Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión
23 de enero de 2012
La levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, Es un sistema de buen modelo para estudiar los procesos celulares básicos. Aquí se describe un método para realizar el análisis cuantitativo de células vivas de levadura de fisión. En este experimento en particular nos centramos en la organización del genoma en el núcleo de la célula, pero el método también puede utilizarse para estudiar los factores citosólica.
El objetivo general del siguiente experimento es medir cuantitativamente la organización subnuclear en células de levadura y cómo se ve afectada por cambios en las condiciones de crecimiento o por mutaciones. Esto se logra cultivando células de levadura hasta la fase logarítmica en condiciones que minimicen la autofluorescencia. A continuación, las células se colocan en una cámara de crecimiento para su observación bajo el microscopio.
Luego se toman imágenes para medir la distancia entre diferentes estructuras marcadas con fluorescencia en la célula. Se obtienen resultados que muestran diferencias en la organización no nuclear, que dependen de los cambios en las condiciones nutricionales durante el crecimiento del cultivo de levadura. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética sobre la interacción entre la organización subnuclear o la cromatina y la regulación génica.
Los peces y las levaduras comienzan preparando el medio mínimo de Edimburgo, o EMM, y EMM con cloruro de amonio para reducir la autofluorescencia en lugar de autoclavar. Use un filtro de 0,2 micrones para esterilizar la solución de glucosa y añádala al medio autoclavado. Inocule tres mililitros de EMM en tubos de 30 mililitros con células de peces y levaduras.
Crecidas recientemente en una placa de agar en medio rico, YEA tape ligeramente los tubos e incube las células en un agitador a 225 RPM y 30 grados Celsius. Mantenga las células en fase logarítmica durante dos días contándolas con una cámara de birka cada mañana y tarde y diluyéndolas a la densidad adecuada. El día del experimento.
Las células deben estar en fase logarítmica temprana respecto al nitrógeno. Las células deben seguir el procedimiento descrito en el protocolo escrito para recogerlas en un solo pellet en el fondo de un tubo mediante centrifugación, 1,5 mililitros de células en un tubo eppendorf, a un máximo de 1,5 RCF, girando primero el tubo durante dos minutos y luego girándolo 180 grados para una centrifugación adicional de dos minutos. Retire todo el sobrenadante excepto de 10 a 15 microlitros y resuspenda las células en el medio restante, junto con un alícuota de lectina filtrada y esterilizada de un miligramo por mililitro.
Añada cinco microlitros de solución de lectina a la esquina del cubreobjetos y agregue cinco microlitros de cultivo a la gota de lectina. Para crear una cámara de crecimiento de células de base S pom, pipetee cinco microlitros de EMM sobre un portaobjetos limpio e invierta el cubreobjetos con el cultivo a un ángulo de 70 grados sobre el medio y déjelo caer hacia abajo sobre el EMM para sellar los bordes con grasa de silicona. Corte el extremo ancho de una punta de 200 microlitros y conecte el extremo estrecho a una jeringa de dos mililitros.
Llene la jeringa con aproximadamente un mililitro de grasa de silicona. Aplique una línea fina de silicona a los bordes del cubreobjetos presionando suavemente el émbolo de la jeringa para imaginar la cámara de crecimiento. Comience utilizando la imagen en campo claro para localizar las células y cavar.
Obtenga una imagen nítida para microscopía confocal. Utilizamos un microscopio de barrido láser Zeiss LSM 700 con un objetivo acoplado plan-apocromático de 63 aumentos con aceite y un ajuste de escaneo promedio de 16 líneas. Establezca las unidades de área de uno a 1,1 para obtener una sección óptica de 0,8 micrómetros.
Escanea las células con láseres que detectan Alexa 488 y mCherry o GFP. Registra suficientes imágenes para tomar mediciones en 60 células por cada condición. Cambia a una nueva cámara de crecimiento con células frescas.
Después de 60 minutos de adquisición de imágenes, abra una imagen en el programa Zeen Light Edition para medir la distancia entre las señales de diferentes fluoróforos en el mismo plano focal. Abra la herramienta de mediciones y ajuste la intensidad de luz y el contraste para identificar el centro de cada señal fluorescente, por ejemplo, el cuerpo del polo del huso y la membrana nuclear, y mida la distancia entre ellos. Transfiera los datos a una hoja de notas.
Compare las distancias subcelulares medias o medianas entre diferentes cepas y tratamientos utilizando software estadístico o pruebas como la prueba T o la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. En este ejemplo, la cepa PJ 1 18 5 se cultivó en EMM y una muestra se colocó en una cámara de crecimiento para su observación mediante imágenes. Luego, una alícuota de PJ 1 18 5.
El cultivo se transfirió a EMMN e incubó durante 15 minutos antes de colocar una muestra en una cámara de crecimiento para la obtención de imágenes. Se utilizó una herramienta de medición para determinar la distancia entre el locus y el cuerpo del polo del huso, así como entre el locus y la membrana nuclear. Como se muestra aquí, hubo una diferencia estadísticamente significativa en la distancia que recorrió el grupo génico al desplazarse desde la membrana nuclear hacia el cuerpo del polo del huso en las células privadas de nitrógeno en comparación con las células cultivadas en presencia de nitrógeno.
Los datos que miden la distancia entre la GFP y la SBP presentaban una distribución normal, y por lo tanto las distancias medias pudieron compararse mediante una prueba T. Hubo una diferencia significativa entre los dos valores medios. Los datos que miden la distancia entre la GFP y la NM no presentaban una distribución normal, y por lo tanto las distancias medianas se compararon mediante una prueba de sumas de rangos de Mann-Whitney.
Hubo una diferencia significativa entre los dos valores medianos siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la PCR en tiempo real, para responder preguntas adicionales sobre cómo el nivel de expresión génica se correlaciona con los cambios en la organización subnuclear.
Resumen
Este estudio presenta un método para el análisis cuantitativo de células vivas de la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, centrándose en la organización del genoma dentro del núcleo celular. El método permite a los investigadores estudiar cómo la organización subnuclear se ve influenciada por las condiciones de crecimiento y las mutaciones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Genética
- Microbiología
Antecedentes
- Schizosaccharomyces pombe sirve como organismo modelo para estudiar procesos celulares.
- Comprender la organización del genoma es crucial para obtener conocimientos sobre la regulación génica.
- Las técnicas de imagen en células vivas pueden revelar estructuras celulares dinámicas.
- Los cambios en las condiciones de crecimiento pueden afectar la organización celular.
Objetivo del estudio
- Medir cuantitativamente la organización subnuclear en células de levadura.
- Evaluar el impacto de las condiciones nutricionales y de las mutaciones sobre la organización del genoma.
- Proporcionar un método para estudiar la dinámica de la cromatina y la regulación génica.
Métodos Utilizados
- Las células de levadura se cultivan en medio mínimo hasta la fase logarítmica.
- Las células se preparan para la obtención de imágenes utilizando una cámara de crecimiento y microscopía confocal.
- Se obtienen imágenes de estructuras marcadas con fluorescencia para medir las distancias entre ellas.
- Se realiza un análisis estadístico para comparar las distancias en diferentes condiciones.
Resultados principales
- Se observaron diferencias significativas en la organización subnuclear bajo condiciones de crecimiento variables.
- Las mediciones de distancia entre las señales fluorescentes indicaron cambios en la posición de la cromatina.
- Las pruebas estadísticas confirmaron la significancia de las diferencias observadas.
- El método proporciona información sobre la relación entre la organización subnuclear y la expresión génica.
Conclusiones
- El método desarrollado es eficaz para estudiar la organización del genoma en la levadura de fisión.
- Los resultados destacan la influencia de los factores ambientales en la dinámica de la cromatina.
- Este enfoque puede aplicarse para investigar más a fondo los mecanismos de regulación génica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía de fluorescencia cuantitativa en células vivas en la levadura de fisión permite la medición precisa de la organización subnuclear y su respuesta dinámica a los cambios ambientales. Esta capacidad es fundamental para reducir los riesgos de las hipótesis iniciales sobre la arquitectura de la cromatina y la regulación génica. El método respalda la confianza predictiva en la validación de objetivos e informa las decisiones de cartera en la intersección entre biología celular y genómica funcional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la organización de la cromatina y su impacto en la regulación génica bajo condiciones definidas.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la cuantificación de la dinámica espacial del genoma en respuesta a perturbaciones.
- Proporciona una desvinculación mecanicista de riesgos para hipótesis que relacionan la arquitectura nuclear con cambios en la expresión génica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece sistemas validados de imagen en células vivas para la medición reproducible de distancias subcelulares.
- Facilita la estandarización de ensayos mediante resultados cuantitativos y analizables estadísticamente.
- Permite la detección de modificadores genéticos o ambientales que afectan la organización nuclear.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Correlaciona los cambios en la localización subnuclear con eventos de inducción génica relevantes para modelos de enfermedades.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al vincular la dinámica de la cromatina con lecturas funcionales.
- Ofrece una desestimación predictiva para el desarrollo de biomarcadores traslacionales cuando se implica la posición de la cromatina.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de imagen cuantitativa se integra en el continuo del descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta la validación de modelos preclínicos, apoyando tanto estudios mecanicistas como investigaciones traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Permite probar hipótesis sobre las relaciones entre la organización de la cromatina y la regulación génica.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para comparar condiciones genéticas o ambientales.
- Análisis: Ofrece mediciones estadísticamente robustas (distancias medias y medianas) para el análisis entre condiciones.
- Investigación Traslacional: Conecta los cambios en la arquitectura nuclear con la inducción génica relevante para la modelización de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para imágenes de células vivas y análisis cuantitativo en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de regulación génica.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imagenología en células vivas y garantiza la reproducibilidad de los resultados cuantitativos.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos al proporcionar datos sólidos sobre la dinámica de la cromatina y las relaciones de expresión génica.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas y vías basándose en datos cuantitativos de la organización nuclear.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes de células vivas, microscopía de fluorescencia y análisis cuantitativo de imágenes.
- Exige acceso a microscopía confocal y software analítico compatible para mediciones de distancia.
- Necesita estandarización entre equipos de los protocolos de imagen y métodos de análisis estadístico.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes cepas de levadura o sistemas modelo con fondos genéticos variables.
- Las limitaciones prácticas incluyen el manejo de la autofluorescencia y garantizar un tamaño de muestra suficiente para obtener potencia estadística.
