La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la expresión de proteína activada por mitógenos a nivel de célula individual. Para lograrlo, se generó una cepa de levadura que porta el reportero de expresión fluorescente Venus cuádruple, controlado por el promotor STL uno y específico para la activación de la quinasa MAP hog uno. La expresión de la proteína fluorescente puede cuantificarse mediante un ensayo de microscopía en células vivas, en el cual las células se someten a estrés directamente en el microscopio para facilitar la aparición en tiempo real de la fluorescencia, o mediante citometría de flujo, en cuyo caso las células se someten a estrés en un tubo micro y la síntesis de proteínas se bloquea en un momento determinado.

Mediante la adición de cicloheida, solo se pueden analizar unas pocas células a la vez mediante microscopía de células vivas, pero se puede observar directamente el destino de las células individuales y correlacionarlo con otras propiedades celulares. La citometría de flujo, por otro lado, también permite evaluar la expresión de proteínas activadas por mitógenos en un gran número de células simultáneamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización, como qué proteínas participan en la regulación de la expresión génica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la vía de levadura, también se puede aplicar a otras cascadas de señalización dependiendo de la disponibilidad del reportero de expresión adecuado.

Para preparar las células para microscopía de células vivas, comience por inocular cinco mililitros de medio sintético con levadura y luego cultive las células a 30 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, mida la DO 600 del cultivo nocturno y diluya el cultivo nocturno en cinco mililitros de medio sintético hasta una DO 600 de 0,05. Cultive el cultivo diluido a 30 grados Celsius durante al menos cuatro horas más.

A continuación, filtre aproximadamente 200 microlitros de una solución recién preparada de con A en el portaobjetos con pocillo. Después de 30 minutos, retire la solución de con A y añada 150 microlitros de agua al pocillo. Ahora elimine el agua y deje secar el pocillo mientras se preparan las células.

Mida nuevamente la DO 600 de la cultura celular y luego diluya las células para obtener 300 microlitros de cultivo celular con una DO 600 de 0,02 en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Somete las células a sonicación en un baño de agua durante 45 segundos. Vortexe brevemente los tubos microcentrífuga y luego repita la sonicación y el vortexado de las células.

Ahora agregue 200 microlitros de las células a la cámara del portaobjetos y, tras dejar que las células sedimenten en el fondo de la cámara durante aproximadamente 30 minutos, coloque el portaobjetos en el microscopio. A continuación, seleccione los ajustes de iluminación para el canal fluorescente que se va a registrar y para dos imágenes de campo claro, ajustando uno de los ajustes de campo claro aproximadamente tres micrones por debajo del plano focal para permitir una segmentación adecuada de las células. Luego, establezca los intervalos de tiempo para las mediciones de lapso de tiempo y seleccione los campos de visión para la adquisición de imágenes.

Ahora inicie la adquisición durante algunos fotogramas y luego pause la adquisición para añadir 100 microlitros de medio recién preparado de cloruro de sodio 0,6 molar, y reanude la adquisición de imágenes para preparar las células para su medición mediante citometría de flujo. Comience inoculando la levadura en cinco mililitros de medio sintético y cultive las células durante la noche a 30 grados Celsius. A la mañana siguiente, mida la DO 600 del cultivo nocturno y luego diluya la suspensión celular en cinco mililitros de medio sintético hasta una DO 600 de 0,1.

Cultive la muestra durante al menos cuatro horas a 30 grados Celsius para alcanzar una DO 600 de 0,2 a 0,4. Luego, agregue 100 microlitros de cloruro de sodio 0,6 molar recién preparado a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros para cada punto temporal que se medirá en el tiempo cero. Añada 200 microlitros de células a cada tubo microcentrífugo e incube las culturas con agitación a 30 grados Celsius.

Luego, en cada uno de los puntos temporales experimentales, agregue 30 microlitros de cicloheida recién preparada a uno de los tubos micro. Mientras los tubos micro están en incubación, agregue 400 microlitros de PBS a un tubo fax correspondiente por cada tubo micro. Después de la incubación, vortexe brevemente los tubos micro y luego sonique las células y añada baño de agua durante un minuto, tal como se acaba de demostrar.

Luego, agregue 100 microlitros de cultivo celular de cada microtubo al tubo FACS correspondiente en el citómetro de flujo. Cargue los ajustes adecuados de excitación y detección y pruebe las muestras no expresoras y completamente expresoras para verificar que caigan dentro del rango de sensibilidad del detector. Finalmente, mida 10 000 células para cada muestra en estas imágenes; se estimularon células de levadura que portaban el reportero de expresión de proteína cuádruple venosa bajo el control del promotor TL1 y adheridas al fondo de un portaobjetos de pozo mediante la adición directa de medio de estrés.

Como se acaba de demostrar, las células se monitorearon durante aproximadamente dos horas a intervalos de 10 minutos, y se adquirieron imágenes tanto antes como después de la aplicación del estímulo. Observe la expresión fluorescente del reportero en las células activadas. Para extraer la información cuantitativa contenida en estas imágenes, debe realizarse aquí un proceso complejo de análisis de imágenes.

Se muestran los resultados obtenidos con la plataforma de análisis cuantitativo de levaduras. Cada traza roja representa la evolución temporal de la intensidad de fluorescencia promedio de una sola célula. La línea azul ilustra la mediana de más de 500 células que fueron segmentadas y rastreadas a lo largo de 20 cuadros de cinco películas de lapso de tiempo adquiridas de cinco campos de visión diferentes del mismo pocillo; el área celeste representa los percentiles 25 y 75 de todas las intensidades medidas en un punto temporal determinado. Para estudiar la dinámica de expresión del mismo reportero mediante citometría de flujo, se añadió cicloheximida a los cultivos de células de levadura en diferentes puntos temporales a intervalos de cinco a diez minutos.

El fármaco bloquea la síntesis de nuevas proteínas, pero no interfiere con la maduración de la proteína fluorescente ya expresada. Por lo tanto, la expresión proteica visualizada mediante el desplazamiento del histograma hacia la derecha puede cuantificarse en el momento de la edición de Cycl H, evitando así los problemas asociados con la maduración de las proteínas fluorescentes. En este gráfico, se comparan las dinámicas del reportero de expresión medidas por microscopía o citometría de flujo; mientras que la señal fluorescente aumenta entre 30 y 40 minutos tras la adición del medio de estrés según la microscopía, las mediciones de citometría de flujo indican claramente que las proteínas ya se están produciendo entre 10 y 15 minutos después del estímulo, lo que demuestra la lenta maduración de las proteínas fluorescentes.

Ambas técnicas permiten acceder a la información de célula individual para estos experimentos simples; la variabilidad entre tres réplicas biológicas es pequeña en comparación con la gran variabilidad observada en las respuestas de células individuales mediante microscopía o citometría de flujo. Tras seguir estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos como esas mediciones de respuesta para responder preguntas adicionales, tales como cuál es el umbral para la expresión génica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la expresión proteica a nivel de célula individual mediante microscopio o citometría de flujo.