comportamiento natatorio de espermatozoides individuales y resaltan patrones como círculos y giros. A partir de estos datos, se puede determinar la velocidad y la dirección de cada segmento o las propiedades de todos los segmentos en una trayectoria o en un grupo de trayectorias.

Por ejemplo, la distancia lineal neta. El vector que une el inicio de una trayectoria con su extremo final tiene una componente en el eje x y forma un ángulo theta con respecto al eje x, como se representa aquí en rojo. El ángulo theta debería disminuir y el desplazamiento a lo largo del eje x debería aumentar cuando esté presente un gradiente de quimioatractante. Estos cambios indican que los espermatozoides muestran preferencia por nadar en sentido ascendente a lo largo del gradiente, hacia el quimioatractante trth. Al realizar ambos ensayos, es importante tener presente que prestar atención a la carga adecuada de espermatozoides y quimioatractante en cada dispositivo es fundamental para obtener gradientes quimiotácticos reproducibles y un buen desempeño espermático.