Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

El objetivo general del siguiente experimento es medir cuantitativamente la organización subnuclear en las células de levadura y cómo se ve afectada por los cambios en las condiciones de crecimiento o las mutaciones. Esto se logra mediante el crecimiento de células de levadura para registrar la fase en condiciones que minimizarán la autofluorescencia. A continuación, las células se colocan en una cámara de crecimiento para verlas bajo el microscopio.

A continuación, se toman imágenes para medir la distancia entre las diferentes estructuras marcadas con fluorescencia en la célula. Se obtienen resultados que muestran diferencias en la organización no nuclear, la cual depende del cambio de las condiciones nutricionales durante el crecimiento del cultivo de levaduras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de epie sobre la interacción entre la organización subar o la cromatina y la regulación génica.

El pescado y la levadura Toul comienzan preparando el medio mínimo de Edimburgo o EMM y EMM con también cloruro de amonio para reducir la autofluorescencia en lugar del autoclave. Utilice un filtro de 0,2 micras para esterilizar la solución de glucosa y añádala a los medios del autoclave. Inocular tres mililitros de EMM en tubos de 30 mililitros con células de pescado y levadura.

Recién cultivado en una placa de agar en el medio rico, YEA tapa ligeramente los tubos e incuba las células en un agitador a 225 RPM y 30 grados Celsius. Mantenga las células en fase logarítmica durante dos días contándolas con una cámara birka cada mañana y noche y diluyéndolas hasta la densidad adecuada. El día del experimento.

Las celdas deben ser una fase logarítmica temprana para el personal de nitrógeno. Las células se refieren al procedimiento descrito en el protocolo escrito para recoger las células en un pellet en el fondo de una centrífuga de tubo, 1,5 mililitros de células en un tubo de orph eend a un máximo de 1,5 RCF girando primero el tubo durante dos minutos, luego girándolo 180 grados durante dos minutos adicionales de centrifugado. Retire todos los microlitros del sobrenadante, excepto de 10 a 15, y vuelva a suspender las células en el medio restante, aunque una alícuota de un miligramo por mililitro filtre la lectina esterilizada.

Agregue cinco microlitros de solución de lectina a la esquina del cubreobjetos y agregue cinco microlitros de cultivo a la gota de lectina. Para crear una cámara de crecimiento de células base de pom S, pipetee cinco microlitros de EMM en un portaobjetos limpio e invierta el cubreobjetos con el cultivo en un ángulo de 70 grados sobre el medio y déjelo caer de arriba hacia abajo sobre el EMM para sellar los bordes con grasa de silicona. Corta el extremo ancho de una punta de 200 microlitros y conecta el extremo estrecho a una jeringa de dos mililitros.

Llene la jeringa con aproximadamente un mililitro de grasa de silicona. Aplique una línea fina de silicona a los bordes del cubreobjetos empujando suavemente el pistón de la jeringa para obtener una imagen de la cámara de crecimiento. Comience por usar imágenes de campo claro para ubicar las celdas y excavar.

Obtenga una imagen nítida para la microscopía confocal. Utilizamos un microscopio de escaneo láser Zeiss LSM 700 con una lente de objetivo de aceite de cromático apoch plano de 63 veces y una configuración de escaneo plano promedio de 16 líneas. Establezca las unidades de área en uno a 1,1 para obtener un corte óptico de 0,8 micras.

Escanee las celdas con láseres que detectan Alexa 4, 88 y mCherry o GFP. Grabe suficientes imágenes para tomar medidas en 60 celdas para cada desagüe. Cambie a una nueva cámara de crecimiento con células frescas.

Después de 60 minutos de toma de imágenes, abra una imagen en el programa Zeen Light Edition para medir la distancia entre señales de diferentes fluoróforos en el mismo plano focal. Abra la herramienta de mediciones y ajuste la intensidad y el contraste de la luz para identificar el centro de cada señal fluorescente, por ejemplo, el cuerpo del polo del huso y la membrana nuclear, y mida la distancia entre ellos. Transfiera los datos a una hoja de bloc de notas.

Compare la media o la mediana de las distancias subcelulares entre diferentes cepas y tratamientos utilizando software estadístico o pruebas como la prueba T o la prueba de suma de Man Whitney Rank. En esta cepa de ejemplo, PJ 1 18 5 se cultivó en EMM y se colocó una muestra en una cámara de crecimiento para la obtención de imágenes. A continuación, una alícuota de PJ 1 18 5.

El cultivo se transfirió a EMMN y se incubó durante 15 minutos antes de que una muestra se colocara en una cámara de crecimiento para la obtención de imágenes. La herramienta de medición se utilizó para medir la distancia entre el locus y el cuerpo del polo del huso, así como entre el locus y la membrana nuclear. Como se muestra aquí, hubo una diferencia estadísticamente significativa en la distancia del grupo de genes que se alejó de la membrana nuclear hacia el cuerpo del polo del huso en las células hambrientas de nitrógeno en comparación con las células cultivadas en nitrógeno.

Los datos que midieron la distancia entre la GFP y la PAS tenían una distribución normal, por lo que las distancias medias pudieron compararse mediante una prueba T. Hubo una diferencia significativa entre los dos valores medios. Los datos que midieron la distancia entre la GFP y la NM no tenían una distribución normal, por lo que las distancias medias se compararon mediante una prueba de suma clasificada por el hombre Whitney.

Hubo una diferencia significativa entre los dos valores medianos después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la PCR en tiempo real, para responder preguntas adicionales sobre cómo se correlaciona el nivel de expresión génica con los cambios en la organización subnuclear.