La personalización de Aspergillus niger Morfología través de la adición de talco micro partículas

Este método genera y caracteriza estructuras morfológicas dependientes de micropartículas de hongo filamentoso, aspergillus, Níger, para correlacionar la morfología del hongo con la productividad. Cultive ocho Níger con o sin micropartículas en un tanque agitado de tres litros, biorreactor durante 72 horas para calcular la productividad específica. Tomar muestras en puntos de tiempo definidos y determinar la biomasa, el peso seco y vetar la actividad de fructosa.

Después de 72 horas, examinar la morfología del hongo por microscopía y caracterizarla por análisis de imagen digital. A continuación, combine los parámetros relevantes del análisis de imágenes en un número de morfología que se correlacione matemáticamente con la productividad específica. En última instancia, este método puede generar y caracterizar de manera precisa y exhaustiva la morfología del aspergillus Niger para una mejor comprensión de la morfogénesis de los microorganismos filamentosos.

Aspergillus Nigel es un importante caballo de batalla industrial en biotecnología desde hace muchas décadas. Una de las características más intrigantes y a menudo incontrolables de los aspers, nigel y especies relacionadas es su compleja morfología que va desde densos gránulos esféricos hasta micelios viscosos, dependiendo de las condiciones de cultivo. La principal ventaja de nuestro procedimiento es que, a través de la adición de micropartículas, ahora podemos adaptar la morfología fúngica específicamente a las necesidades del proceso.

Hasta ahora, no se ha descrito ningún otro método para tal personalización de la morfología fúngica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el cultivo de microorganismos filamentosos. Porque para la aplicación industrial, es crucial controlar la morfología fúngica y también distinguir entre una morfología fúngica que produce bien y una morfología que produce mal.

Nuestro protocolo proporciona los medios para la personalización y caracterización deseables de la morfología fúngica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la morfología del Aspergillus Nigel, también se puede aplicar a otros microorganismos filamentosos como el penicillium o las cepas de estreptococos. Establecer cuatro biorreactores para cultivos estériles, tal como se detalla en el protocolo adjunto.

Texto basado en la adición de micropartículas, cultivar aspergillus Niger con diferente morfología. Después de 72 horas, transfiera 50 mililitros. Muestras de caldo de cultivo en un tubo Falcon.

Las muestras de biomasa se tomarán al menos por duplicado después del secado en el desecado, se pesará un filtro de celulosa con las microescalas. Coloque el filtro en un embudo buchner con bomba de vacío de chorro de agua conectada, filtre 10 mililitros de muestra seguidos de 10 mililitros. El agua desionizada para eliminar los compuestos medios de la biomasa arruga el filtro una vez en el medio.

Colóquelo en una placa de Petri de vidrio y en un secador de compartimentos hasta que el peso constere. Transfiera el filtro a un desecador y deje que se enfríe. A continuación, mida el peso.

Calcular el peso seco de la biomasa por litro mediante el cálculo del peso, la diferencia de filtros y la posterior división por el volumen de la muestra para los ensayos de enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa. Almacene las muestras en hielo con un pase de jeringa de 1,5 mililitros. Suspensión de cultivo a través de un filtro de acetato de celulosa en un tubo de reacción Realiza el ensayo SASE de beta fructificación.

Meticulosamente aseguramos el éxito con dos muestras triplicadas para la robustez estadística. Para comenzar el ensayo, agregue 20 microlitros de muestra al tubo de ensayo para controlar el pH y la escisión dependiente de la temperatura de la sacarosa a glucosa, use 20 microlitros de agua desionizada en lugar de 20 microlitros de muestra. Además, para cada muestra, prepare un testigo negativo de glucosa residual en el caldo de cultivo mediante ensayo.

20 microlitros de muestra inactivada por calor Para iniciar la reacción de sacarosa a glucosa, agregue 200 microlitros de solución de sacarosa 1,65 molar. A pH de 5,4 a 20 microlitros en la muestra, incubar todos los tubos de reacción en un bloque calefactor de 40 grados centígrados durante 20 minutos. Detenga la reacción calentando a 95 grados centígrados durante 10 minutos después de enfriar los tubos en hielo.

Centrifugar las muestras cuando sea necesario, diluir las muestras para el ensayo de modo que la absorción medida esté en el rango de valores calibrados. Ahora, para cada reacción, agregue dos microlitros de muestra en una placa de microtitulación. Realice bien las mediciones de muestras por triplicado.

También prepare una curva estándar para 10 soluciones de glucosa que van desde un milimolar hasta 15 milimolar. Para la calibración del punto cero, utilice dos microlitros de agua desionizada. A continuación, añada 200 microlitros de la solución reactiva a cada uno.

Incubar bien durante 10 minutos a temperatura ambiente. Mida la absorción a 450 nanómetros utilizando un lector de microplacas Sunrise de 96 pocillos y el software de recuperación de datos Magellan. Abra el gráfico de resultados con una hoja de cálculo y construya una línea de calibración de curva estándar.

Calcule la actividad de cada muestra. A continuación, calcule la actividad de la beta fructotasa restando los valores del control negativo apropiado de la actividad de la muestra. Finalmente, se calcula la productividad específica factorizando el peso seco de la biomasa y la actividad de la beta fructo asa.

Colocar tres mililitros de suspensión de cultivo en una placa de Petri de plástico y diluir con una solución fisiológica de cloruro de sodio para separar las estructuras morfológicas. La calidad de las imágenes microscópicas es de excepcional importancia. Para el análisis posterior de la imagen, se debe tener cuidado durante el paso de dilución.

Coloque la placa de Petri bajo un microscopio, que cuenta con una cámara integrada. Adquiera y guarde alrededor de 100 imágenes de estructuras morfológicas por muestra, asegurándose de que al menos un objeto esté completamente representado en cada imagen. Continúe de la misma manera con placas que contengan muestras de diferentes reactores, adquiriendo nuevas imágenes cada vez.

Obsérvese la diferente forma morfológica de crecimiento de las muestras de diferentes reactores cultivados con diferentes cantidades de polvo de talco añadido. A continuación, abra todas las imágenes de la misma muestra en el programa de procesamiento de imágenes. Imagen J.Usando la herramienta de proceso, haga binario.

Convierta las imágenes a blanco y negro para aplicar el comando a toda una serie de imágenes. Utilice un código de macro A continuación, abra una de las imágenes que contienen una barra de escala. Construya una línea recta a través de la barra de escala para determinar el número de píxeles correlacionados con 2000 micras.

Seleccione la herramienta Analizar, establezca la medición y elija los factores de forma, los hurones, el área de diámetro y el perímetro. Utilice un código de macro para procesar una serie de imágenes. Ahora abra la hoja de cálculo que muestra los resultados de los valores de los factores de forma.

Para cada imagen, calcule un número de morfología para cada imagen con todas las imágenes de una muestra. Calcule el valor medio del número de morfología. Utilice un programa de gráficos y análisis de datos para trazar el número de morfología con la productividad específica.

Determinar la relación matemática por regresión matemática mediante la adición de concentraciones crecientes de micropartículas de talco. Ocho Níger SKAN 10 15. La morfología cambia de una morfología de pellets verdadera a una morfología dispersa o incluso mi morfología, como se esperaba, la morfología de pellets se exhibe en condiciones estándar.

Curiosamente, la morfología micelial se crea mediante la suplementación del medio con 10 gramos por litro de micropartículas de talco. Al mismo tiempo, la actividad de Beto Fructo tase se multiplica aproximadamente por tres, la suplementación de uno o tres gramos por litro de polvo de talco conduce a una morfología dispersa con una actividad de fructosa duplicada utilizando parámetros determinados por análisis automático de imágenes. La morfología dependiente de las micropartículas puede describirse de forma exhaustiva mediante la morfología.

Nota, perfectamente redonda en gránulos lisos aparecerá en imágenes microscópicas como círculos perfectos para tales partículas. El número de morfología tiene un valor aproximado a uno en condiciones estándar. La morfología en el reactor uno exhibe un número de morfología alrededor de 0.8.

La morfología en el reactor cuatro con 10 gramos por litro. El polvo de talco presenta un número de morfología de alrededor de 0,1. El número de morfología para los reactores dos y tres, con concentraciones de polvo de talco de uno y tres gramos por litro, se encuentra entre estos extremos, lo que demuestra una morfología dispersa.

Dado que la morfología dependiente de las micropartículas está estrechamente relacionada con la productividad de los citos de beta fructosa, existe una buena correlación matemática de la morfología, el número y la productividad después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biotecnología exploraran más a fondo la morfología fúngica y, especialmente, su relación con la productividad. Siguiendo este procedimiento de creación detallada de tipos morfológicos y fúngicos cruzados específicos, se pueden explorar otros aspectos importantes de los cultivos de microorganismos filamentosos.

Se sabe que la morfología micelial, por ejemplo, es mucho más viscosa que la morfología del paladar. Por lo tanto, la productividad general del proceso se ve afectada por problemas y purificación del producto deseado. Nuestro número de morfología ayudará a establecer modelos relacionados con la cultura, la pro teología y una mayor comprensión de la morfología fúngica en general.