Name: Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Aprende a cuantificar la división celular en subpoblaciones inmunes mediante tintes de seguimiento fluorescentes y citometría de flujo multicolor. Este método computacional permite analizar respuestas proliferativas con precisión.

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Los autores gustaría dar las gracias a las siguientes personas por sus contribuciones técnicas e intelectuales para el desarrollo de estos métodos a través de los años: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis celular Ciencia e Investigación PTI) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), y Mary Waugh (Dartmouth Medical School). También me gustaría dar las gracias a la clase de Bowdoin 2006 de los Cursos Anuales de Métodos de Investigación y Aplicaciones de la citometría de flujo, lo que generó los datos mostrados en la Figura 2. Citometría de flujo se realizó en el Laboratorio de Roswell Park Cancer Institute Citometría de flujo, que se estableció en parte por donaciones de equipo del Programa de Instrumentos NIH compartido, y recibe el apoyo de la Beca Core (5 P30 CA016056-29) de la NationalInstituto del Cáncer Roswell Park para el Cáncer del Instituto, y en la Citometría de Flujo Abramson Cancer Center y clasificación de células Laboratorio de Recursos de la Universidad de Pennsylvania, que fue establecida en parte por donaciones de equipo del Programa de Instrumentos NIH compartido, y recibe el apoyo de NIH # 2P30 CA016520 del Instituto Nacional del Cáncer. La obra se muestra en las figuras 3 y 5 también fue apoyado en parte por subvención SBIR EB00228 del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB) otorgó a PTI Research, Inc.

1. Etiquetado general de membrana con PKH26 Tracking Dye Celular (Ref. 25, Figura 1) <ol><li> Utilice una técnica estéril para los pasos 1,1 hasta 1,9. Preparar ~ 10 7 células humanas mononucleares de sangre periférica o los linfocitos (hPBMC, HPBL) utilizando el método estándar del laboratorio con la adición de un centrifugado final 300 xg para minimizar la contaminación por plaquetas. Resuspender las células en 10 7 / ml en HBSS BSA 1% y colocar en hielo, reservando una parte alícuota de 500 l (5x10 6 células) para uso en la Etapa 2. </li><li> Coloque 5x10 6 células (500 l) en un tubo de 12 x 75 mm de polipropileno cónico. Lavar una vez con 3,5 ml de HBSS. Aspirar con cuidado el sobrenadante, dejando no más de 15-25 l de fluido residual, pero teniendo cuidado de no eliminar las células. Utilice este tubo para preparar una suspensión de células 2x en el paso 1,4. </li><li> Durante el lavado de células en el paso 1,2, añadir 0,5 ml de diluyente de vehículo etiquetado C (del kit de PKH26GL) a un tubo de 12 x 75 mm de polipropileno cónico. Utilice este tubo para prepararson un 2x PKH26 solución en el paso 1,5. </li><li> Añadir 0,5 ml de diluyente de vehículo etiquetado C a la célula sedimento lavado de la Etapa 1,2 y aspirar y dispensar 3-4 veces para obtener una suspensión de células individuales (células 2x). Evitar la formación de burbujas y el exceso de mezcla, que pueden reducir la viabilidad celular y la recuperación. </li><li> Inmediatamente después de la preparación de la suspensión de células 2x en el paso 1,4, preparar un 2x (4 mM) solución de colorante añadiendo 2,0 l de 1,0 mM PKH26 stock de tinte en etanol (del kit de PKH26GL) al tubo C Diluyente preparado en el Paso 1,3 y vórtice a dispersar uniformemente. </li><li> Inmediatamente después de la preparación de la solución de colorante en el paso 2 x 1,5, rápidamente pipetear la suspensión de células a partir del paso 2 x 1,4 a 2 veces la solución de colorante y al mismo tiempo aspirar y dispensar 3-4 veces para dispersar completamente las células en tintes No:. Añadir 1,0 mM tinte directamente a células, verter las células 2x 2x en el tinte, o añadir celdas 2x 2x colorante mientras se agitaba. Debido a que la tinción es casi instantánea, tales métodos producen menosintensidades uniformes que el método recomendado (Figura 2). </li><li> Después de 1 min, añadir 1,0 ml de suero inactivado por calor o BSA HBSS +5% para detener la absorción de colorante en las membranas celulares. Si no se utiliza suficiente proteína corre el riesgo de la formación de agregados de colorantes, que pueden pellet con las células durante los pasos de lavado y causar etiquetado no deseada de otras células presentes en un experimento. Si el medio de calor con 10% de suero inactivado (CM) o HBSS 1% de BSA se va a usar como el reactivo de parada, llevar a cabo la tinción en un tubo de polipropileno cónico de 15 ml y añadir al menos 5,0 ml de reactivo de parada para asegurar la adsorción de todos colorante no incorporado. </li><li> Centrifugar las células marcadas por 5 min @ ~ 400 x g. Aspirar con cuidado el sobrenadante sin necesidad de retirar las células. Lavar el sedimento dos veces con 4 ml de HBSS CM o BSA 1%, la dispersión de la pastilla antes de recentrifugación. Para minimizar el arrastre de tinte adsorbido sobre las paredes del tubo y maximizar la eficiencia del lavado, transferir las células a un tubo de polipropileno de fresco después de la first resuspensión. Nota: adecuadamente células teñidas se muestran un matiz distinto color rosa en el pellet. </li><li> Resuspender el sedimento celular lavado en 1,0 ml de BSA% HBSS +1. Contar las células, determinar la recuperación celular, y ajustar el volumen para dar una concentración final de 10 7 / ml. Con la aspiración cuidadosa, recuperación celular debe ser ≥ 85%. Si la recuperación celular es &lt;70%, determine la causa antes de continuar. Extraer una alícuota de 150 l (1.5x10 6 células) y colocar en hielo para su uso en el Paso 2. </li></ol> 2. Preparación de los controles de configuración del instrumento y ensayo (Tabla 1) <ol><li> Alícuota de 50 l (5x10 5) de células no teñidas de la suspensión celular guardado en el paso 1,1 en cada uno de cinco tubos Eppendorf de 1,8 ml: 1, 3, 4, 5, y 7. Alícuota de 50 l (5x10 5) de células PKH26 OP de Paso 1,9 en cada uno de tres tubos: 2, 6 y 8. </li><li> Añadir 10 l bloque de IgG (100 ug / tubo de IgG; ver tabla de Reactivos) a los Tubos 1-8e incubar durante 10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C). </li><li> Añadir una cantidad de saturación de la anticuerpo (s) indicado en la Tabla 1 para los tubos 4, 5, 7, y 8 e incubar todas las muestras (tubos 1-8) para 30 min a temperatura ambiente y protegido de la luz. </li><li> Añadir 1,5 ml de HBSS BSA 1% a todas las muestras, sedimentar las células por centrifugación (5 min @ 400 xg) y se lava una vez con 1,5 ml de HBSS 1% de BSA, con aspiración cuidadosa para evitar la pérdida de células. </li><li> Resuspender cada muestra en 500 l de HBSS BSA 1%. Si se requiere de muestras a ser analizadas en el citómetro, transferir a un tubo de 12 x 75 mm de fondo redondo. Añadir 10 l de 100 ug / ml 7-AAD diario de las acciones de trabajo (véase la tabla de Reactivos) a los tubos 3, 6, 7 y 8, como se indica en la Tabla 1. Incubar en hielo durante 30 min antes de su uso en la configuración del citómetro de flujo y tinción de verificación (Paso 3). </li></ol> 3. Flujo de configuración del citómetro y Verificación de tinción <ol><li> Verifique que el flujo CytOMeter está funcionando correctamente, utilizando los procedimientos establecidos del laboratorio para el control de calidad diario. Verificar que las señales pueden ser fácilmente detectados en cada ventana de espectro para ser utilizado, y que las respuestas del detector son linealmente proporcionales a la intensidad de la señal en la ventana que se utilizará para la supervisión proliferación 14. </li><li> Adquirir FSC frente a SSC de datos para el tubo 1, utilizando escalas lineales de pantalla. Ajustar la amplificación de cada detector de tal manera que la población de linfocitos cae en el cuadrante inferior izquierdo de la gráfica de puntos, no está fuera de escala en cualquiera de los parámetros, y no se interrumpe debido a la umbralización. Recopilar datos sin sincronización FSC frente a SSC para todas las muestras en Plaza de 3,3 a 3,7. </li><li> Adquirir datos para el tubo 1, sin usar la compensación de color y escalas logarítmicas de visualización de los 4 detectores de fluorescencia. Ajuste de alta tensión de cada detector (HV) para colocar la autofluorescencia de los linfocitos no marcados en la escala con pocos / sin células se acumula en el primer canal. Establecer un límite de análisis para cada histogramacorrespondiente a la más brillante 2% de las células no teñidas. </li><li> El uso sin compensación de color y los ajustes de alto voltaje establecido en los pasos 3.2 y 3.3, la adquisición de datos para el tubo 2, recogiendo FSC, SSC y señales en los 4 detectores de fluorescencia. Para el detector usado para monitorear PKH26 fluorescencia, verificar que todas las células PKH26 pos aparecer en escala como un solo pico simétrico en la década 3 ª -4 ª, con pocas células / no en el último canal. Si hay varios picos o forma de los picos se sesga, repita el paso 1, con especial atención a la sal minimización y técnica de mezcla (Figura 2). Si es necesario, ajustar la concentración de colorante. </li><li> Uso de los parámetros establecidos en el paso 3.3, la adquisición de datos para el tubo 3, recogiendo FSC, SSC y señales en los 4 detectores de fluorescencia. Para el detector usado para monitorear 7-AAD fluorescencia, verificar que la 7-AAD células pos caer encima del límite de 2% establecida en el paso 3,3 (es decir, que las células no viables están bien resueltosviables a partir de 7-AAD células neg). </li><li> Uso de los parámetros establecidos en el paso 3.3, la adquisición de datos para el tubo 4, recogiendo FSC, SSC y señales en los 4 detectores de fluorescencia. Verifique que las células CD8 pos están bien resueltos a partir de células teñidas (es decir, la caída por encima del límite del 2% establecido en el paso 3.3 para el detector FITC). Repita con el tubo 5 y verificar que las células CD8 pos están bien resueltos a partir de células teñidas (es decir, la caída por encima del límite del 2% establecido en el paso 3.3 para el detector de APC). </li><li> Uso de la configuración establecida en el paso 3.3, adquirir datos para tubos 6, 7 y 8, recogiendo FSC, SSC y señales en los 4 detectores de fluorescencia. </li><li> Use los archivos en modo de lista recogidos para tubos 1-5 y el software de compensación de color para establecer un color se superponen matriz para cada fluorocromo en los detectores que se utilizan para controlar los tres fluorocromos otros. Aplicar esta matriz para el modo de lista de archivos para la muestra 6 y verificar que la presencia de PKH26 laboratorioeling no altera la capacidad de detectar 7-AAD células pos. </li><li> Aplica el color se superponen matriz de paso de 3,8 a modo de lista del archivo de muestra 7 y verifique que: a) 3 subpoblaciones bien resueltas (CD3 CD4 neg neg, CD3 CD4 neg pos CD3 y CD4 pos pos) se pueden identificar en un FITC frente a APC diagrama de puntos, y b) la presencia de anti-CD3-FITC y anti-CD4-APC no altera la capacidad de detectar 7-AAD células pos. Si la presencia de anti-CD3-FITC altera el límite superior 2% para los datos recogidos en el detector de PKH26, reajustar el límite según se requiera. </li><li> Aplicar la matriz de color se superponen desde el paso 3.8 para el modo de lista de archivos para la muestra 8. Si la presencia de PKH26 etiquetado altera el límite del 2% para el FITC, 7-AAD o detectores de APC de los establecidos mediante el control autofluorescencia en el paso 3.3, vuelva a ajustar el límite (s) según sea necesario utilizando Tube 7 de la Tabla 1 y verificar que Todavía es posible distinguish CD3 CD4 pos pos, pos CD3 CD4 neg, CD3 y CD4 neg neg células usando el límite ajustado (es). </li></ol> 4. Proliferación Selección del modelo para la Vigilancia división celular por dilución de colorante <ol><li> Determinar el espaciado entre generaciones, que es dependiente del número de canales y décadas logarítmica en el citómetro. Para los instrumentos digitales, este valor, típicamente 4 o 5 décadas, se determina por el número de contenedores en el procesador de señal digital. En los instrumentos analógicos, donde el número de décadas no suele ser un número entero, modelado preciso es el número exacto de décadas en ser determinado experimentalmente. Para hacer esto, los datos de una mezcla de perlas fluorescentes calibrados con el fabricante asignadas intensidades relativas se adquiere a la configuración del detector mismas de alta tensión utilizados en el experimento. La posición de los picos de talón permite la calibración de la escala logarítmica en términos de intensity rango por década registro. Específicamente, esto se hace mediante el trazado del número de canal para cada tipo de perla contra el tronco del fabricante asigna valor. La pendiente de una línea recta de mejor ajuste para los valores de datos de cuentas indica el número de unidades de intensidad relativa por canal. Multiplicado por el número de canales, entonces este valor será el número de décadas de registro para la escala completa, de la cual puede ser el número de canales que corresponden a una disminución de dos veces en la intensidad (es decir, el espaciamiento hija generación) calculado 14. </li><li> Decida si va a utilizar un espacio fijo entre generaciones o para permitir la separación de flotar. Un estándar (fijo) le permite utilizar el valor de separación generacional determinado en el paso 4.5 para asignar la ubicación de cada generación, y se suele utilizar cuando el histograma carece de picos distintos. Un valor flotante permite que cada posición de pico generacional a ser determinada por la forma de histograma y se usa típicamente cuando distinguishablpicos e intergeneracionales son evidentes. </li><li> Decida si va a utilizar un ancho pico fijo para todas las generaciones, o un ancho variable. Un ancho fijo utiliza el SD calculado para la muestra de control no estimulado para modelar todas las generaciones y se elige típicamente cuando la muestra carece de picos distinguibles generacionales. Una anchura variable permite que el programa para variar independientemente la SD para cada generación y se utiliza mejor con picos distinguibles generacionales. </li><li> Ejecute un programa que contiene un módulo de análisis de la proliferación (aquí ModFit LT Versión 3.3). Cargar el archivo estimulado PKH26 pos del conjunto de datos a analizar (por ejemplo, un cultivo estimulado 96 hr de células PKH26 pos contratiñeron como para el tubo 8 en la Tabla 1). </li><li> Seleccione los parámetros para el análisis, en este caso PKH26 (585/42) sobre cerrado viable (7-AAD neg) linfocitos CD3 POS y FSC frente a SSC para excluir los desechos pequeños y grandes agregados (Figura 3). En la definición deestas regiones tener cuidado de incluir la zona alta dispersión frontal donde se encuentran típicamente explosiones y CD3 en cuenta que la expresión puede ser modulada abajo en cultivos estimulados. </li><li> Crear un modelo de proliferación nuevo con el Asistente para la Proliferación. Uso del archivo de datos abiertos (ficha Inicio), cargue el archivo de control no estimulado PKH26 pos y definir la ubicación del canal de pico en la distribución parental correspondiente a las células indivisas. </li><li> Analizar el archivo de la no estimulada PKH26 pos de control, teniendo en cuenta los valores de la posición del pico parental y anchura (desviación estándar). Si una anchura de pico fijo (SD) se desea, comprobación de enganche SD. </li><li> Cargar el PKH26 neg control (por ejemplo, un cultivo de 96 h las células PKH26 neg contratiñeron como para el tubo 7 en la Tabla 1). Ajuste el número de generaciones por ajustar el canal de pico para la generación más oscuro encima del control PKH26 neg. Esto determina la numbre de las generaciones hijas el modelo puede encajar con precisión y es típicamente 6-9 generaciones. </li><li> Abrir el archivo de datos para la muestra estimulada (por ejemplo, un cultivo estimulado 96 hr de células PKH26 pos contratiñeron como para el tubo 8 en la Tabla 1) y confirmar que las regiones de la posición del pico parental y la SD tal como se define en el Paso 4,7 permanecen sin cambios. Si la distancia generacional fijo se desea, seleccione la opción Modelo estándar, de lo contrario seleccione la opción Flotante. </li><li> Analizar cada archivo experimental en el conjunto de datos, utilizando el mismo modelo definido en el Paso 4.9. Ajustes menores en la posición del pico parental puede ser necesario para el mejor ajuste tal como se define visualmente y por la reducción de chi cuadrado (RCS) de valor. </li><li> Registre los indicadores de proliferación deseados que resultan de la de mejor ajuste para cada archivo experimental en el conjunto de datos. Para una descripción completa de los posibles métricas ver Ref. 22. </li></ol>

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<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+cellular+proliferation+data%3A+Avoid+the+panglossian%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li>
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</ol>

K. Humphrey, JD Tario Jr., y Wallace PK han recibido pre-comerciales reactivos celulares de seguimiento para la evaluación de Life Technologies, Inc. y BD Biosciences. AD Bantly y JS Moore han recibido pre-comercial célula de seguimiento de los reactivos para la evaluación de Life Technologies, Inc. y la financiación de PTI Research, Inc. para la pre-comercial caracterización de células CellVue diversos seguimiento de los tintes. K. Muirhead es empleado por SciGro, Inc., que ofrece servicios de consultoría a las Tecnologías de Phanos, Inc. (propietaria de la PKH y tintes CellVue) y proporciona soporte de copia de seguridad técnica para Sigma-Aldrich y tecnologías de orientación molecular, Inc. (distribuidores de estos colorantes). La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Sigma-Aldrich.

Los métodos descritos aquí son las que se encuentran en nuestros laboratorios combinados para dar más fiabilidad óptimos resultados para el etiquetado hPBMC el uso de tintes membrana 13,16,18 y fenotipificación subconjunto de linfocitos y la proliferación de seguimiento utilizando tintes membrana o proteínas 2,11,13,16, 18. Como se ilustra en las Figuras 1 y 2, el etiquetado uniforme brillante es más fácilmente consigue limitando la presencia de sales fisiológicas y utilizando una técnica de mezcla que resulta en la exposición rápida y homogénea de todas las células a la misma concentración de colorante. Debido a que la tinción con colorantes de membrana se produce por el reparto en la bicapa lipídica, otras variables que alteran la concentración de colorante libre también puede afectar la eficiencia de etiquetado. Por ejemplo, el etiquetado en tubos de poliestireno de fondo redondo de resultados en menos eficiente lavado de las sales antes de la resuspensión en Diluyente C y también en menor concentración libre de tintes debido a la adsorción de colorante en las paredes del tubo, en particulara bajas concentraciones de colorante. Ambos factores tienden a dar más amplias distribuciones de tinción que cuando etiquetado se realiza utilizando tubos cónicos de polipropileno de fondo (Figuras 3, 4 y resultados sin publicar). Edad y tipo de muestra también pueden afectar la anchura del pico incluso cuando los procedimientos de tinción se utilizan optimizado. Por ejemplo, CV para PKH26 pos linfocitos aislados de sangre recién extraída rango de 14 a 20% (Figura 3, Ref. 13 y resultados no publicados), mientras que CV de los linfocitos aislados de 24 muestras de sangre hr viejos o rango TRIMA féresis filtros 25 a 30 % (Figura 4 y Ref. 18). La tinción uniformidad y la medida en que las células no viables pueden ser excluidos de análisis tanto afectar si los picos distinguibles hija son evidentes en el perfil de dilución de colorante, que a su vez influye en la elección de un modelo de proliferación para ajustar los datos observados (Figuras 5 y 6 </strong&gt;). Aunque ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) se usa aquí como un ejemplo de software usado para generar métricas como el índice de proliferación y frecuencia del precursor (Figuras 3, 5 y 6, Tabla 3), otros paquetes de software también contienen módulos para analizar datos de proliferación. Estos incluyen FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) y FlowJo (Árbol Star, Inc., Ashland, Oregón). Todos estos programas utilizan una no lineal de análisis de mínimos cuadrados para encontrar iterativamente el mejor ajuste a los datos en bruto, cambiando la posición, la altura y la SD (o anchura) de los picos Gaussianos que representan generaciones sucesivas hija. Índice de proliferación (IP) y la frecuencia de los precursores (PF) son las medidas más utilizadas de medida de la proliferación. PI, tal como se define por ModFit, es una medida del aumento de número de células durante el curso del ensayo, análogo a la &quot;índice de estimulación &#39;de un ensayo de absorción de timidina. PF devuelve la fracción de células en la populat inicialion que responden al estímulo de la proliferación. Se recomienda precaución, sin embargo, al leer la literatura desde la terminología varía un poco entre paquetes de software (por ejemplo, FlowJo y ModFit utilizan diferentes definiciones y cálculos de lo que se entiende por &quot;proliferación Index&quot;) 22. Los temas críticos discutidos aquí para el etiquetado y el análisis de proliferación con tintes de membrana también se encuentran cuando se utilizan colorantes proteicos. Por ejemplo, una cuidadosa atención a la técnica de mezcla también deben ser observadas, junto con la exclusión de células muertas / morir, con el fin de obtener distribuciones uniformes y picos distinguibles hija cuando se utiliza CFSE (Figura 6) 2-4,13,18,24. La elección apropiada de fluorocromos para fenotipado y evaluación de viabilidad es también importante para evitar excesivas solapamiento espectral y la incapacidad de reconocer las células positivas de anticuerpos, particularmente con tintes visibles emisores de proteína tales como CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. La reducción de la concentración de colorante de seguimiento disminuye los problemas de compensación en canales espectrales adyacentes pero también limita el número de divisiones celulares que pueden ser monitoreados antes de intensidades hija celulares comienzan a solaparse con la autofluorescencia. Alternativamente, el uso de tintes de células nuevas de rastreo tales como el emisor de Claret CellVue rojo lejano (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o violeta emisor de CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) puede reducir los problemas de compensación (Figura 6). Finalmente, aunque los colorantes de membrana en general tienden a exhibir una menor toxicidad 11,26, es posible sobre células de etiqueta ni con la clase de colorante. Por tanto, es siempre necesario verificar que la concentración de colorante de seguimiento utilizado no ha alterado la funcionalidad de las células para ser rastreados (Figura 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Comercialmente adquirida </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FBS) </td><td> Atlanta Biológicos </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> El calcio y el magnesio libre, sin rojo de fenol </td></tr><tr><td> IgG humana fracción Cohn II y III globulinas </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-CD3 humano-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Anti-ratón humanos CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-CD4 humano PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD8-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-CD19 humano-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; Saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD25-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> La saturación de concentración tal como se determina mediante valoración de laboratorio </td></tr><tr><td> Ratón anti-CD3 humano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azida libre </td></tr><tr><td> Ratón anti-CD28 humano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azida libre </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 rojo fluorescente de células kit de unión que contiene 10-3M PKH26 en EtOH y C Diluyente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT o MINI26-1KT </td><td> Procedimientos en el paso 1 se aplican tambiéna los kits que contienen PKH67 u otros colorantes CellVue </td></tr><tr><td> Claret CellVue mucho rojo fluorescente celular kit de unión que contiene 10-3M Claret CellVue en EtOH y C Diluyente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT o MIDCLARET 1KT- </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (y-6)-diacetato de carboxifluoresceína, succinimidil éster (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> No fluorescente; escindidos por esterasas de membrana para formar amino-reactivo fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Violet corregible </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Estéril 12 x 75 mm cónico tubos de polipropileno y gorras </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Da tinte mejor eficiencia de tinción de membrana (reducido adsorción de colorante, menos pérdida de células durante la aspiración sobrenadante) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round fondo tubos de poliestireno </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Cualquier citómetro capaz de detectar FITC, PKH26, y 7 AAD-(ex. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm, y 655 nm, respectivamente) y ex APC. 633-640 nm, em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII cian </td><td> Cualquier citómetro capaz de detectar FITC, PKH26, y 7 AAD-(ex. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm, y 655 nm, respectivamente) y ex APC. 633-640 nm, em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Laboratorio Preparado </td></tr><tr><td> 7 Aminoactinomycin D, caldo concentrado </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml en PBS. Congelar y almacenar en alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7 Aminoactinomycin D, worrey de stock </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 g / ml en PBS; preparar diariamente de 1 mg / ml stock congelado. </td></tr><tr><td> IgG bloque </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml de IgG humana fracción Cohn II y III globulinas + 10 mg / ml de BSA. </td></tr></tbody></table>

optimizado manchas y proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes división celular celulares de seguimiento

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Tintes fluorescentes seguimiento celulares, en combinación con el flujo y la citometría de imagen, son herramientas poderosas para estudiar las interacciones y destinos de los diferentes tipos de células in vitro e in vivo. 1-5 Aunque existen literalmente miles de publicaciones que utilizan estos colorantes, algunos de los las aplicaciones móviles más comunes de seguimiento incluyen la supervisión de: <ol><li> tallo y la quiescencia de células progenitoras, la proliferación y / o diferenciación 6-8 </li><li> antígeno impulsado por la membrana de transferencia 9 y / o la proliferación de células precursoras y 3,4,10-18 </li><li> inmune de células reguladoras y efectoras función 1,18-21. </li></ol> Tintes de células disponibles comercialmente de seguimiento varían ampliamente en sus composiciones químicas y propiedades de fluorescencia pero la gran mayoría de caída en una de dos clases basadas en su mecanismo de marcaje de las células. &quot;Tintes de membrana&quot;, tipificado por PKH26, son tintes altamente lipofílicas tsombrero de forma estable, pero de manera no covalente en las membranas celulares 1,2,11 partición. &quot;Tintes proteína&quot;, tipificado por CFSE, amino son los colorantes reactivos que forman enlaces covalentes estables con proteínas celulares 4,16,18. Cada clase tiene sus propias ventajas y limitaciones. La clave de su uso exitoso, especialmente en los estudios multicolor donde múltiples colorantes se utilizan para rastrear diferentes tipos de células, por lo tanto para entender los temas críticos que permitan el uso óptimo de cada clase 2-4,16,18,24. Los protocolos incluyen aquí destacar tres causas comunes de malos resultados o variable cuando se utiliza el seguimiento de células tintes. Estos son: <ol><li> Si no se consigue brillante, etiquetado uniforme y reproducible. Este es un punto de partida necesario para cualquier estudio de seguimiento de celda, pero requiere atención a las diferentes variables cuando se utilizan colorantes de membrana que cuando se utilizan colorantes de proteínas o reactivos de unión en equilibrio, tales como los anticuerpos. </li><li> Subóptimas combinaciones de fluorocromos unnd / o la no inclusión de controles críticos de compensación. El seguimiento de fluorescencia del colorante es típicamente 2 10-03 10 veces más brillante que la fluorescencia de anticuerpos. Por tanto, es esencial verificar que la presencia de un colorante de seguimiento no comprometer la capacidad de detectar otras sondas que se utilizan. </li><li> Si no se obtiene un buen ajuste con el software de modelado pico. Este tipo de software permite la comparación cuantitativa de los efectos proliferativos entre las diferentes poblaciones o estímulos basados ​​en la frecuencia o precursor otras métricas. La obtención de un buen ajuste, sin embargo, requiere la exclusión de muerto / muerte de las células que pueden distorsionar los perfiles de dilución de tinturas y congruencia de los supuestos que subyacen en el modelo con las características del perfil de tinte dilución observada. </li></ol> Ejemplos dados aquí ilustrar cómo estas variables pueden afectar a los resultados cuando se utiliza la membrana y / o tintes de proteínas para controlar la proliferación celular.

El uso exitoso de los tintes de seguimiento para controlar la función celular inmune celular y la proliferación implica varios pasos críticos. Se describen métodos para: 1) la obtención brillante, uniforme, reproducible etiqueta-ción con colorantes de membrana, 2) selección de fluorocromos y condiciones de adquisición de datos, y 3) la elección de un modelo para cuantificar la proliferación celular basada en la dilución de colorante.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Los colorantes fluorescentes de seguimiento celular, en combinación con la citometría de flujo y la citometría de imagen, son herramientas potentes para estudiar las interacciones y el destino de...

El objetivo general de este método es utilizar colorantes de rastreo celular para cuantificar directamente el grado de división celular en diferentes subpoblaciones de células inmunitarias dentro de poblaciones complejas. Esto se logra primero etiquetando la población parental de células con un colorante fluorescente conocido por generar un enlace estable con proteínas celulares o por intercalar de forma no covalente en las membranas celulares, para rastrear las células marcadas con el colorante que responden a la estimulación. Posteriormente, se realiza una tinción con anticuerpos fluorescentes y un análisis mediante citometría de flujo multiparamétrica, lo que permite detectar respuestas diferenciales entre los tipos de células inmunitarias de interés estimuladas. Sin embargo, se utilizan controles sin colorante de rastreo para establecer la intensidad de fluorescencia más baja de las células hijas que puede distinguirse de la autofluorescencia. Asimismo, se emplean controles marcados con el colorante de rastreo pero no estimulados para determinar la intensidad de fluorescencia a la cual se detectarán las células no divididas. La estimulación generalmente produce un amplio rango de intensidades, ya que las células que proliferan en respuesta se vuelven progresivamente más tenues, mientras que las células no respondedoras no lo hacen.En última instancia, el uso de software de modelado de picos para estimar la frecuencia relativa de las células en diferentes generaciones permite la comparación cuantitativa de las respuestas proliferativas entre distintas poblaciones o estímulos mediante métricas como el índice de proliferación o la frecuencia de precursores. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la incorporación de timidina tritiada o la expresión de KI 67 es que la dilución de DI proporciona una medida directa de la división celular que puede combinarse con otras mediciones citométricas de flujo como la inmunofenotipificación y la producción de citocinas. La demostración visual del método de tinción con colorante de membrana es útil, ya que la absorción del colorante por las células es extremadamente rápida.Por consiguiente, una buena técnica es clave para obtener una tinción homogénea y brillante. Después de aislar los leucocitos periféricos humanos, centrifugar durante cinco minutos a 300 ×g y temperatura ambiente para minimizar la contaminación por plaquetas. Luego, resuspender el sedimento a 10⁷ células por mililitro en HBSS más 1 % BSA y colocar en hielo.Retire y reserve 500 microlitros de Eloqua, luego transfiera otro alícuota de 500 microlitros de células a un tubo cónico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Añada 3,5 mililitros de HBSS y centrifugue las células durante cinco minutos a 400 × g y temperatura ambiente. Durante el lavado, añada 0,5 mililitros del vehículo de etiquetado diluyente C del kit PKH26 GL a otro tubo cónico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando no más de 15 a 25 microlitros de líquido residual y teniendo cuidado de no retirar ninguna célula. A continuación, añada 0,5 mililitros del vehículo de etiquetado diluyente C al sedimento celular y aspire y dispense la solución varias veces para obtener una suspensión de células individuales.Ahora prepare la solución stock 2XD añadiendo dos microlitros de PKH 26 al tubo que contiene el diluyente C. Inmediatamente pipete la suspensión celular en la solución recién preparada de colorante 2X PKH 26 y aspire y expulse simultáneamente la mezcla varias veces para dispersar uniformemente las células en todo el colorante. Después de un minuto, añada un mililitro de suero inactivado por calor para detener la incorporación del colorante en las membranas celulares. Tras centrifugar cuidadosamente las células, aspire el sobrenadante sin remover el botón celular.Luego, dispersar el sedimento en cuatro mililitros de medio completo que contenga suero inactivado por calor al 10%, y transferir la suspensión celular a un tubo nuevo de polipropileno. Lavar las células dos veces en HBSS más BSA al 1%: las células adecuadamente teñidas mostrarán un matiz rosado distintivo en el sedimento. Después de resuspender el sedimento celular en un mililitro de HBSS más BSA al 1%, contar las células y luego ajustar el volumen para obtener una concentración final de 10 a la séptima células por mililitro. Después de teñir las células según el protocolo de citometría de flujo descrito en la tabla, utilizar los primeros cinco tubos para ajustar los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral, así como las señales en los cuatro detectores de fluorescencia.En particular para el detector utilizado para monitorear la fluorescencia de PKH 26 en el tubo dos. Verifique que todas las células marcadas con PKH 26 aparezcan en la escala como un solo pico simétrico en la tercera a cuarta década, con pocas o ninguna célula en el último canal. A continuación, utilice el software de compensación de color y los archivos en modo de lista recopilados para los tubos uno a cinco para establecer una matriz de superposición de color para cada fluor en los detectores que se utilizan para monitorear los otros tres fluorocromos.Luego, aplique esta matriz al archivo en modo de lista para la muestra seis. Para verificar que la presencia de la marcación con PKH26 no altera la capacidad de detectar células positivas para siete A a D. Ahora, aplique esta matriz de superposición cromática recién establecida al archivo en modo de lista para el tubo siete.Identifique las poblaciones CD tres positivas CD cuatro negativas y CD tres positivas CD cuatro positivas en un gráfico FE versus PC. Confirme que la presencia de anti CD tres, FE y anti CD cuatro A PC no altera la capacidad de detectar células positivas para siete A a D. Finalmente, aplique la matriz de superposición de color para el tubo siete al archivo en modo lista del tubo ocho.Ahora abra un programa que contenga un módulo de análisis de proliferación. Cargue el archivo teñido con PKH26 estimulado del conjunto de datos que se va a analizar. A continuación, seleccione los parámetros para el análisis; en este caso, PKH26 compuerto en linfocitos viables, negativos para siete a a d y positivos para cd3, y dispersión directa frente a dispersión lateral para la exclusión de restos pequeños y agregados grandes.Al definir estas regiones, tenga cuidado de incluir el área de dispersión frontal alta donde normalmente se encuentran los blastos. A continuación, abra el asistente de proliferación. Haga clic en la pestaña de inicio para abrir el archivo de datos y luego cargue el control positivo no estimulado con PKH 26.Defina la ubicación del pico parental correspondiente a las células no divididas. Analice el archivo anotando los valores de la posición y el ancho del pico parental. Si se desea un ancho de pico fijo, active el bloqueo de la DS, cargue el control negativo P KH 26 y ajuste el número de generaciones estableciendo el canal del pico para la generación de células hijas débiles por encima de las células negativas para PKH 26.Esto establece el número de generaciones hijas. El modelo puede ajustarse con precisión al completarse. Recargue el archivo positivo PKH 26 estimulado.Si son evidentes picos generacionales distinguibles, elija la configuración flotante en la opción del modelo. Si las décadas logarítmicas no son exactamente 4,0, ajuste el espaciado generacional según se indica en el artículo. Ahora, analice la muestra estimulada y confirme que la región para la posición del pico parental permanece sin cambios.Finalmente, seleccione analizar para cada archivo experimental en el conjunto de datos al que se aplicará. El modelo recién creado registrará las métricas de proliferación deseadas resultantes del mejor ajuste para cada archivo experimental en el conjunto de datos. Esta primera serie de datos ilustra el efecto de la técnica de mezclado en las distribuciones de fluorescencia de PKH 26.Cuando se cultivaron, las células mieloides U 9 37 se tiñeron con el colorante de rastreo celular mediante el método recién descrito; este primer histograma muestra los datos del control sin teñir. Los ajustes del citómetro se modificaron para colocar la autofluorescencia de estas células en la primera década, con ninguna o muy pocas células acumuladas en el primer canal. Este segundo histograma ilustra una buena tinción con PKH 26.La mezcla rápida de dos x células con dos x colorante produjo una distribución de fluorescencia brillante, homogénea y simétrica, pero sin células fuera de escala en los ajustes del instrumento utilizados para el histograma anterior. Cuando se añadieron dos x células a dos x colorante sin mezclar inmediatamente, se obtuvo una distribución de fluorescencia más heterogénea. Esta pequeña subpoblación de células débilmente marcadas se interpretaría erróneamente como células hijas si estuvieran presentes en un punto temporal posterior en el histograma final de este experimento. Además, ocurrió una mala mezcla cuando tres microlitros de una solución concentrada de colorante en etanol se añadieron accidentalmente directamente a 0,5 mililitros de suspensión de dos x células, produciendo una distribución de intensidad de fluorescencia extremadamente débil y sesgada hacia la derecha.Aquí se muestran resultados típicos de un experimento de proliferación en el que se cultivaron células mononucleares de sangre periférica humana marcadas con PKH 20 con o sin reactivos estimulantes. Anti CD tres e IL dos. Después de 96 horas de cultivo, las células se recolectaron y contramarcharon con anti CD tres FE, anti CD 19 A PC y siete A a d.Se compararon dos estrategias de selección diferentes. En la primera estrategia de selección, se utilizó un diagrama de dispersión de CD tres versus siete A A D para seleccionar células T viables, negativas para siete A A D y positivas para CD tres. Luego, se utilizó una región de dispersión directa y lateral para excluir grandes agregados, incluyendo aún linfocitos en blastogénesis.Los eventos de R uno más R dos para el control sin teñir están representados por el histograma gris, y las células teñidas con PKH 26, pero no estimuladas, están en azul. Observe la tinción brillante, simétrica y homogénea para linfocitos T viables pero no divididos en el control no estimulado. Estos datos se seleccionaron de la misma manera que en la figura anterior, pero en este caso, las células fueron estimuladas con anti-CD tres e IL dos. El histograma de PKH 26 para los eventos seleccionados de R uno más R dos ahora contiene principalmente células divididas con intensidad reducida, representadas por picos de colores para cada generación hija.Aunque aún quedan algunas células brillantes no divididas en el pico parental azul. Observe que la intensidad de las células altamente divididas aún no se superpone con la región donde se miden las células no marcadas, lo que podría dificultar la estimación de métricas basadas en el número de células en las generaciones de hijas de menor intensidad aquí. Se analizaron los mismos datos que en los dos conjuntos anteriores de figuras, pero solo se utilizaron la dispersión de la luz y el CD tres para seleccionar linfocitos T viables.Esta estrategia de selección excluye a muchas, pero no a todas las células muertas, como lo demuestra la pequeña población residual de siete células muertas positivas para siete A a D que permanecen en los diagramas de dispersión de CD tres frente a siete A a D. La elección de fluorocromos utilizados para la inmunofenotipificación puede generar problemas de compensación difíciles cuando se emplean colorantes de rastreo celular, ya que la intensidad de tinción de las células no divididas es extremadamente brillante. En este experimento, células mononucleares de sangre periférica de 24 horas de antigüedad fueron marcadas con PKH 26 y luego contratenidas con anticuerpos contra CD tres y CD cuatro más un colorante de viabilidad.En esta serie de datos, las células marcadas con PKH 26 de dos micromolar se contratinaron con anti-CD tres FZ siete A a D y anti-CD cuatro A PC, y luego se analizaron utilizando la misma estrategia de selección R uno más R dos que antes. Debido a que hay poca superposición del PKH 26 en el canal A PC, los eventos positivos y negativos para CD cuatro se resolvieron claramente, con o sin compensación aplicada. Estos datos ilustran cómo las células T viables positivas para CD tres y positivas para CD cuatro permanecieron bien resueltas incluso cuando la concentración final de PKH 26 aumentó a cuatro micromolar. El uso de anti-CD cuatro per CP en combinación con anti-CD tres FE, PKH 26 de dos micromolar y el colorante de viabilidad pro tres dio resultados mucho peores debido a la superposición significativa del PKH 26 en el canal per CP.No fue posible separar las células positivas y negativas para CD4 entre sí en los datos sin compensar y solo se logró una resolución marginal cuando se aplicó la compensación. Aumentar la concentración final de PKH26 a cuatro micromolares provocó una pérdida completa de la capacidad de distinguir eventos CD4 positivos de eventos CD4 negativos, incluso después de aplicar la compensación. Observe cómo las muestras que incluían o carecían de anti-CD4 per CP fueron esencialmente idénticas.Cuando se analiza un perfil de dilución de colorante mediante software de modelado de picos para estimar la frecuencia de células en generaciones hijas sucesivas, las posiciones y/o anchos de los picos hijas sucesivos pueden mantenerse fijos o variables, con respecto a los valores del pico parental. Estos valores se estiman a partir del control no estimulado.Por ejemplo, este perfil de intensidad PKH26 proviene de un cultivo no estimulado de 96 horas de un respondedor moderado y se utilizó para proporcionar al asistente de proliferación Mod Fit la primera estimación de la posición y anchura del pico que representa las células parentales no divididas. El uso de una configuración fija para la posición del pico requiere que la media de cada pico generacional sea exactamente la mitad de la intensidad de fluorescencia del pico anterior. Una configuración flotante para la posición del pico permite que las posiciones finales de los picos generacionales varíen respecto a las intensidades esperadas según sea necesario para obtener el mejor ajuste.De manera similar, una configuración fija para el ancho del pico requiere que el ancho de cada pico generacional sea igual al del pico de control parental o no estimulado. Una configuración flotante para el ancho del pico permite que los anchos finales varíen independientemente según sea necesario para obtener el mejor ajuste en esta tabla. Se muestran los resultados de los análisis de las figuras anteriores para dos donantes diferentes, en aquellos donantes en los que eran evidentes picos generacionales distinguibles.Los mejores valores de chi cuadrado reducido se obtuvieron cuando se permitió que tanto la posición del pico como el ancho variaran en los perfiles de proliferación donde no son evidentes picos generacionales distinguibles; en tales casos, se recomienda un ajuste fijo para la posición del pico. Estos datos ilustran el uso de dos colorantes de rastreo para monitorear por separado las historias de proliferación de diferentes tipos de células inmunitarias en un ensayo de supresión inmunitaria por citometría de flujo. Las células T efectoras mostradas en verde fueron marcadas con CFSE y las células T reguladoras mostradas en azul fueron marcadas con cell view.Se mezclaron poblaciones celulares marcadas con clarete en diferentes proporciones y se cultivaron en presencia de anti-CD3, anti-CD28 y células accesorias irradiadas durante 96 horas. Posteriormente, las células se recolectaron y tiñeron con anti-CD4, PE-Cy7 y violeta para distinguir células muertas. Aquí se muestran datos representativos para una proporción de células Treg a células T efectoras de 0,25 a 1, tras la exclusión de células positivas para violeta para distinguir células muertas.Se aplicó una puerta de dispersión de la luz que incluía linfocitos y blastos, pero excluía agregados y restos celulares, seguida de una puerta para incluir eventos CD4 positivos. La tinción con clarete Cell View permitió distinguir fácilmente las células Treg viables de las células T efectoras viables, que estaban altamente proliferadas, y por lo tanto, los perfiles de proliferación CFSE tenue para las células T efectoras CFSE positivas y las células Treg positivas para clarete Cell View se analizaron mediante software de modelado de picos ModFit. Se analizaron aproximadamente 25.000 eventos.De estas, el 48 % eran linfocitos T efector viables, el 6 % eran linfocitos T reguladores viables y el resto eran células muertas, células accesorias y restos celulares. El índice de proliferación calculado, que refleja el incremento de la cantidad de células durante el período del ensayo, fue de 3,85 para los linfocitos T efector y de 1,83 para los linfocitos T reguladores. Aquí se muestra el efecto de la concentración de células T reguladoras sobre el índice de proliferación de las células T efector, calculado a partir del perfil de dilución del colorante CFSE.Los resultados fueron los mismos, ya fueran las células Treg marcadas con el colorante Cell View Claret o dejadas sin teñir, lo que indica que la función de las Treg no se alteró debido a la tinción. Al realizar el seguimiento, como era de esperar, el grado de proliferación de las células T efectoras aumentó a medida que disminuyó la concentración de células Treg. Los índices de proliferación de las células Treg también se calcularon a partir de los perfiles de dilución del colorante Cell View Claret en diferentes proporciones de células Treg respecto a células T efectoras.Como era de esperar, las células Treg experimentaron una proliferación mínima en ausencia de células efectoras T, a medida que aumentaba la concentración de células efectoras T. Sin embargo, el grado de proliferación de las células Treg también aumentó. Tras ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar con éxito colorantes de rastreo celular para monitorear la proliferación celular, cómo elegir fluorocromos y controles de compensación de color adecuados, y cómo seleccionar un modelo apropiado para cuantificar la división celular basado en la dilución del colorante.Junto con este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para responder preguntas experimentales, como la tinción de linfocitos T específicos para antígenos o la clasificación por citometría de flujo para el aislamiento de células con características de células madre que se encuentran en estado de quiescencia o división lenta. Muchas gracias por ver este video.

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