Reacción en cadena: Protocolo Básico Plus Estrategias de resolución de problemas y optimización

El objetivo general de este procedimiento es demostrar los pasos involucrados en la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, que se utiliza para producir un amplio suministro de un segmento específico de ADN a partir de una pequeña cantidad de material de partida. En primer lugar, ensamble los reactivos y los materiales que se utilizarán en la reacción de PCR, luego configure la mezcla de reacción, incluidos los cuatro ribonucleótidos desoxi, la plantilla de ADN, los cebadores y la ADN polimerasa. A continuación, el ciclo térmico condiciona y ejecuta la reacción PCR.

A continuación. Compruebe los resultados para determinar si la reacción fue exitosa. En última instancia, una reacción en cadena de la polimerasa debería producir un amplicón específico del tamaño de producto deseado.

En general, las personas nuevas en este protocolo tendrán un poco de dificultad para configurar los cálculos de cada uno de los reactivos variables y, a veces, tienen problemas con el pipeteo, los volúmenes correctos, especialmente con la polimerasa que tiene glicerol. Comienza el experimento con una cubitera recién llena. Use guantes para evitar contaminar la reacción.

Mezcla y reactivos. Coloque los componentes de PCR en hielo para que se descongelen por completo. Estos incluyen los cebadores de plantilla de ADN, tampón de reacción de ADN polimerasa 10 x con o sin cloruro de magnesio, nucleótidos desoxi, agua estéril y cloruro de magnesio.

El cloruro de magnesio es necesario si se utiliza el tampón sin cloruro de magnesio. Coloque una placa de 96 pocillos en una cubeta de hielo como soporte para los tubos de PCR de pared delgada de 0,2 mililitros. Ahora equipe el banco de trabajo con tubos y tapones de PCR.

Un soporte de tubos de PCR, un marcador resistente al etanol y un juego de micropipetas. Cree siempre una tabla de reactivos detallando la mezcla de reacción con agua destilada estéril cuántica para obtener un volumen final de 50 microlitros. Por ejemplo, utilizando cinco microlitros de un tampón sin magnesio, un microlitro de NTP DN de 10 milimolares y un magnesio optimizado de 4,0 milimolares.

Un microlitro de cada 20 cebadores micromolares, 0,5 microlitros de una plantilla de dos nanogramos por microlitro. Y 0,5 microlitros de polimerasa solo requerirían 33 microlitros de agua estéril. Agregue cloruro de magnesio si no está presente en el tampón 10 x o si es necesario para la optimización de PCR.

Proceda a etiquetar los tubos de PCR con un marcador resistente al etanol en cada tubo de reacción. Primero, agregue las cantidades calculadas de agua estéril, luego agregue 10 x tampón y 10 milimolares DN NTP. Para esta reacción, estamos realizando una valoración con cloruro de magnesio.

Dado que la concentración de magnesio no será constante, se agrega cloruro de magnesio a los tubos de PCR individualmente y el volumen se normaliza a 10 microlitros con agua estéril, de modo que se agregan 40 microlitros de la mezcla maestra final a cada tubo de PCR. Para completar la reacción de 50 microlitros y el cloruro de magnesio, continúe agregando la plantilla de ADN y los cebadores. Por último, se añaden de 0,5 a 2,5 unidades de ADN polimerasa por reacción de 50 microlitros en un tubo de microfuga de 1,8 mililitros.

Prepare una solución de mezcla maestra suficiente para acomodar los controles, así como la pérdida de transferencia de pipeta. Ajuste una micropipeta a aproximadamente la mitad del volumen total de la solución y mezcle suavemente mediante pipeteo. Para cada muestra de prueba, mezcle una mezcla maestra elocuente en un tubo de PCR.

Ahora, para el control negativo sin ADN moltal, agregue todos los reactivos y use agua estéril para compensar el volumen de ADN faltante. A continuación, para el control positivo, utilice un conjunto de ADN molde y cebadores que amplifiquen un fragmento conocido en las mismas condiciones que las muestras experimentales de PCR. Los termocicladores de PCR calientan y enfrían rápidamente la mezcla de reacción, lo que permite la desnaturalización inducida por el calor del dúplex, el arrodillamiento del ADN de los cebadores en las hebras positivas y negativas de la plantilla de ADN y el alargamiento del producto de PCR.

Los tiempos de ciclo se basan en el tamaño de la plantilla y el contenido de GC del ADN para la fórmula general. Comience con una desnaturalización inicial de la plantilla, luego inicie de 25 a 35 rondas de un programa de ciclo de temperatura de tres pasos. El primer paso de estos ciclos es desnaturalizar la plantilla de ADN.

A continuación, programe para el óptimo, un arrodillamiento de los cebadores a unos cinco grados centígrados por debajo de la temperatura de fusión aparente de los cebadores, seguido de la etapa de elongación para llevar la polimerasa a la plantilla de ADN y sintetizar el producto de PCR. Ahora introduzca el número de ciclos. Próximo programa.

Un paso de elongación extendido para completar la síntesis de amplicones. Finalmente, incluya un paso de terminación, enfriando la mezcla a cuatro grados centígrados. Si las condiciones estándar de la PCR no producen el amplicón deseado, es necesario optimizar la PCR para obtener mejores resultados.

Por lo tanto, si las reacciones no funcionaron la primera vez, debe intentar solucionar el problema de la reacción. Y así, primero, quieres asegurarte de que el problema no haya sido un error humano. Y eso podría suceder si tiene un error de pipeteo o si, si olvidó agregar un reactivo a la prueba, uno de los tubos de ensayo.

A continuación, puede intentar alterar algunas de las rigurosidades de la condición para que pueda modificar la configuración del termociclador, o puede alterar la concentración de magnesio es otro método alternativo. También puede intentar agregar algunos aditivos al reactivo para solucionar los problemas. Alternativamente, considere la PCR de arranque en caliente como una modificación versátil en la que el tiempo de desnaturalización inicial aumenta drásticamente.

A continuación, se utiliza la electroforesis en gel AROS para resolver la PCR del gen GAL tres del ADN genómico de S seia para determinar la concentración óptima de iones de magnesio para este conjunto de reactivos, tenga en cuenta que un producto de PCR del tamaño esperado. 2098 pares de bases aparece a partir de una concentración de magnesio de 2,5 milimolares con una concentración óptima a cuatro milimolares en diferentes plantillas de ADN amplificación del producto de PCR deseado como una banda discreta requiere dos milimolar de magnesio. La reducción de la rigurosidad de la reacción a condiciones de amplificación efectivamente subóptimas produce una mancha de productos no específicos.

Además, con la rigurosidad general de la reducción de la reacción, se requiere una menor cantidad de iones de magnesio para formar un icono de amplicón. Por lo tanto, la optimización de la PCR teniendo en cuenta las variables puede producir el producto discreto deseado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y preparar una reacción en cadena de la polimerasa.

El objetivo es comprender las variables de cada PCR y cómo se pueden manipular para crear el amplicón deseado.