Name: La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprende a cuantificar la expresión de MAPK en células individuales de levadura mediante microscopía de células vivas y citometría de flujo. Este método permite analizar la dinámica de la expresión génica en tiempo real.

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Los autores agradecen a Matthias Peter y su grupo en el Instituto de Bioquímica de la ETH en Zürich, donde se han desarrollado estos métodos. Este trabajo ha sido financiado por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza.

1. Medidas de Microscopía <ol><li> Inocular 5 ml de medio sintético con levadura. </li><li> Se cultivan las células a 30 º C durante la noche. </li><li> Mida la OD 600 de la cultura de la noche a la mañana siguiente. </li><li> Diluir la cultura durante la noche en 5 ml de medio sintético a OD 600 0.05. </li><li> Mantener el cultivo diluido a 30 ° C durante al menos 4 horas. </li><li> Preparar 3 veces concentrado (0,6 M) una solución de NaCl en medio sintético. </li><li> Preparar una solución de 1 mg / ml de Concanavalina A (ConA) en PBS. </li><li> Filtrado ~ 200 l de solución de ConA en la diapositiva también. </li><li> Deje reposar durante 30 min. </li><li> Retire la solución ConA. </li><li> Añadir 150 l de H 2 O al pozo. </li><li> Retire H 2 O. </li><li> Mida OD 600 de cultivo celular. </li><li> Preparar 300 l de cultivo celular a OD 600 = 0,02 en un microtubo de 1.5 ml. </li><li> Sonicar las células en un baño de agua durante 45 segundos. </li><li> Vortex brevemente la microtube. </li><li> Sonicar las células en un baño de agua durante 45 segundos. </li><li> Vortex brevemente el microtubo. </li><li> Añadir 200 l de cultivo celular para el pozo. </li><li> Espere 30 minutos para dejar que las células se depositan en el fondo del pozo. </li><li> Situar el porta bien en el microscopio. </li><li> Seleccione los ajustes de iluminación para el canal de fluorescencia a grabar. </li><li> Seleccionar los ajustes de iluminación para dos imágenes de campo claro (uno ligeramente fuera de foco: 3 micras por debajo del plano focal para permitir una segmentación adecuada de las células). </li><li> Seleccione los intervalos de tiempo para la medición del tiempo-lapso </li><li> Seleccione los campos de visión de la imagen. </li><li> Iniciar la adquisición de una serie de imágenes. </li><li> Pausa la adquisición de añadir los 100 l de 0,6 M NaCl medio. </li><li> Reanudar la proyección de imagen. </li></ol> 2. Citometría de Flujo Medidas <ol><li> Inocular 5 ml de medio sintético con levadura. </li><li> Haga crecer a 30 º C durante la noche. </li><li> Medidael OD 600 de la cultura de la noche a la mañana siguiente. </li><li> Diluir la cultura durante la noche en 5 ml de medio sintético a OD 600 0.1. </li><li> Crece a 30 ° C durante al menos 4 horas para llegar a un OD 600 de 0,2 a 0,4. </li><li> Preparar la solución de cicloheximida 1 mg / ml en H 2 O. </li><li> Preparar 3 veces concentrado (0,6 M) una solución de NaCl en medio sintético. </li><li> Preparar un microtubo de 1,5 ml con 100 l de 0,6 M NaCl medio para cada punto de tiempo para ser medidos. </li><li> En el tiempo 0, añadir 200 l de cultivo celular a cada microtubo. </li><li> Incubar con agitación a 30 ° C. </li><li> En el momento T, añadir 30 l de cicloheximida a un microtubo. </li><li> Repita paso 2,11 para todos los puntos de tiempo deseados. </li><li> Incubar todos los microtubos durante al menos 45 min y hasta 3 horas a 30 º C con agitación. </li><li> Preparar tubos de FACS con 400 l de PBS. </li><li> Sonicar las células en baño de agua durante 1 min. </li><li> Vortex brevemente los microtubos. </li><li> Hijoicar las células en baño de agua durante 1 min. </li><li> Vortex brevemente los microtubos. </li><li> Añadir 100 l de cultivo celular de cada microtubo a su correspondiente tubo de FACS. </li><li> Seleccione el láser de excitación 488 nm y 530/30 nm de paso de banda de filtro para la detección. </li><li> Prueba de que no expresa y expresar plenamente la muestra para verificar si se caen en el rango de sensibilidad del detector. </li><li> Medir 10.000 células para cada muestra adquirida. </li></ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Microscopía El tratamiento del pozo con ConA es un paso esencial para asegurar una imagen adecuada de las células. Debido a ConA tiene baja solubilidad en PBS (5 mg / ml), el proceso de filtración permite la eliminación de grandes agregados que están presentes en la solución sin filtrar y interfieren con la formación de imágenes. Las células se adhieren relativamente fuerte a la superficie tratada y la adición de la solución de la inducción no deben perturbar la localización de las células, lo ...

La señalización a través de cascadas de transducción menudo culmina en la expresión de proteínas. La caracterización de este perfil de expresión es un elemento clave en la comprensión de la función de las vías biológicas. La identificación de espectro de hasta reguladas proteínas y la dinámica de su activación se puede lograr mediante diversas técnicas como la micro-arrays, transferencias Northern o transferencias Western 1-3. Sin embargo, estas técnicas promedio de la respuesta de toda una población de células. Para entender la regulación fina de la expresión de proteínas, es deseable para reunir mediciones en el nivel de células individuales. Lo ideal sería que estas medidas también deben proporcionar datos cuantitativos susceptibles de desarrollar modelos matemáticos de la vía subyacente. Microscopía y citometría de flujo son dos técnicas, que son ideales para ofrecer este tipo de mediciones cuantitativas de células individuales. El etiquetado endógena de proteínas con una proteína fluorescente puede be utilizado para cuantificar su nivel de expresión 4. Sin embargo, ya que la adición de un resto fluorescente grande en la parte terminal de la proteína puede hacer que no sea funcional, a menudo es más deseable generar reporteros de expresión específicos basados ​​en un promotor que dirige la expresión de una construcción fluorescente. Esta proteína indicadora es exógeno al sistema celular y por lo tanto no influye en los eventos de señalización que están teniendo lugar en la célula. Tanto la microscopía y citometría de flujo han sido ampliamente utilizados en el campo de la señalización de la levadura. Como ejemplos, los compañeros de trabajo-Colman Lerner y correlacionados, en celdas individuales, la expresión de apareamiento periodistas específicos y constitutivamente expresadas por microscopía de cuantificar el ruido en el apareamiento de levadura de transducción de señales en cascada 5, Acar y sus colegas utilizaron citometría de flujo para el estudio de la red de regulación el control de la expresión de los genes GAL 6. En un estudio anterior 7, hemos utilizado un combinatien una de estas dos técnicas para estudiar la salida de la expresión de la alta osmolaridad de glicerol (HOG) y la vía de levadura en ciernes. Esta proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) es provocada por el estrés hiper-osmótica. Es el resultado de la activación de las MAPK Hog1, que se transloca al núcleo de la célula para inducir un programa transcripcional que resulta en la expresión de aproximadamente 300 genes. Para estudiar este proceso, habíamos diseñado un reportero de expresión basado en el promotor STL1 (un gen inducido específicamente en respuesta a la actividad Hog1 8) que dirige la expresión de una proteína fluorescente Venus cuádruple (p STL1-qV). La citometría de flujo mediciones revelaron la presencia de dos poblaciones de células en el nivel de la tensión intermedia (NaCl 0,1 M) con sólo una fracción de la población que expresa el indicador fluorescente. Se utilizó microscopía de investigar más a fondo este comportamiento y descubrimos que este ruido en la expresión de proteínas se rige por factores intrínsecos 9. Nos COUld observan, además, que las células con un nivel similar de actividad Hog1 podrían mostrar resultados sorprendentemente diferentes de expresión. La combinación de estas dos técnicas nos ha permitido demostrar cómo la lenta remodelación de genes de respuesta al estrés influyó en el resultado de expresión a nivel de células individuales 7. En este trabajo, utilizamos la expresión de la p-STL1 qV reportero inducida por choque hiper-osmótica como un ejemplo de la cuantificación de la expresión de proteínas por microscopía y citometría de flujo. La misma cepa sometida a estrés 0,2 M de NaCl se estudió con ambas técnicas. Esto nos permitirá poner de relieve algunas diferencias clave en estas dos técnicas altamente complementarias.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivo</</td></tr><tr><td>levadura>fuerte Base de nitrógeno</td><td>paraMedio</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de aminoácidos CSM</td><td>ParaMedio</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-cuádrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - cuádruple V enus</td></tr><tr><td colspan="4">Material</fuerte></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Software de control de microscopio</td><td>Micro-manager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de incubación</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>Luz de fluorescencia fuente</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Baño de sonicador</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>corredera de 8 pocillos </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos</td><td>Matrical bioscience</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubo</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

la cuantificación temporal de la expresión de mapk inducida en células individuales de levadura

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

La cuantificación de la expresión génica a nivel de células individuales descubre nuevos mecanismos de regulación oscurecidas en las mediciones realizadas a nivel de población. Se presentan dos métodos basados ​​en la microscopía y citometría de flujo para demostrar cómo se pueden adquirir esos datos. La expresión de un indicador fluorescente inducida tras la activación de la alta osmolaridad MAPK vía de glicerol en la levadura se utiliza como un ejemplo. Se destacan las ventajas específicas de cada método. La citometría de flujo mide un gran número de células (10.000) y proporciona una medida directa de la dinámica de la expresión de la proteína independiente de la cinética lenta maduración de la proteína fluorescente. Obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía es por el contrario limitado a la medición de la forma madurado del reportero en un menor número de células. Sin embargo, los conjuntos de datos generados por esta técnica pueden ser extremadamente rico gracias a la combinación de varios periodistas ya la información espacial y temporalobtenido a partir de células individuales. La combinación de estos dos métodos de medición puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la regulación de la expresión de proteínas por las vías de señalización.

Microscopía Las células de levadura que llevan el reportero de la expresión de P-STL1 qV (ySP9 7) se adjunta a la parte inferior del pozo-portaobjetos y se coloca bajo el microscopio. Las células se estimularon mediante la adición de medio de estrés directamente en el pozo durante el curso de la sesión de formación de imágenes. Esto nos permite adquirir unas pocas imágenes de las células antes de la inducción vía y seguir su destino después de la estimulación. En el presente...

Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la expresión de proteína activada por mitógenos a nivel de célula individual. Para lograrlo, se generó una cepa de levadura que porta el reportero de expresión fluorescente Venus cuádruple, controlado por el promotor STL uno y específico para la activación de la quinasa MAP hog uno. La expresión de la proteína fluorescente puede cuantificarse mediante un ensayo de microscopía en células vivas, en el cual las células se someten a estrés directamente en el microscopio para facilitar la aparición en tiempo real de la fluorescencia, o mediante citometría de flujo, en cuyo caso las células se someten a estrés en un tubo micro y la síntesis de proteínas se bloquea en un momento determinado.Mediante la adición de cicloheida, solo se pueden analizar unas pocas células a la vez mediante microscopía de células vivas, pero se puede observar directamente el destino de las células individuales y correlacionarlo con otras propiedades celulares. La citometría de flujo, por otro lado, también permite evaluar la expresión de proteínas activadas por mitógenos en un gran número de células simultáneamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización, como qué proteínas participan en la regulación de la expresión génica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la vía de levadura, también se puede aplicar a otras cascadas de señalización dependiendo de la disponibilidad del reportero de expresión adecuado.Para preparar las células para microscopía de células vivas, comience por inocular cinco mililitros de medio sintético con levadura y luego cultive las células a 30 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, mida la DO 600 del cultivo nocturno y diluya el cultivo nocturno en cinco mililitros de medio sintético hasta una DO 600 de 0,05. Cultive el cultivo diluido a 30 grados Celsius durante al menos cuatro horas más.A continuación, filtre aproximadamente 200 microlitros de una solución recién preparada de con A en el portaobjetos con pocillo. Después de 30 minutos, retire la solución de con A y añada 150 microlitros de agua al pocillo. Ahora elimine el agua y deje secar el pocillo mientras se preparan las células.Mida nuevamente la DO 600 de la cultura celular y luego diluya las células para obtener 300 microlitros de cultivo celular con una DO 600 de 0,02 en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Somete las células a sonicación en un baño de agua durante 45 segundos. Vortexe brevemente los tubos microcentrífuga y luego repita la sonicación y el vortexado de las células.Ahora agregue 200 microlitros de las células a la cámara del portaobjetos y, tras dejar que las células sedimenten en el fondo de la cámara durante aproximadamente 30 minutos, coloque el portaobjetos en el microscopio. A continuación, seleccione los ajustes de iluminación para el canal fluorescente que se va a registrar y para dos imágenes de campo claro, ajustando uno de los ajustes de campo claro aproximadamente tres micrones por debajo del plano focal para permitir una segmentación adecuada de las células. Luego, establezca los intervalos de tiempo para las mediciones de lapso de tiempo y seleccione los campos de visión para la adquisición de imágenes.Ahora inicie la adquisición durante algunos fotogramas y luego pause la adquisición para añadir 100 microlitros de medio recién preparado de cloruro de sodio 0,6 molar, y reanude la adquisición de imágenes para preparar las células para su medición mediante citometría de flujo. Comience inoculando la levadura en cinco mililitros de medio sintético y cultive las células durante la noche a 30 grados Celsius. A la mañana siguiente, mida la DO 600 del cultivo nocturno y luego diluya la suspensión celular en cinco mililitros de medio sintético hasta una DO 600 de 0,1.Cultive la muestra durante al menos cuatro horas a 30 grados Celsius para alcanzar una DO 600 de 0,2 a 0,4. Luego, agregue 100 microlitros de cloruro de sodio 0,6 molar recién preparado a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros para cada punto temporal que se medirá en el tiempo cero. Añada 200 microlitros de células a cada tubo microcentrífugo e incube las culturas con agitación a 30 grados Celsius.Luego, en cada uno de los puntos temporales experimentales, agregue 30 microlitros de cicloheida recién preparada a uno de los tubos micro. Mientras los tubos micro están en incubación, agregue 400 microlitros de PBS a un tubo fax correspondiente por cada tubo micro. Después de la incubación, vortexe brevemente los tubos micro y luego sonique las células y añada baño de agua durante un minuto, tal como se acaba de demostrar.Luego, agregue 100 microlitros de cultivo celular de cada microtubo al tubo FACS correspondiente en el citómetro de flujo. Cargue los ajustes adecuados de excitación y detección y pruebe las muestras no expresoras y completamente expresoras para verificar que caigan dentro del rango de sensibilidad del detector. Finalmente, mida 10 000 células para cada muestra en estas imágenes; se estimularon células de levadura que portaban el reportero de expresión de proteína cuádruple venosa bajo el control del promotor TL1 y adheridas al fondo de un portaobjetos de pozo mediante la adición directa de medio de estrés.Como se acaba de demostrar, las células se monitorearon durante aproximadamente dos horas a intervalos de 10 minutos, y se adquirieron imágenes tanto antes como después de la aplicación del estímulo. Observe la expresión fluorescente del reportero en las células activadas. Para extraer la información cuantitativa contenida en estas imágenes, debe realizarse aquí un proceso complejo de análisis de imágenes.Se muestran los resultados obtenidos con la plataforma de análisis cuantitativo de levaduras. Cada traza roja representa la evolución temporal de la intensidad de fluorescencia promedio de una sola célula. La línea azul ilustra la mediana de más de 500 células que fueron segmentadas y rastreadas a lo largo de 20 cuadros de cinco películas de lapso de tiempo adquiridas de cinco campos de visión diferentes del mismo pocillo; el área celeste representa los percentiles 25 y 75 de todas las intensidades medidas en un punto temporal determinado. Para estudiar la dinámica de expresión del mismo reportero mediante citometría de flujo, se añadió cicloheximida a los cultivos de células de levadura en diferentes puntos temporales a intervalos de cinco a diez minutos.El fármaco bloquea la síntesis de nuevas proteínas, pero no interfiere con la maduración de la proteína fluorescente ya expresada. Por lo tanto, la expresión proteica visualizada mediante el desplazamiento del histograma hacia la derecha puede cuantificarse en el momento de la edición de Cycl H, evitando así los problemas asociados con la maduración de las proteínas fluorescentes. En este gráfico, se comparan las dinámicas del reportero de expresión medidas por microscopía o citometría de flujo; mientras que la señal fluorescente aumenta entre 30 y 40 minutos tras la adición del medio de estrés según la microscopía, las mediciones de citometría de flujo indican claramente que las proteínas ya se están produciendo entre 10 y 15 minutos después del estímulo, lo que demuestra la lenta maduración de las proteínas fluorescentes.Ambas técnicas permiten acceder a la información de célula individual para estos experimentos simples; la variabilidad entre tres réplicas biológicas es pequeña en comparación con la gran variabilidad observada en las respuestas de células individuales mediante microscopía o citometría de flujo. Tras seguir estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos como esas mediciones de respuesta para responder preguntas adicionales, tales como cuál es el umbral para la expresión génica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la expresión proteica a nivel de célula individual mediante microscopio o citometría de flujo.

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Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprende a cuantificar la expresión de MAPK en células individuales de levadura mediante microscopía de células vivas y citometría de flujo. Este método permite analizar la dinámica de la expresión génica en tiempo real.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

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