Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

El objetivo de esta metodología es manipular tejidos delicados de plantas, oomicetos y hongos, para su óptima observación bajo un Microscopio Electrónico de Barrido, o SEM. Este método puede ayudarnos a responder preguntas sobre prácticamente cualquier hongo, microbio, mor-foridad y cómo infectan, colonizan y se adhieren a su huésped. La técnica en nuestra metodología mejorada es para la fijación de muestras, para donde los mi-toh-mins en los ecosistemas acuáticos.

La principal ventaja de esta técnica es que nos permite visualizar aspectos clave de la infección utilizando recursos costosos y fácilmente disponibles. La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos se han modificado enormemente con respecto a los protocolos tradicionales. Y los métodos publicados describen procedimientos generales sin detalles.

Para empezar, prepare el formol y el alcohol acético, o el fijador FAA en una vitrina de gases provista de un filtro de aldehído. A 85 partes de etanol desnaturalizado al 70%, 10 partes de solución de formaldehído al 60% y cinco partes de ácido acético glacial. Debajo de la vitrina de gases, vierta el caldo de FAA en recipientes individuales.

Seleccione los meristemos florales o vegetativos para fijar, asegurándose de que no sean dañados por insectos, hongos o condiciones climáticas extremas. Corta las ramas, eliminando el material no deseado, y deposita la muestra inmediatamente en la solución de FAA. Después de 72 a 96 horas, vierta el FAA en un recipiente de plástico para la eliminación de productos químicos.

Lave inmediatamente las muestras tres veces con etanol fresco al 70% para eliminar cualquier FAA residual. El material fijo se puede almacenar indefinidamente en etanol al 70%. Diseccione las muestras en una placa de Petri cubierta con etanol para evitar que los tejidos se sequen.

Use una placa de Petri con la base cubierta con una silicona negra seca para ver mejor el tejido blanco contrastante. Transfiera el tejido a recipientes separados y luego sumérjalos en una placa de Petri con etanol al 70%. Coloque las tapas en los recipientes y deposítelos en un tubo de centrífuga de plástico con abundante 70% de etanol.

Transfiera el material diseccionado a través de una serie de etanol en frascos herméticos o tubos de centrífuga. Deje las muestras en cada solución durante al menos una hora. Luego, mantenga las muestras durante la noche en una solución de etanol al 100%.

Siguiendo la serie de etanol, transfiera los recipientes con material al CPD. Escriba el número de identificación de la muestra debajo de los portamuestras SEM. A continuación, cubre la parte superior de los talones con cinta adhesiva de doble cara.

Coloque los talones en un portamuestras. Bajo un microscopio estereoscópico, abra cuidadosamente los recipientes que contienen las muestras jóvenes y delicadas ya secas en el CPD. Tenga en cuenta que después del tratamiento con CPD, las muestras se vuelven más ligeras y sensibles a la electrostática.

Cierre los recipientes una vez extraídas las muestras para evitar polvo o impurezas. Coloque las muestras en la superficie pegajosa de los talones, planificando con anticipación la posición deseada. Una vez que las muestras tocan la superficie, es muy difícil extraerlas.

No intentes realizar una disección importante en este punto. Simplemente elimine el tejido no deseado que es fácil de recoger. Para estudios palinológicos, diseccionar las anteras y abrirlas para exponer el polen en los talones.

Mantenga las muestras protegidas durante la noche en un recipiente hermético con gel de sílice para evitar la rehidratación. Cubra las muestras con el observador-recubridor y transfiéralas al SEM como se describe en el protocolo de texto. Para probar el crecimiento diferencial de las espinas de los quistes en placas de Petri separadas, coloque 0,5 mililitros de la suspensión del quiste secundario en diferentes superficies.

Las superficies pueden incluir rejillas de microscopía electrónica de transmisión de carbono, oro y cobre. Anteriormente, escamas de salmón y merluza blanqueadas, y cubrecristales. Incubar los quistes a 20 grados centígrados durante 70 minutos, lo que favorece la adhesión de los quistes a la superficie.

Retirar el líquido y añadir 0,5 mililitros de glutaraldehído al 2% en cada superficie para la fijación de los quistes. Mantenga las muestras a temperatura ambiente bajo una vitrina de gases durante una hora. Retirar el glutaraldehído y deshidratar las muestras a través de una serie de etanol, añadiendo cinco mililitros de cada una de las soluciones de etanol durante 15 minutos.

Una vez en la última solución de etanol al 100%, la muestra puede almacenarse hasta un mes en una placa de Petri sellada. Transfiera con cuidado las rejillas y las escamas de la placa de Petri a un soporte adecuado para el CPD que mantenga las muestras separadas entre sí, como un soporte de rejilla CPD o un soporte para muestras apilables. Tome la rejilla y las escamas con pinzas, teniendo en cuenta que los quistes deben estar boca arriba en las rejillas en todo momento.

Se procede a secar el material mediante el CPD antes de realizar la preparación de la muestra SEM de los ovocitos para observar su comportamiento en diferentes superficies, tal y como se describe en el protocolo de texto. Envuelva cada muestra cuidadosamente con papel de filtro formando sobres etiquetados con lápiz de aproximadamente 0,5 a un centímetro cuadrado. Tenga cuidado de no aplastar las muestras.

Sella el papel de filtro con clips. A continuación, transfiera las muestras empaquetadas a una placa de Petri y sumérjalas en 10 mililitros de agua para rehidratar el tejido alrededor de las esporas. Coloque inmediatamente las muestras en un microondas.

Retire el material una vez que el agua comience a evaporarse y deje que se enfríe a temperatura ambiente. A continuación, pase la muestra a través de una serie de etanol. Dependiendo de la cantidad de muestra, utilice un vaso de precipitados o un tubo de centrífuga para este paso.

Deje las muestras durante 15 minutos en cada solución. A continuación, coloque las muestras en el CPD como se describe en el protocolo de texto. Para montar las esporas para la observación SEM, abra los sobres.

Luego recoja las esporas con la superficie pegajosa de los talones, teniendo cuidado de no aplastarlas. Finalmente, realice el recubrimiento de oro de las muestras y la observación SEM como se detalla en el protocolo de texto. Aquí se muestran yemas florales de Anacyclus clavatus tratadas con tetróxido de osmio y preparadas utilizando el protocolo CPD de la FAA que se muestra en este video.

También se muestran muestras secas de phellorinia herculanea sin ningún tratamiento, así como esporas de hongos tratadas como se muestra en este video. Esta figura ilustra el desarrollo floral temprano, medio y tardío capturado bajo el SEM. Esta imagen es de la vista superior de un joven reh-cim.

Aquí se muestra un capullo floral durante la diferenciación del ginesio y una flor en la antesis. Algunas estructuras pueden ser difíciles de fijar y preservar para la obtención de imágenes bajo el SEM, por ejemplo, las que provienen de ambientes húmedos, así como las que tienen ornamentaciones y las que tienen indumenta.

Aquí se muestran los patrones de crecimiento diferenciales de las espinas de Saprolegnia parasitica en escamas de vidrio, carbono, cobre, oro, merluza y salmón. Este es un video que muestra el ciclo de vida asexual de la saprolegnia parasitica. El ciclo de vida asexual es importante para la dispersión de estos organismos en sus ambientes acuáticos o húmedos.

Por otra parte, los zoos producidos en esta etapa representan la unidad primaria de infección en las especies parásitas del orden de los saprolegniales. Si bien el dominio de esta técnica se puede hacer en tres a cinco días, es como se realiza correctamente. Con este tiempo, en el Real Jardín Botánico de Madrid hemos utilizado el dinero para completar las terapias SEM de uso externo.

Después de ver este video, los investigadores sabrán cómo recolectar y fijar de manera efectiva material biológico delicado para la observación SEM. La destrucción de las células, la distorsión de los órganos o la mala conservación de las muestras de los ambientes húmedos pueden superarse fácilmente con este procedimiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la observación a través de SEM se limita al estudio de superficies con gran aumento.

También antes del tratamiento con CPD, los sellos deben mantenerse a salvo de cambios impactantes y del contacto directo con el aire. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fitología exploraran la estructura de las esporas durante el proceso infeccioso, particularmente en especies de interés para las pesquerías. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de transmisión o la MT para responder preguntas adicionales, como cómo se encuentra la estructura interna de la composición celular en un órgano o células específicos, o en el polen.

No olvide que la manipulación de formalina y glutaraldehído puede ser extremadamente peligrosa, y siempre se deben tomar precauciones como trabajar debajo de un armario de gases y usar mascarillas, batas de laboratorio y guantes mientras se realiza este procedimiento.