Name: Reacción en cadena: Protocolo Básico Plus Estrategias de resolución de problemas y optimización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende los pasos esenciales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar ADN específico. Este protocolo detalla la preparación de reactivos, condiciones térmicas y estrategias de optimización para obtener resultados reproducibles en biología molecular.

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Un agradecimiento especial a Kris Reddi en la UCLA para la creación de reactivos y verter los geles y Erin Sanders en la UCLA en busca de inspiración, guía y apoyo y la corrección del manuscrito. También me gustaría que gracias Giancarlo Costaguta y Gregory S. Payne para suministrar el ADN genómico de la levadura y los cebadores para amplificar el gen GAL3. También me gustaría dar las gracias a Shah Bhairav ​​para tomar fotografías de los equipos de laboratorio y los reactivos utilizados para hacer las figuras 2 a 4. Los fondos para este proyecto fue proporcionado por el HHMI (HHMI Grant N º 52.006.944).

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<li>Haqqi, T. M., Sarkar, G., David, C. S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+amplification+with+PCR+of+a+refractory+segment+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Specific amplification with PCR of a refractory segment of genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 16, 11844(1988).</li>
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<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR Protocols: A guide to methods and applications</a>. , Academic Press, Inc. San Diego. (1990).</li>
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<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The polymerase chain reaction.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, Appendix 4J(2002).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Kwok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+immunodeficiency+virus+sequences+by+using+in+vitro+enzymatic+amplification+and+oligomer+cleavage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection.</a> J. Virol. 61, 1690-1694 (1987).</li>
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<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239, 487-491 (1988).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
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<li>Sarkar, G., Kapelner, S., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formamide+can+dramatically+improve+the+specificity+of+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formamide can dramatically improve the specificity of PCR.</a> Nucleic Acids Res. 18, 7465(1990).</li>
<li>Smit, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS+codon+12+mutations+occur+very+frequently+in+pancreatic+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KRAS codon 12 mutations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas.</a> Nucleic Acids Res. 16, 7773-7782 (1988).</li>
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</ol>

No tengo nada que revelar.

PCR se ha convertido en una herramienta indispensable en el arsenal de la ciencia biológica. PCR ha alterado el curso de la ciencia que permite a los biólogos a ceder el poder sobre los genomas, y hacer que los genes híbridos con nuevas funciones, permitiendo que las pruebas clínicas específicas y precisas, obteniendo conocimientos sobre los genomas y la diversidad, así como los genes simplemente de clonación para el análisis bioquímico más. Aplicación de la PCR está limitado sólo por la imaginación de los científicos que ejerce su poder. Hay muchos libros y artículos que describen los nuevos usos especializados de la PCR, y muchos más que se desarrollará en la próxima generación de la ciencia biológica. Sin embargo, independientemente de los enfoques previstos, el marco fundamental se ha mantenido el mismo. PCR, en toda su grandeza, es una aplicación in vitro para generar grandes cantidades de un segmento específico de ADN. El diseño de un experimento de PCR requiere de pensamiento y de paciencia. Los resultados mostrados en la Figura 3 ejemplifican uno de los canales principalesallenges la hora de diseñar una estrategia de optimización para la PCR. Es decir, como un parámetro de la PCR se cambia, puede afectar a otra. Como un ejemplo, si la PCR inicial se llevó a cabo a la temperatura sub-óptima de recocido (58 ° C) con un óptimo de Mg 2 + concentración de 2,0 mM, a continuación, el resultado sería producir un frotis como se ve en la Figura 3c. Un intento de resolver el frotis puede implicar la creación de las condiciones de PCR con las reacciones que contienen 2,0 mM MgCl 2 y el ajuste de la temperatura de templado a 61 ° C. Sin embargo, como se ve en la Figura 3a, esto no produciría ningún producto. En consecuencia, es aconsejable titular reactivos, en lugar de añadir una concentración a una sola reacción, cuando reparación resultados falsos. Además, los ajustes más comunes que se requieren para la optimización de un experimento de PCR son para cambiar el Mg 2 + concentración y para corregir las temperaturas de recocido. Sin embargo, si estos cambios no minimizar o anular los resultados aberrantes, la valoración de additiVES y / o cambiar los protocolos de la condición de ciclismo que se describen en las Tablas 2-6 puede aliviar el problema. Si todo esto falla, rediseñar los cebadores y de intentar, intentar de nuevo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Taq Polymeras </td><td> Sigma </td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Qiagen </td><td> 201225 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml de paredes delgadas tubos PCR </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml de pared delgada tapones de los tubos </td><td> Bio Rad </td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón TE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA disódico dihidrato de la sal </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCl </td><td> Sigma </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Custom Fago </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td> Primer Custom Fago </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td> Primer levadura personalizada </td><td> Integrado de Tecnologías de ADN </td><td colspan="2"> SacI Gal3 (-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td> Primer levadura personalizada </td><td> Integrado de Tecnologías de ADN </td><td colspan="2"> Gal3 (1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG </td></tr><tr><td> Termociclador </td><td> Bio Rad </td><td> 170-9703 </td><td> Mi Ciclador </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> ISC BioExpress </td><td> E-3120-500 </td><td></td></tr><tr><td> La electroforesis en gel </td><td> Hoeffer Scientific Instruments </td><td> Modelo HE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1 kb DNA Ladder </td><td> New England BioLabs </td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td> Bio Rad Power Pack </td><td> Bio Rad </td><td> 164-5050 </td><td> PowerPac básica </td></tr><tr><td> Gel Doc sistema de </td><td> Fotodyne Incorporated </td><td colspan="2"> FOTO / Analista Investigador FX estación de trabajo </td></tr></tbody></table>

reacción en cadena: protocolo básico plus estrategias de resolución de problemas y optimización

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

En las ciencias biológicas se han producido avances tecnológicos que catapultan a la disciplina en las edades de oro del descubrimiento. Por ejemplo, el campo de la microbiología se transformó con el advenimiento de microscopio Anton van Leeuwenhoek, que permitió a los científicos visualizar procariotas, por primera vez. El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las innovaciones que cambiaron el curso de la ciencia molecular, con el impacto que abarca un sinnúmero de subdisciplinas de la biología. El proceso teórico fue esbozada por Keppe y compañeros de trabajo en 1971, sin embargo, fue otro de 14 años hasta que el procedimiento completo de PCR se describe y se aplica experimentalmente por Kary Mullis, mientras que en la Cetus Corporation en 1985. Automatización y refinamiento de esta técnica progresó con la introducción de una ADN polimerasa térmica estable a partir de la bacteria Thermus aquaticus, en consecuencia, el nombre de la ADN polimerasa Taq. La PCR es una Powetécnica de amplificación rful que puede generar un amplio suministro de un segmento específico de ADN (es decir, una amplificación) a partir de sólo una pequeña cantidad de material de partida (es decir, molde de ADN o secuencia diana). Si bien sencilla y, en general sin problemas, hay dificultades que complican la reacción que produce resultados falsos. Cuando la PCR no se puede llevar a muchos productos no específicos de ADN de diferentes tamaños que aparecen como una escalera o un frotis de bandas en geles de agarosa. A veces hay productos forman en absoluto. Otro problema potencial se produce cuando las mutaciones se introdujeron involuntariamente en los amplicones, resultando en una población heterogénea de productos de PCR. Los fallos de la PCR puede ser frustrante no ser la paciencia y la solución de problemas de cuidado se emplean para resolver y solucionar el problema (s). Este protocolo describe los principios básicos de la PCR, proporciona una metodología que se traducirá en la amplificación de secuencias de la mayoría de objetivo, y presenta estrategias para la optimización de una reacción. Siguiendo esta guía de PCR, víaudents debe ser capaz de: <ul><li> Establecer las reacciones y las condiciones de ciclos térmicos convencionales para un experimento de PCR </li><li> Comprender la función de varios componentes de la reacción y su efecto global sobre un experimento de PCR </li><li> Diseñar y optimizar un experimento de PCR para cualquier molde de DNA </li><li> Solucionar problemas de fallidos experimentos de PCR </li></ul>

PCR se ha convertido en una técnica común en muchos laboratorios de biología molecular. Siempre que aquí hay una guía rápida de varios protocolos de PCR convencionales. Debido a que cada reacción es un experimento único, las condiciones óptimas requeridas para generar un producto variar. La comprensión de las variables en una reacción en gran medida mejorar la eficiencia de la solución de problemas, lo que aumenta la posibilidad de obtener el resultado deseado.

Reacción en cadena: Protocolo Básico Plus Estrategias de resolución de problemas y optimización

En las ciencias biológicas se han producido avances tecnológicos que han catapultado la disciplina hacia edades doradas de descubrimientos. Por ejemplo, el campo de...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar los pasos involucrados en la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, que se utiliza para producir una cantidad abundante de un segmento específico de ADN a partir de una pequeña cantidad de material inicial. Primero, reúna los reactivos y materiales que se utilizarán en la reacción de PCR; luego, prepare la mezcla de reacción, que incluye los cuatro desoxirribonucleótidos, la plantilla de ADN, los cebadores y la ADN polimerasa. A continuación, programe las condiciones de ciclado térmico y realice la reacción de PCR.Después de esto, revise los resultados para determinar si la reacción fue exitosa. En última instancia, una reacción en cadena de la polimerasa debería producir un amplicón específico del tamaño deseado del producto.Por lo general, las personas nuevas en este protocolo tendrán un poco de dificultad al configurar los cálculos de cada uno de los reactivos variables, y a veces tendrán problemas con la pipeta, especialmente con los volúmenes correctos del polimerasa que contiene glicerol. Comience el experimento con un recipiente lleno recientemente de hielo. Use guantes para evitar contaminar la reacción.Mezcla y reactivos. Coloque los componentes de la PCR en hielo para descongelarlos completamente. Estos incluyen la plantilla de ADN, los cebadores, la ADN polimerasa, tampón de reacción 10 x con o sin cloruro de magnesio, desoxinucleótidos, agua estéril y cloruro de magnesio.Se requiere cloruro de magnesio si se utiliza el tampón sin cloruro de magnesio. Coloque una placa de 96 pocillos en un recipiente con hielo como soporte para los tubos PCR de pared delgada de 0,2 mililitros. Ahora equipe la bancada con tubos PCR y tapas.Un portamatraces para tubos PCR, un marcador resistente al etanol y un juego de micropipetas. Cree siempre una tabla de reactivos detallando la mezcla de reacción con agua destilada estéril en cantidad suficiente para obtener un volumen final de 50 microlitros. Por ejemplo, utilizando cinco microlitros de un tampón sin magnesio, un microlitro de DNTPs 10 milimolares y magnesio optimizado a 4,0 milimolares.Un microlitro de cada cebador de veinte micromolares, 0,5 microlitros de una plantilla de dos nanogramos por microlitro y 0,5 microlitros de polimerasa requerirían únicamente 33 microlitros de agua estéril. Añada cloruro de magnesio si no está presente en el tampón 10 x o si es necesario para la optimización de la PCR.Proceda a etiquetar los tubos de PCR con un marcador resistente al etanol en cada tubo de reacción. Primero, agregue las cantidades calculadas de agua estéril, luego agregue tampón 10 x y DNTPs 10 milimolares. Para esta reacción, estamos realizando una titulación con cloruro de magnesio.Dado que la concentración de magnesio no será constante, el cloruro de magnesio se añade individualmente a los tubos de PCR, y el volumen se normaliza a 10 microlitros con agua estéril, de modo que se añaden 40 microlitros de la mezcla maestra final a cada tubo de PCR. Para completar la reacción de 50 microlitros con cloruro de magnesio, continúe añadiendo la plantilla de ADN y los cebadores. Finalmente, añada de 0,5 a 2,5 unidades de ADN polimerasa por reacción de 50 microlitros en un tubo microfuga de 1,8 mililitros.Prepare una solución de mezcla maestra suficiente para incluir los controles, así como para compensar las pérdidas durante la transferencia con pipeta. Ajuste una micropipeta a aproximadamente la mitad del volumen total de la solución y mezcle suavemente aspirando y dispensando con la pipeta. Para cada muestra de prueba, añada la mezcla maestra a un tubo de PCR.Ahora, para el control negativo sin ADN molde, agregue todos los reactivos y use agua estéril para compensar el volumen de ADN faltante. Luego, para el control positivo, utilice un conjunto de ADN molde y cebadores que amplifiquen un fragmento conocido bajo las mismas condiciones que las muestras experimentales de PCR. Los termocicladores PCR calientan y enfrían rápidamente la mezcla de reacción, permitiendo la desnaturalización inducida por calor del dúplex, el apareamiento de los cebadores con las cadenas positiva y negativa del molde de ADN y la elongación del producto de PCR.Los tiempos de ciclado se basan en el tamaño de la plantilla y en el contenido de GC del ADN según la fórmula general. Comience con una desnaturalización inicial de la plantilla, luego inicie de 25 a 35 ciclos de un programa de ciclo de temperatura en tres pasos. El primer paso de estos ciclos desnaturaliza la plantilla de ADN.Luego programe, de forma óptima, un paso de alineamiento de cebadores aproximadamente cinco grados Celsius por debajo de la temperatura aparente de fusión de los cebadores, seguido por el paso de elongación para llevar la polimerasa a la plantilla de ADN y sintetizar el producto de PCR. Ahora ingrese el número de ciclos. Siguiente programa.Un paso extendido de elongación para completar la síntesis de los amplicones. Finalmente, incluya un paso de terminación, enfriando la mezcla a cuatro grados Celsius. Si las condiciones estándar de PCR no producen el amplicón deseado, es necesario optimizar la PCR para obtener mejores resultados.Entonces, si las reacciones no funcionaron la primera vez, querrá intentar solucionar el problema. Primero, debe asegurarse de que el problema no haya sido un error humano. Eso podría ocurrir si tuvo un error de pipeteo o si olvidó añadir un reactivo a la prueba, a uno de los tubos de ensayo.A continuación, puede intentar modificar algunas de las rigurosidades de la condición, de modo que pueda ajustar la configuración del termociclador, o bien puede alterar la concentración de magnesio, que es otro método alternativo. También puede intentar agregar algunos aditivos al reactivo para solucionar los problemas. Alternativamente, considere la PCR con inicio en caliente como una modificación versátil en la que el tiempo de desnaturalización inicial se incrementa considerablemente.Se utiliza entonces la electroforesis en gel AROS para separar el producto de PCR del gen tres GAL a partir de ADN genómico de S. seia con el fin de determinar la concentración óptima de iones de magnesio para este conjunto de reactivos. Obsérvese un producto de PCR del tamaño esperado: 2098 pares de bases, que aparece a partir de una concentración de magnesio de 2,5 milimolar, con una concentración óptima a 4 milimolar. En diferentes plantillas de ADN, la amplificación del producto de PCR deseado como una banda definida requiere 2 milimolar de magnesio. La reducción de la especificidad de la reacción, llevando las condiciones de amplificación a niveles efectivamente subóptimos, produce un borramiento de productos no específicos.Además, con la reducción de la rigurosidad general de la reacción, se requiere una menor cantidad de ion magnesio para formar un icono de amplicón. Por lo tanto, optimizar la PCR teniendo en cuenta las variables puede producir el producto deseado específico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y preparar una reacción en cadena de la polimerasa.El objetivo es comprender las variables de cada PCR y cómo se pueden manipular para crear el amplicón deseado.

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Investigación

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Biología

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