La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la expresión de proteínas activadas por mitógenos a nivel de una sola célula. Para ello, se generó una cepa de levadura portadora del indicador de expresión fluorescente Venus cuádruple controlada por el promotor STL one y específica para la activación de la quinasa mapa hog one. La expresión de proteínas fluorescentes se puede cuantificar mediante un ensayo de microscopía de células vivas en el que las células se estresan directamente en el microscopio para facilitar la aparición en tiempo real de la fluorescencia o mediante citometría de flujo, en cuyo caso las células se estresan en un microtubo y la síntesis de proteínas se bloquea en un momento dado.

Mediante la adición de cicloheide, solo se pueden analizar unas pocas células a la vez con microscopía de células vivas, pero el destino de las células individuales se puede observar directamente y correlacionar con otras propiedades celulares. Por otro lado, la citometría de flujo también permite la evaluación de la expresión de proteínas activadas por mitógenos en un gran número de células a la vez. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización, como qué proteínas están involucradas en la regulación de la expresión génica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la vía de la levadura, también se puede aplicar a otras cascadas de señalización dependiendo de la disponibilidad de la expresión adecuada. Reportero.

Para preparar las células para la microscopía de células vivas, comience inoculando cinco mililitros de medio sintético con levadura y luego cultive las células a 30 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, mida el DO 600 del cultivo durante la noche y luego diluya el cultivo durante la noche en cinco mililitros de medio sintético hasta un DO 600 de 0,05. Cultive el cultivo diluido a 30 grados centígrados durante al menos cuatro horas más.

A continuación, filtre unos 200 microlitros de solución conativa recién preparada en el portaobjetos. Pasados los 30 minutos, retira la solución y añade 150 microlitros de agua al pozo. Ahora retira el agua y deja que el pozo se seque mientras se preparan las celdas.

Vuelva a medir el OD 600 del cultivo celular y luego diluya las células para obtener 300 microlitros de cultivo celular a un DO 600 de 0,02 y un microtubo de 1,5 mililitros. Sonicar las células en un baño de agua durante 45 segundos. Agite brevemente los microtubos y luego sonique y vuelva a vórtice las células.

Ahora agregue 200 microlitros de las células al portaobjetos del pocillo, y luego, después de dejar que la célula se asiente en el fondo del pocillo durante unos 30 minutos, coloque el portaobjetos en el microscopio. A continuación, seleccione la configuración de iluminación para su canal fluorescente que se va a grabar y para dos imágenes de campo claro, ajustando una de las configuraciones de campo claro aproximadamente tres micras por debajo del plano focal para permitir una segmentación celular adecuada. A continuación, establezca los intervalos de tiempo para las mediciones de lapso de tiempo y seleccione los campos de visión para la obtención de imágenes.

Ahora inicie la adquisición durante unos pocos fotogramas y luego detenga la adquisición para agregar 100 microlitros de medio de cloruro de sodio de 0,6 molar recién preparado, y reanude la imagen para preparar las células para la medición por citometría de flujo. Comience inoculando la levadura en cinco mililitros de medio sintético y cultive las células durante la noche a 30 grados centígrados. A la mañana siguiente, mida el DO 600 del cultivo nocturno y luego diluya la suspensión celular en cinco mililitros de medio sintético hasta un DO 600 de 0,1.

Cultive el cultivo durante al menos cuatro horas a 30 grados centígrados para alcanzar un diámetro exterior de 600 de 0,2 a 0,4. A continuación, añada 100 microlitros de cloruro de sodio de 0,6 molares recién preparados a un microtubo de 1,5 mililitros por cada punto de tiempo que se medirá en el tiempo cero. Añadir 200 microlitros de células a cada microtubo e incubar los cultivos agitando a 30 grados centígrados.

Luego, en cada uno de los puntos de tiempo experimentales, agregue 30 microlitros de cicloheide recién preparado a uno de los microtubos. Mientras se incuban los microtubos, agregue 400 microlitros de PBS a un tubo de fax correspondiente para cada microtubo. Después de la incubación, vórtice brevemente los microtubos y luego sonique las células y agregue baño de agua durante un minuto como se acaba de demostrar.

A continuación, añada 100 microlitros de cultivo celular de cada microtubo a su correspondiente tubo de fax en el flujo del citómetro. Cargue los ajustes de excitación y detección adecuados y pruebe las muestras que no se expresan y las que se expresan completamente para verificar que se encuentran en el rango de sensibilidad del detector. Finalmente, midieron 10.000 células para cada muestra en estas imágenes, las células de levadura portadoras de la proteína venosa cuádruple reportera de expresión bajo el control del promotor TL uno y unidas al fondo de un portaobjetos de pocillo fueron estimuladas por edición directa de medio de estrés.

Como se acaba de demostrar, las células fueron monitoreadas durante aproximadamente dos horas a intervalos de 10 minutos, y se adquirieron imágenes tanto antes como después de la edición del estímulo. Nótese la expresión fluorescente del informe durante las células activadas. Para extraer la información cuantitativa contenida en estas imágenes, aquí se debe realizar un complejo proceso de análisis de imágenes.

Se muestran los resultados obtenidos con la plataforma de análisis de cuantitarios de levadura. Cada traza roja representa la evolución temporal de la intensidad media de fluorescencia de una sola célula. La línea azul ilustra la mediana de más de 500 células que se segmentaron y rastrearon a lo largo de 20 fotogramas de cinco películas de lapso de tiempo adquiridas desde cinco campos de visión diferentes desde el mismo pocillo, el área azul claro representa el percentil 25 y 75 de todas las intensidades medidas en un punto de tiempo dado, para estudiar la dinámica de la expresión del mismo reportero por citometría de flujo. Se añadió cicloheximida a la levadura cultivos celulares en diferentes puntos de tiempo a intervalos de cinco a 10 minutos.

El fármaco bloquea la síntesis de nuevas proteínas, pero la maduración de la proteína fluorescente ya expresada no se ve perturbada. Por lo tanto, la expresión de la proteína visualizada por el desplazamiento del histograma hacia la derecha se puede cuantificar en el momento de la edición de Cycl H sorteando los problemas asociados con la maduración de la proteína fluorescente. En este gráfico, se compara la dinámica del indicador de expresión medido por microscopía o citometría de flujo mientras que la señal fluorescente se eleva de 30 a 40 minutos después de la edición del medio de estrés medido por la microscopía, las mediciones de citometría de flujo indican claramente que las proteínas ya se producen entre 10 a 15 minutos después del estímulo demostrando la lenta maduración de las proteínas fluorescentes.

Ambas técnicas permiten acceder a información de una sola célula para estos sencillos experimentos, la variabilidad entre tres réplicas biológicas es pequeña en comparación con la gran variabilidad observada en las respuestas de una sola célula por microscopía o citometría de flujo. Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos, como las mediciones de respuesta, para responder a preguntas adicionales como, por ejemplo, cuál es el umbral para la expresión génica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la expresión de proteínas a nivel de una sola célula con el microscopio de citometría de flujo.