Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Aquí demostramos el protocolo para realizar microscopía de fluorescencia de molécula individual en células bacterianas vivas, con el fin de detectar, rastrear y cuantificar complejos moleculares funcionales. Este protocolo comienza con el cultivo de bacterias que producen una proteína marcada con una molécula de colorante fluorescente. Después de cuatro a seis horas, se extrae un pequeño volumen de células del cultivo y se truncan sus filamentos flagelares mediante cizallamiento.

Un cubreobjetos de vidrio dentro de una celda de flujo se recubre para permitir que las células se adhieran a la superficie. Las células se inyectan en la celda de flujo y se fijan mediante un estilete de gel, que se observa en fluorescencia utilizando microscopía de excitación con láser. Una cámara de alta eficiencia cuántica registra entonces las imágenes claras de campo brillante y de fluorescencia de los complejos moleculares marcados.

Hola, mi nombre es Ian Doy y estoy trabajando con Mark Lee en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Oxford. Soy Alex Robertson, trabajando con Mark Lee en el departamento de física. Soy Nick De del laboratorio de fugas, también ubicado en el departamento de física.

Hoy les mostraremos el procedimiento para visualizar complejos moleculares individuales en bacterias vivas utilizando microscopía de fluorescencia avanzada. Utilizamos este procedimiento para estudiar esto en un estado funcional. También lo empleamos para investigar la dinámica en tiempo real de máquinas biológicas naturales y a escala de nanómetros.

Así que comencemos. Para empezar, descongele 50 microlitros de tallos congelados de bacterias e coli. Estos han sido modificados genéticamente.

Para marcar una proteína con una molécula de colorante fluorescente, inocule cinco mililitros de medio de crecimiento LB y cultive las bacterias aeróbicamente con agitación durante la noche a 37 grados Celsius. A la mañana siguiente, tome 50 microlitros de la cultura saturada y subcultívelos en medio de cultivo mínimo M 63 con glucosa, incube a 30 grados Celsius durante cuatro a seis horas. Aquí se utilizan dos cepas celulares diferentes.

Uno expresa un citocromo transportador de electrones fusionado a GFP. El otro expresa una proteína implicada en el motor del flagelo bacteriano. Las células fusionadas a GFP pueden ser recolectadas directamente del subcultivo en crecimiento si se van a observar como muestras inmovilizadas, o pueden ser sometidas a cizallamiento para truncar los flagelos bacterianos si se observan bajo condiciones ancladas.

Para romper mecánicamente las bacterias, coloque de uno a cinco mililitros de la subcultivo en un dispositivo compuesto por dos jeringas estériles mediante tubos estériles. Alterne el empuje en cada jeringa para forzar el paso del cultivo a través del tubo estrecho aproximadamente de 50 a 100 veces, según el grado de rompimiento deseado. A continuación, centrifugue el cultivo para obtener un sedimento celular y luego resuspenda las células en medio mínimo para eliminar los fragmentos de flagelos. Una vez que las células estén listas, prepare cubreobjetos de vidrio BK siete limpios sumergiéndolos en una solución saturada de hidróxido de potasio y etanol durante 20 minutos.

Lave bien con agua desionizada y etanol, y deje secar al aire durante al menos una hora. A continuación, construya una celda de flujo sencilla para alojar las células en el microscopio. Para ello, trace líneas de grasa de parafina sobre un portaobjetos de vidrio BK siete, y luego cree un sándwich en túnel colocando uno de los cubreobjetos limpios encima.

Presione suavemente con un par de pinzas. Esto debería dar un volumen de la celda de flujo de cinco a 10 microlitros. Para observar las células inmovilizadas, llene la celda de flujo inyectando una solución al 0,1% de poli-L-lisina y déjela incubar a temperatura ambiente durante al menos un minuto.

A continuación, lave la celda de flujo inyectando 100 microlitros de medio mínimo desde un extremo de la celda de flujo y, simultáneamente, retire el medio a través de la celda de flujo con papel de laboratorio desde el otro extremo. Después, agregue 20 microlitros de una dilución 1:500 de microesferas de látex de 200 nanómetros de diámetro en medio mínimo para marcar la superficie del cubreobjetos. Coloque la celda de flujo en una cámara de humedad sencilla e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. La celda de flujo se invierte de modo que el cubreobjetos quede orientado hacia abajo.

Luego, se eliminan por capilaridad las perlas no unidas con 100 microlitros de medio mínimo utilizando papel de tejido. Para observar las células ancladas, omita en su lugar el paso de incubación con poli-L-lisina, llene la cámara de flujo con una solución de anticuerpo Anti-Flag gellan a cinco microgramos por mililitro y colóquela luego en una cámara de humedad durante 10 minutos. Tras la incubación, enjuague la cámara de flujo mediante capilaridad con papel de tejido.

A continuación, se aplican por capilaridad 20 microlitros de cultivo celular a través de la celda de flujo con papel absorbente, utilizando la muestra cortada para observar células ancladas o la muestra sin cortar para visualizar células inmovilizadas; la celda de flujo se invierte y se coloca en la cámara de humedad durante 20 minutos. Las células no unidas se eliminan luego mediante lavado por capilaridad con 100 microlitros de medio mínimo. Coloque una gota de aceite de inmersión en el centro de la superficie superior del cubreobjetos.

Coloque suavemente la celda de flujo sobre el portamuestras del microscopio de fluorescencia construido a medida. Esto debe establecer contacto óptico con la lente objetivo de alta apertura numérica. A continuación, encienda la cámara de multiplicación electrónica del microscopio y configure la cámara para que se enfríe a menos 70 grados Celsius.

El software está configurado para adquirir imágenes a una velocidad de fotogramas típica de 25 hercios. En modo de transferencia de fotogramas. Encienda la iluminación de campo claro y enfoque la imagen.

Seleccione una célula o grupo de células adecuado para ser imagenado en función de que esté adherido con su eje largo paralelo a la superficie del cubreobjetos. Ajuste el enfoque para asegurarse de que las microesferas de látex de 200 nanómetros adheridas a la superficie del cubreobjetos estén justo en foco. Adquiera una secuencia de imágenes en campo claro para registrar el contorno del cuerpo celular.

A continuación, se apaga la iluminación de campo claro y se activa la ganancia de la cámara al máximo para la adquisición de imágenes mediante fluorescencia por reflexión interna total, también conocida como TIRF. Inicie la adquisición con la cámara y abra el obturador del láser para excitar las proteínas fluorescentes dentro de las bacterias. Es necesario optimizar los parámetros de intensidad del láser y velocidad de adquisición para el sistema biológico específico.

Las muestras en estudio se iluminan hasta que se produce el blanqueo fotográfico, lo cual normalmente tarda aproximadamente 10 segundos. Una vez que se han recopilado los datos, las imágenes se introducen en un programa de análisis desarrollado personalmente, que detecta automáticamente las posiciones de los puntos fluorescentes en las células con una precisión de unos pocos nanómetros y extrae su tamaño e intensidad. La intensidad del rastro de blanqueo fotográfico con respecto al tiempo del complejo molecular atrayente se utiliza entonces para estimar la estequiometría empleada.

Mediante este método, la imagen de las células observada en campo claro es muy nítida, de modo que los perímetros de los cuerpos celulares aparecen oscuros frente a un cuerpo celular gris claro utilizando fluorescencia con células inmovilizadas. Aquí se pueden observar manchas definidas de intensidad, típicamente de 250 a 300 nanómetros de ancho, mostradas en falso color. Células sanas ancladas pueden observarse rotando alrededor del punto de fijación del anclaje en imágenes de campo claro bajo excitación fluorescente.

Algunos complejos moleculares también podrían observarse en el punto de unión, lo que indica una localización de la proteína asociada con el motor de Geller. Estos puntos son complejos moleculares individuales. La cantidad de estos que se observan dependerá del modo de iluminación utilizado y de cuántos complejos están realmente presentes en la célula en un momento dado.

Si inicialmente la densidad de puntos es muy alta, como es el caso de los citocromos marcados utilizados aquí, entonces realizar un blanqueo FRAP inicial puede mejorar el contraste de la imagen. La movilidad de los puntos depende del sistema biológico específico en estudio. Acabamos de mostrarle cómo visualizar complejos moleculares individuales utilizando microscopía de fluorescencia avanzada.

Al realizar este procedimiento, es importante no someter las células a esfuerzos cortantes, ya que esto podría afectar la funcionalidad del motor flagelar. También es importante no dejar las células en las laminillas del microscopio durante más de una hora, ya que podrían volverse deficientes en oxígeno. Se requiere automatización para encontrar las mejores condiciones de imagen.

Puede ser útil utilizar GFP purificada sola para determinar la potencia láser adecuada para su sistema microscópico particular. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.