Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

El objetivo general de este método es utilizar tintes de seguimiento celular para cuantificar directamente el grado de división celular de diferentes subconjuntos de células inmunitarias dentro de poblaciones complejas. Esto se logra marcando primero la población de células madre con un colorante fluorescente que se sabe que proporciona una unión estable a las proteínas celulares o que se intercala de manera no covalente en las membranas celulares para rastrear las células marcadas con colorante que responden a los contadores de estimulación, la tinción con anticuerpos fluorescentes y el análisis mediante citometría de flujo multiparamétrica permite la detección de respuestas diferenciales entre los tipos de células inmunitarias de interés estimuladas. Pero los controles sin tinción con colorante de seguimiento se utilizan para establecer la intensidad de fluorescencia de la célula hija más baja que se puede distinguir del tinte de seguimiento de autofluorescencia marcado, pero los controles sin estimulación se utilizan para establecer la intensidad de fluorescencia a la que se detectarán las células no divididas. La estimulación suele dar lugar a una amplia gama de intensidades, ya que las células que proliferan en respuesta se vuelven progresivamente más tenues, pero las que no responden no lo hacen.

En última instancia, el uso de software de modelado de picos para estimar la frecuencia relativa de las células en diferentes generaciones puede permitir la comparación cuantitativa de las respuestas proliferativas en diferentes poblaciones o estímulos utilizando métricas como el índice de proliferación o la frecuencia de precursores. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el tritiado, la incorporación o la expresión de KI 67, es que la dilución de DI proporciona una medida directa de la división celular que puede combinarse con otras medidas de citometría de flujo de EM como el inmunofenotipado y la producción de citoquinas. La demostración visual del método de tinción con colorante de membrana es útil, ya que la absorción del tinte por las células es extremadamente rápida.

En consecuencia, una buena técnica es la clave para obtener una tinción brillante y homogénea. Después de aislar las células mononucleares de sangre periférica humana, centrifugar durante cinco minutos a 300 veces G y temperatura ambiente para minimizar la contaminación plaquetaria. A continuación, vuelva a suspender el pellet a 10 a la séptima celdas por mililitro en HBSS más 1%BSA, y colóquelos en hielo.

Retire y reserve un Eloqua de 500 microlitros, luego transfiera otras alícuotas de 500 microlitros de células a un tubo cónico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Añadir 3,5 mililitros de HBSS y centrifugar las pilas durante cinco minutos a 400 veces G y temperatura ambiente durante el lavado, añadir 0,5 mililitros de diluyente C del kit PKH 26 GL a otro tubo cónico de polipropileno de 12 por 75 mililitros, aspirar cuidadosamente la super natina sin dejar más de 15 a 25 microlitros de líquido residual y teniendo cuidado de no eliminar ninguna célula. A continuación, añada 0,5 mililitros de diluyente C marcando el pellet de celda y aspire y dispense la solución varias veces para obtener una suspensión de una sola célula.

Ahora prepare los dos caldos XD añadiendo dos microlitros de PKH 26 al tubo que contiene el diluyente C. Solo que ahora pipetee inmediatamente la suspensión celular en la solución de colorante XPKH 26 recién preparada y simultáneamente aspire y dispense la mezcla varias veces para dispersar uniformemente las células por todo el colorante. Después de un minuto, agregue un mililitro de suero inactivado por calor para detener la absorción del tinte en las membranas celulares. Después de girar las celdas, aspire cuidadosamente el sobrenadante sin quitar la bolita.

A continuación, disperse el pellet en cuatro mililitros de medio completo que contenga un 10% de suero inactivado por calor y transfiera la suspensión celular a un tubo de polipropileno nuevo. Lave las células dos veces en HBSS más 1% BSA, las células adecuadamente teñidas exhibirán un tinte rosado distintivo en el pellet Después de resus suspender el pellet de células en un mililitro de HBSS más 1% BSA, cuente las células y luego ajuste el volumen para dar una concentración final de 10 a la séptima célula por mililitro. Después de teñir las células de acuerdo con el protocolo de citometría de flujo descrito en la tabla, utilice los primeros cinco tubos para establecer los parámetros de dispersión directa y lateral y las señales en los cuatro detectores de fluorescencia.

En particular, para el detector utilizado para monitorear la fluorescencia PKH 26 en el tubo dos. Verifique que todas las células teñidas con PKH 26 aparezcan en la escala como un solo pico simétrico en la tercera o cuarta década, con pocas o ninguna célula en el último canal. A continuación, utilice el software de compensación de color y los archivos de modo de lista recopilados para los tubos del uno al cinco para establecer una matriz de superposición de color para cada fluro en los detectores que se utilizan para monitorear los otros tres fluorocromos.

A continuación, aplique esta matriz al archivo de modo de lista para la muestra seis. Verificar que la presencia de marcaje PKH 26 no altera la capacidad de detectar siete células A a D positivas. Ahora aplique esta matriz de superposición de color recién establecida al archivo de modo de lista para el tubo siete.

Identifique las poblaciones CD tres positivas CD cuatro negativas y CD tres CD cuatro positivas en una gráfica de FE frente a una de PC. Confirmar que la presencia de PC anti CD tres, FE y anti CD cuatro A no altera la capacidad de detectar siete células A a D positivas. Finalmente, aplique la matriz de superposición de color para el tubo siete al modo de lista Archivo para el tubo ocho.

Ahora abra un programa que contenga un módulo de análisis de proliferación. Cargue el archivo tincionado PKH 26 estimulado del conjunto de datos que se va a analizar. A continuación, seleccione los parámetros para el análisis en este caso, PKH 26 activado en siete cd negativos viables, tres linfocitos positivos y dispersión directa frente a dispersión lateral para la exclusión de residuos pequeños y agregados grandes.

Al definir estas regiones, tenga cuidado de incluir el área de dispersión frontal alta donde normalmente se encuentran las voladuras. A continuación, abra el asistente de proliferación. Haga clic en la pestaña de inicio para abrir el archivo de datos y, a continuación, cargue el control positivo PKH 26 no estimulado.

Defina la ubicación del pico parental correspondiente a las celdas indivisas. Analice el archivo anotando los valores de la posición y el ancho del pico principal. Si se desea un ancho de pico fijo, marque el bloqueo SD de carga del control negativo P KH 26 y ajuste el número de generaciones configurando el canal de pico para la generación hija dimus por encima de las celdas negativas PKH 26.

Esto establece el número de generaciones hijas. El modelo puede ajustarse con precisión cuando está terminado. Vuelva a cargar el archivo PKH 26 positivo estimulado.

Si los picos generacionales distinguibles son evidentes, elija la configuración flotante en la opción de modelo. Si las décadas logarítmicas no son exactamente 4.0, ajuste el espaciado generacional como se explica en el artículo. Ahora, analice la muestra estimulada y confirme que la región para la posición del pico parental permanece sin cambios.

Por último, seleccione analizar para cada archivo experimental del conjunto de datos que desee aplicar. El modelo acaba de crear y registrar las métricas de proliferación deseadas que resultan del mejor ajuste para cada archivo experimental en el conjunto de datos. Esta primera serie de datos ilustra el efecto de la técnica de mezcla en las distribuciones de fluorescencia de PKH 26.

Cuando se cultivaron, las células mieloides U 9 37 se tiñeron con el colorante de seguimiento celular utilizando el método que se acaba de describir. La configuración del citómetro se ajustó para colocar la autofluorescencia de estas células en la primera década sin que se acumulara ninguna o muy pocas células en el primer canal. Este segundo histograma ilustra una buena tinción de PKH 26.

La mezcla rápida de dos células x con dos colorantes x dio una distribución de fluorescencia brillante, homogénea y simétrica, pero no tenía células fuera de escala en la configuración del instrumento utilizada para el histograma anterior. Cuando se añadieron dos células x a dos colorantes x sin mezcla inmediata, se obtuvo una distribución de fluorescencia más heterogénea. Esta pequeña subpoblación de células débilmente marcadas se interpretaría erróneamente como células hijas si estuvieran presentes en un punto de tiempo posterior en el histograma final de este experimento, también se produjo una mala mezcla cuando se agregaron accidentalmente tres microlitros de caldo de tinte de etanol concentrado directamente a 0,5 mililitros de suspensión de dos celdas x, lo que produjo una distribución de intensidad de fluorescencia extremadamente tenue y sesgada a la derecha.

Aquí, resultados típicos de un experimento de proliferación en el que se cultivaron células mononucleares de sangre periférica humana teñidas con PKH 20 con o sin estimulación. Se muestran los reactivos Anti CD tres e IL dos. Después de 96 horas de cultivo, las células se recolectaron y se contratinieron con tres FE anti CD 19 A PC y siete A a d.

Se compararon dos estrategias de compuerta diferentes en la primera estrategia de compuerta, Un diagrama de puntos de CD tres frente a siete. Se utilizó un A D para seleccionar siete células T positivas CD negativas vivas y tres células T positivas. A continuación, se utilizó una región de dispersión frontal y lateral para expulsar los agregados grandes sin dejar de incluir los linfocitos blasting.

Los eventos R uno más R dos para el control no teñido están representados por el histograma gris y las células PKH 26 teñidas, pero no estimuladas están en nota azul, la tinción homogénea simétrica brillante para las células T viables pero no divididas en el control no estimulado. Estos datos se comprobaron de la misma manera que en la figura anterior, pero en este caso, las células se estimularon con anti CD tres e IL dos. El histograma PKH 26 para eventos cerrados R uno más R dos ahora contiene principalmente celdas divididas con intensidad reducida representadas por picos coloreados para cada generación hija.

Aunque todavía quedan algunas células brillantes indivisas en el pico parental azul. Tenga en cuenta que la intensidad de las células altamente divididas aún no se superpone con la región donde se miden las células no teñidas, lo que confundiría la estimación de las métricas basadas en el número de células en las generaciones hijas de menor intensidad aquí. Se analizaron los mismos datos que los dos conjuntos de figuras anteriores, pero solo se utilizaron la dispersión de luz y el CD tres para seleccionar las células T viables.

Esta estrategia de compuerta excluye muchas, pero no todas, las células muertas, como lo demuestra la pequeña población residual de siete células muertas A A D positivas que quedan en los diagramas de puntos CD tres frente a siete A A D. La elección de los fluorocromos utilizados para el inmunofenotipado puede crear problemas de compensación desafiantes cuando se utilizan troqueles de seguimiento celular, ya que la intensidad de tinción de las células indivisas es extremadamente brillante. En este experimento, las células mononucleares de sangre periférica de 24 horas de edad se marcaron con PKH 26 y luego se contratinieron con anticuerpos contra CD tres y CD cuatro más un colorante de viabilidad.

En esta serie de datos, las células marcadas con dos micromolares PKH 26 fueron contrateticidas con anti CD tres FZ siete A a D, y anti CD cuatro A PC, y luego se analizaron utilizando la misma estrategia de compuerta R uno más R dos que antes, porque hay poca superposición de PKH 26 en el canal A PC, Los eventos positivos y negativos de la CD cuatro se resolvieron claramente, independientemente de que se aplicara o no la compensación. Estos datos ilustran cómo los linfocitos T positivos CD tres CD cuatro positivos viables permanecieron bien resueltos incluso cuando la concentración final de PKH 26 se incrementó a cuatro micromolares. El uso de anti CD cuatro por CP en combinación con anti CD tres FE dos micromolares PKH 26 y la matriz de viabilidad a pro tres dio resultados mucho más pobres debido a la superposición significativa de PKH 26 en el canal por CP.

Las celdas positivas y negativas de CD cuatro no pudieron resolverse entre sí en los datos no compensados y solo se resolvieron marginalmente cuando se aplicó la compensación. El aumento de la concentración final de PKH 26 a cuatro micromolares resultó en una pérdida completa de la capacidad de resolver los eventos CD cuatro positivos a partir de CD cuatro negativos, incluso después de aplicar la compensación. Obsérvese cómo las muestras que incluían o no anti CD cuatro por CP eran esencialmente idénticas.

Cuando se analiza un perfil de dilución de colorante utilizando un software de modelado de picos para estimar la frecuencia de las células en generaciones hijas sucesivas, las posiciones y/o anchos de los picos hijos sucesivos pueden ser fijas o flotantes. Con respecto a los valores para el pico parental. Estos valores se estiman a partir del control no estimulado.

Por ejemplo, este perfil de intensidad de PKH 26 proviene de un cultivo no estimulado de 96 horas de un respondedor moderado y se utilizó para proporcionar al asistente de proliferación mod fit la primera estimación de la posición y la anchura del pico que representa las células parentales indivisas. El uso de un ajuste fijo para la posición del pico requiere que la media de cada pico generacional sea exactamente la mitad de la intensidad de fluorescencia del pico anterior. Un ajuste de flotación para la posición de los picos permite que las posiciones finales de los picos generacionales varíen de las intensidades esperadas según sea necesario para obtener el mejor ajuste.

Del mismo modo, un ajuste fijo para la anchura del pico requiere que la anchura de cada pico generacional sea la misma que la del pico de control parental o no estimulado. Un ajuste de flotación para el ancho del pico permite que los anchos finales se varíen de forma independiente según sea necesario para obtener el mejor ajuste en esta tabla. Se muestran los resultados de los análisis de las cifras anteriores para dos donantes diferentes para estos donantes en los que se evidenciaron picos generacionales distinguibles.

Los mejores valores de chi cuadrado reducidos se obtuvieron cuando se permitió que tanto la posición del pico como la anchura flotaran para los perfiles de proliferación en los que no son evidentes picos generacionales distinguibles, se recomienda un ajuste fijo para la posición del pico. Estos datos ilustran el uso de dos tintes de seguimiento para monitorizar por separado las historias de proliferación de diferentes tipos de células inmunitarias en un ensayo de inmunosupresión por citometría de flujo. Las células T efectoras que se muestran en verde se marcaron con CFSE y las células T reguladoras que se muestran en azul se marcaron con la vista de células.

Las poblaciones de células marcadas con Claret se mezclaron en diferentes proporciones y se cultivaron en presencia de células accesorias irradiadas y anti CD 3, anti CD 28 e irradiadas. A continuación, se recolectaron células y se tiñeron con anti CD cuatro, PE tamaño siete y violeta muerta viva. Aquí. Se muestran datos representativos de una relación efectora treg a T de 0,25 a uno después de la extracción de células vivas muertas violetas positivas.

Se aplicó una puerta de dispersión de luz que incluía linfocitos y blastos, pero excluía agregados y desechos, seguida de una puerta para incluir eventos positivos para CD cuatro. La tinción de clarete permitió distinguir fácilmente las células treg viables de las células efectoras T viables que estaban altamente proliferadas y, por lo tanto, los perfiles de proliferación DIM de CFSE para las células efectoras T positivas de CFSE y las células treg positivas de clarete de vista celular se analizaron utilizando el software de modelado de picos mod fit. Se analizaron aproximadamente 25.000 eventos.

De estos, el 48% eran efectores T viables, el 6% eran T regs viables y el resto eran células muertas, células accesorias y desechos. El índice de proliferación calculado, que refleja el aumento del número de células durante el período de ensayo, fue de 3,85 para los efectores T y de 1,83 para las Tregs. Aquí, se muestra el efecto de la concentración de células tregs sobre el índice de proliferación de las células T efectoras calculado a partir del perfil de dilución del colorante CFSE.

Los resultados fueron los mismos, ya sea que las células treg se marcaran con clarete de vista celular o se dejaran sin teñir, lo que indica que la función de treg no se alteró con la tinción. Con el seguimiento como se esperaba, el grado de proliferación de tectores aumentó a medida que disminuyó la concentración de células treg. También se calcularon los índices de proliferación de células Treg a partir de los perfiles de dilución del colorante clarete a diferentes proporciones de efectores Treg a T.

Como era de esperar, las Tregs experimentaron una proliferación mínima en ausencia de células T efectoras a medida que aumentaba la concentración de células T efectoras. Sin embargo, el grado de proliferación de las células treg también aumentó. Después de ver el video, debe tener una buena comprensión de cómo usar con éxito los tintes de seguimiento celular para monitorear la proliferación celular, cómo elegir los fluorocromos apropiados y los controles de compensación de color, y cómo seleccionar un modelo apropiado para cuantificar la división celular en función de la dilución del colorante.

Junto con este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para responder a preguntas experimentales, como la tinción de células T específicas de antígeno o la clasificación de flujo para la recuperación de células madre que están inactivas o se dividen lentamente. Muchas gracias por mirar.