Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Aquí demostramos el protocolo para realizar microscopía de fluorescencia de molécula única en células bacterianas vivas para permitir la detección, seguimiento y cuantificación de complejos moleculares funcionales. Este protocolo comienza con el crecimiento de bacterias, que producen una proteína marcada a una molécula de tinte fluorescente. Después de cuatro a seis horas, se extrae un pequeño volumen de células del cultivo y sus filamentos de flagelos se truncan por cizallamiento.

Un cubreobjetos de vidrio dentro de una celda de flujo está recubierto para permitir que las celdas se adhieran a la superficie. Las células se inyectan en la celda de flujo y se unen a través de un trozo de gellar, que se observa en fluorescencia mediante microscopía de excitación láser. A continuación, una cámara de alta eficiencia cuántica graba las imágenes brillantes de campo claro y fluorescencia de los complejos moleculares marcados.

Hola, mi nombre es Ian Doy y estoy trabajando con Mark Lee en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Oxford. Soy Alex Robertson y trabajo con Mark Lee en el departamento de física. Soy Nick De, del laboratorio de fugas, también del departamento de física.

Hoy le mostraremos el procedimiento para visualizar complejos moleculares individuales en bacterias vivas utilizando microscopía de fluorescencia avanzada. Utilizamos este procedimiento para estudiar el to esto en un estado funcional. También lo estamos utilizando para investigar la dinámica en tiempo real de la máquina biológica natural y la escala de lentes nanométricas.

Así que comencemos. Para empezar, descongele 50 microlitros de tallos congelados de la bacteria E. coli. Estos han sido modificados genéticamente.

Para marcar una proteína con una molécula de colorante fluorescente, inocule cinco mililitros de medio de crecimiento LB y cultive las bacterias agitándolas aeróbicamente durante la noche a 37 grados Celsius. A la mañana siguiente, tome 50 microlitros del cultivo saturado y subcultívelo en un medio de cultivo de glucosa M 63 mínimo e incube a 30 grados centígrados durante cuatro a seis horas. Aquí se utilizan dos cepas celulares diferentes.

Uno expresa un citocromo transportador de electrones fusionado a GFP. El otro expresa una proteína involucrada en el motor de los flagelos bacterianos. Las células fusionadas con GFP se pueden recolectar directamente del subcultivo en crecimiento si se van a ver como muestras inmovilizadas, o se pueden cortar para truncar flagelos bacterianos si se ven en condiciones de anclaje.

Para cortar las bacterias, coloque de uno a cinco mililitros del subcultivo en un dispositivo que consta de dos jeringas estériles mediante tuberías estériles. Alterne el empuje en cada bomba de jeringa para forzar el cultivo a través del tubo estrecho unas 50 a 100 veces, dependiendo del grado de cizallamiento adquirido. A continuación, centrifugar el cultivo para pellets las células y luego volver a suspender las células en medios mínimos para eliminar los fragmentos de flagelos. Una vez que las celdas estén listas, prepare cubreobjetos de vidrio BK seven limpios sumergiéndolos en una solución saturada de hidróxido de potasio y etanol durante 20 minutos.

Enjuague bien con agua desionizada y etanol y deje secar al aire durante al menos una hora. A continuación, construya una celda de flujo simple para alojar las células en el microscopio. Para hacer esto, dibuje líneas de grasa de parafina en un portaobjetos de microscopio de vidrio BK seven y luego cree un sándwich de túnel colocando uno de los cubreobjetos limpios en la parte superior.

Presione suavemente con un par de pinzas. Esto debería dar un volumen de celda de flujo de cinco a 10 microlitros. Para observar las células inmovilizadas, llene la celda de flujo inyectándola con una solución al 0,1% de lisina poli L y déjela incubar a temperatura ambiente durante al menos un minuto.

A continuación, enjuague la celda de flujo inyectando 100 microlitros de medios mínimos desde un extremo de la celda de flujo y, al mismo tiempo, absorbiendo los medios a través de la celda de flujo con papel de seda desde el otro lado, WIC arrojó 20 microlitros de una dilución de uno en 500 de microesferas de látex de 200 nanómetros de diámetro en medios mínimos para marcar la superficie de deslizamiento de la cubierta. Coloque la celda de flujo en una cámara de humedad simple e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. La celda de flujo está invertida de tal manera que el cubreobjetos está hacia abajo.

A continuación, las cuentas sin enlazar se lavan absorbiendo a través de 100 microlitros de medios mínimos con papel de seda. Para observar las células atadas, omita el paso de incubación de poli L lisina, llene la celda de flujo con cinco microgramos por mililitro de solución de anticuerpos gellan Anti-Flag y luego colóquela en una cámara de humedad durante 10 minutos. Después de la incubación, enjuague la celda de flujo absorbiéndola con papel de seda.

A continuación, WIC 20 microlitros del cultivo celular a través de la celda de flujo con papel de seda, ya sea usando la muestra cortada para observar las celdas atadas o la muestra no compartida para ver las celdas inmovilizadas, la celda de flujo se invierte y se coloca en la cámara de humedad durante 20 minutos. A continuación, las células no unidas se lavan mediante la absorción a través de 100 microlitros de medio mínimo. Coloque una gota de aceite de inmersión en el centro de la superficie superior del cubreobjetos.

Coloque la celda de flujo suavemente sobre el portamuestras del microscopio de fluorescencia hecho a medida. Esto debería hacer contacto óptico con la lente del objetivo de alta apertura numérica. A continuación, encienda la cámara multiplicadora de electrones del microscopio y configure la cámara para que se enfríe a menos 70 grados centígrados.

El software está configurado para adquirir imágenes a una velocidad de fotogramas típica de 25 hercios. En el modo de transferencia de fotogramas. Encienda la iluminación de campo claro y enfoque la imagen.

Seleccione una célula o un grupo de células adecuadas para obtener imágenes en función de que estén pegadas a su eje largo. Paralelamente a la superficie del cubreobjetos, ajuste el enfoque para asegurarse de que las perlas de látex de 200 nanómetros pegadas a la superficie del cubreobjetos estén perfectamente enfocadas. Adquiera una secuencia de imágenes en campo claro para registrar el contorno del cuerpo de la célula.

A continuación, se apaga la iluminación de campo claro y la ganancia de la cámara se habilita al máximo para obtener imágenes mediante fluorescencia de reflexión interna total, también conocida como turf. Inicie la adquisición de la cámara y abra el obturador láser para excitar las proteínas fluorescentes dentro de las bacterias. Los parámetros de intensidad del láser y velocidad de adquisición deben optimizarse para el sistema biológico en particular.

Las muestras en estudio se iluminan hasta que se fotoblanquean, lo que suele tardar unos 10 segundos. Una vez que se han recopilado los datos, las imágenes se introducen en un programa de análisis escrito a medida, que detecta automáticamente las posiciones de los puntos fluorescentes en las células con una precisión de unos pocos nanómetros y extrae su tamaño y brillo. A continuación, se utiliza el brillo de la traza de fotoblanqueo con respecto al tiempo de atracción del complejo molecular para estimar el uso de la estequiometría.

Con este método, la imagen de las células vistas en campo claro es muy distinta, de modo que los perímetros de los cuerpos celulares son oscuros contra un cuerpo de células grises blancas que usa fluorescencia con células inmovilizadas. Aquí se pueden ver distintos puntos de intensidad de 250 a 300 nanómetros de ancho en falso color. Las células sanas ancladas se pueden ver girando alrededor del punto de unión de la atadura en imágenes de campo claro bajo excitación fluorescente.

También se pueden ver algunos complejos moleculares en el punto de unión, lo que indica una localización de la proteína en tanque con el motor Geller. Estas manchas son complejos moleculares individuales. El número de estos que se ven dependerá del modo de iluminación utilizado y de cuántos de los complejos están realmente presentes en la célula en un momento dado.

Si la densidad de manchas es inicialmente muy alta, como es el caso de los citocromos marcados que se utilizan aquí, entonces la realización de un blanqueo frap inicial puede mejorar el contraste de la imagen. La movilidad de las manchas depende del sistema biológico específico. En estudio, acabamos de mostrarle cómo visualizar complejos moleculares individuales utilizando microscopía de fluorescencia avanzada.

Al realizar este procedimiento, es importante no tener celdas de cizallamiento, ya que esto puede afectar la funcionalidad del motor de bandera. También es importante no dejar las células en los portaobjetos del microscopio durante más de una hora, ya que pueden agotarse de oxígeno. Se requiere automatización para encontrar las mejores condiciones de imagen.

Puede ser útil usar GFP purificado solo para determinar la potencia láser correcta para su sistema de microscopio en particular. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.