Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

El objetivo general de este método es utilizar colorantes de rastreo celular para cuantificar directamente el grado de división celular en diferentes subpoblaciones de células inmunitarias dentro de poblaciones complejas. Esto se logra primero etiquetando la población parental de células con un colorante fluorescente conocido por generar un enlace estable con proteínas celulares o por intercalar de forma no covalente en las membranas celulares, para rastrear las células marcadas con el colorante que responden a la estimulación. Posteriormente, se realiza una tinción con anticuerpos fluorescentes y un análisis mediante citometría de flujo multiparamétrica, lo que permite detectar respuestas diferenciales entre los tipos de células inmunitarias de interés estimuladas. Sin embargo, se utilizan controles sin colorante de rastreo para establecer la intensidad de fluorescencia más baja de las células hijas que puede distinguirse de la autofluorescencia. Asimismo, se emplean controles marcados con el colorante de rastreo pero no estimulados para determinar la intensidad de fluorescencia a la cual se detectarán las células no divididas. La estimulación generalmente produce un amplio rango de intensidades, ya que las células que proliferan en respuesta se vuelven progresivamente más tenues, mientras que las células no respondedoras no lo hacen.

En última instancia, el uso de software de modelado de picos para estimar la frecuencia relativa de las células en diferentes generaciones permite la comparación cuantitativa de las respuestas proliferativas entre distintas poblaciones o estímulos mediante métricas como el índice de proliferación o la frecuencia de precursores. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la incorporación de timidina tritiada o la expresión de KI 67 es que la dilución de DI proporciona una medida directa de la división celular que puede combinarse con otras mediciones citométricas de flujo como la inmunofenotipificación y la producción de citocinas. La demostración visual del método de tinción con colorante de membrana es útil, ya que la absorción del colorante por las células es extremadamente rápida.

Por consiguiente, una buena técnica es clave para obtener una tinción homogénea y brillante. Después de aislar los leucocitos periféricos humanos, centrifugar durante cinco minutos a 300 ×g y temperatura ambiente para minimizar la contaminación por plaquetas. Luego, resuspender el sedimento a 10⁷ células por mililitro en HBSS más 1 % BSA y colocar en hielo.

Retire y reserve 500 microlitros de Eloqua, luego transfiera otro alícuota de 500 microlitros de células a un tubo cónico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Añada 3,5 mililitros de HBSS y centrifugue las células durante cinco minutos a 400 × g y temperatura ambiente. Durante el lavado, añada 0,5 mililitros del vehículo de etiquetado diluyente C del kit PKH26 GL a otro tubo cónico de polipropileno de 12 por 75 milímetros. Aspire cuidadosamente el sobrenadante, dejando no más de 15 a 25 microlitros de líquido residual y teniendo cuidado de no retirar ninguna célula. A continuación, añada 0,5 mililitros del vehículo de etiquetado diluyente C al sedimento celular y aspire y dispense la solución varias veces para obtener una suspensión de células individuales.

Ahora prepare la solución stock 2XD añadiendo dos microlitros de PKH 26 al tubo que contiene el diluyente C. Inmediatamente pipete la suspensión celular en la solución recién preparada de colorante 2X PKH 26 y aspire y expulse simultáneamente la mezcla varias veces para dispersar uniformemente las células en todo el colorante. Después de un minuto, añada un mililitro de suero inactivado por calor para detener la incorporación del colorante en las membranas celulares. Tras centrifugar cuidadosamente las células, aspire el sobrenadante sin remover el botón celular.

Luego, dispersar el sedimento en cuatro mililitros de medio completo que contenga suero inactivado por calor al 10%, y transferir la suspensión celular a un tubo nuevo de polipropileno. Lavar las células dos veces en HBSS más BSA al 1%: las células adecuadamente teñidas mostrarán un matiz rosado distintivo en el sedimento. Después de resuspender el sedimento celular en un mililitro de HBSS más BSA al 1%, contar las células y luego ajustar el volumen para obtener una concentración final de 10 a la séptima células por mililitro. Después de teñir las células según el protocolo de citometría de flujo descrito en la tabla, utilizar los primeros cinco tubos para ajustar los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral, así como las señales en los cuatro detectores de fluorescencia.

En particular para el detector utilizado para monitorear la fluorescencia de PKH 26 en el tubo dos. Verifique que todas las células marcadas con PKH 26 aparezcan en la escala como un solo pico simétrico en la tercera a cuarta década, con pocas o ninguna célula en el último canal. A continuación, utilice el software de compensación de color y los archivos en modo de lista recopilados para los tubos uno a cinco para establecer una matriz de superposición de color para cada fluor en los detectores que se utilizan para monitorear los otros tres fluorocromos.

Luego, aplique esta matriz al archivo en modo de lista para la muestra seis. Para verificar que la presencia de la marcación con PKH26 no altera la capacidad de detectar células positivas para siete A a D. Ahora, aplique esta matriz de superposición cromática recién establecida al archivo en modo de lista para el tubo siete.

Identifique las poblaciones CD tres positivas CD cuatro negativas y CD tres positivas CD cuatro positivas en un gráfico FE versus PC. Confirme que la presencia de anti CD tres, FE y anti CD cuatro A PC no altera la capacidad de detectar células positivas para siete A a D. Finalmente, aplique la matriz de superposición de color para el tubo siete al archivo en modo lista del tubo ocho.

Ahora abra un programa que contenga un módulo de análisis de proliferación. Cargue el archivo teñido con PKH26 estimulado del conjunto de datos que se va a analizar. A continuación, seleccione los parámetros para el análisis; en este caso, PKH26 compuerto en linfocitos viables, negativos para siete a a d y positivos para cd3, y dispersión directa frente a dispersión lateral para la exclusión de restos pequeños y agregados grandes.

Al definir estas regiones, tenga cuidado de incluir el área de dispersión frontal alta donde normalmente se encuentran los blastos. A continuación, abra el asistente de proliferación. Haga clic en la pestaña de inicio para abrir el archivo de datos y luego cargue el control positivo no estimulado con PKH 26.

Defina la ubicación del pico parental correspondiente a las células no divididas. Analice el archivo anotando los valores de la posición y el ancho del pico parental. Si se desea un ancho de pico fijo, active el bloqueo de la DS, cargue el control negativo P KH 26 y ajuste el número de generaciones estableciendo el canal del pico para la generación de células hijas débiles por encima de las células negativas para PKH 26.

Esto establece el número de generaciones hijas. El modelo puede ajustarse con precisión al completarse. Recargue el archivo positivo PKH 26 estimulado.

Si son evidentes picos generacionales distinguibles, elija la configuración flotante en la opción del modelo. Si las décadas logarítmicas no son exactamente 4,0, ajuste el espaciado generacional según se indica en el artículo. Ahora, analice la muestra estimulada y confirme que la región para la posición del pico parental permanece sin cambios.

Finalmente, seleccione analizar para cada archivo experimental en el conjunto de datos al que se aplicará. El modelo recién creado registrará las métricas de proliferación deseadas resultantes del mejor ajuste para cada archivo experimental en el conjunto de datos. Esta primera serie de datos ilustra el efecto de la técnica de mezclado en las distribuciones de fluorescencia de PKH 26.

Cuando se cultivaron, las células mieloides U 9 37 se tiñeron con el colorante de rastreo celular mediante el método recién descrito; este primer histograma muestra los datos del control sin teñir. Los ajustes del citómetro se modificaron para colocar la autofluorescencia de estas células en la primera década, con ninguna o muy pocas células acumuladas en el primer canal. Este segundo histograma ilustra una buena tinción con PKH 26.

La mezcla rápida de dos x células con dos x colorante produjo una distribución de fluorescencia brillante, homogénea y simétrica, pero sin células fuera de escala en los ajustes del instrumento utilizados para el histograma anterior. Cuando se añadieron dos x células a dos x colorante sin mezclar inmediatamente, se obtuvo una distribución de fluorescencia más heterogénea. Esta pequeña subpoblación de células débilmente marcadas se interpretaría erróneamente como células hijas si estuvieran presentes en un punto temporal posterior en el histograma final de este experimento. Además, ocurrió una mala mezcla cuando tres microlitros de una solución concentrada de colorante en etanol se añadieron accidentalmente directamente a 0,5 mililitros de suspensión de dos x células, produciendo una distribución de intensidad de fluorescencia extremadamente débil y sesgada hacia la derecha.

Aquí se muestran resultados típicos de un experimento de proliferación en el que se cultivaron células mononucleares de sangre periférica humana marcadas con PKH 20 con o sin reactivos estimulantes. Anti CD tres e IL dos. Después de 96 horas de cultivo, las células se recolectaron y contramarcharon con anti CD tres FE, anti CD 19 A PC y siete A a d.

Se compararon dos estrategias de selección diferentes. En la primera estrategia de selección, se utilizó un diagrama de dispersión de CD tres versus siete A A D para seleccionar células T viables, negativas para siete A A D y positivas para CD tres. Luego, se utilizó una región de dispersión directa y lateral para excluir grandes agregados, incluyendo aún linfocitos en blastogénesis.

Los eventos de R uno más R dos para el control sin teñir están representados por el histograma gris, y las células teñidas con PKH 26, pero no estimuladas, están en azul. Observe la tinción brillante, simétrica y homogénea para linfocitos T viables pero no divididos en el control no estimulado. Estos datos se seleccionaron de la misma manera que en la figura anterior, pero en este caso, las células fueron estimuladas con anti-CD tres e IL dos. El histograma de PKH 26 para los eventos seleccionados de R uno más R dos ahora contiene principalmente células divididas con intensidad reducida, representadas por picos de colores para cada generación hija.

Aunque aún quedan algunas células brillantes no divididas en el pico parental azul. Observe que la intensidad de las células altamente divididas aún no se superpone con la región donde se miden las células no marcadas, lo que podría dificultar la estimación de métricas basadas en el número de células en las generaciones de hijas de menor intensidad aquí. Se analizaron los mismos datos que en los dos conjuntos anteriores de figuras, pero solo se utilizaron la dispersión de la luz y el CD tres para seleccionar linfocitos T viables.

Esta estrategia de selección excluye a muchas, pero no a todas las células muertas, como lo demuestra la pequeña población residual de siete células muertas positivas para siete A a D que permanecen en los diagramas de dispersión de CD tres frente a siete A a D. La elección de fluorocromos utilizados para la inmunofenotipificación puede generar problemas de compensación difíciles cuando se emplean colorantes de rastreo celular, ya que la intensidad de tinción de las células no divididas es extremadamente brillante. En este experimento, células mononucleares de sangre periférica de 24 horas de antigüedad fueron marcadas con PKH 26 y luego contratenidas con anticuerpos contra CD tres y CD cuatro más un colorante de viabilidad.

En esta serie de datos, las células marcadas con PKH 26 de dos micromolar se contratinaron con anti-CD tres FZ siete A a D y anti-CD cuatro A PC, y luego se analizaron utilizando la misma estrategia de selección R uno más R dos que antes. Debido a que hay poca superposición del PKH 26 en el canal A PC, los eventos positivos y negativos para CD cuatro se resolvieron claramente, con o sin compensación aplicada. Estos datos ilustran cómo las células T viables positivas para CD tres y positivas para CD cuatro permanecieron bien resueltas incluso cuando la concentración final de PKH 26 aumentó a cuatro micromolar. El uso de anti-CD cuatro per CP en combinación con anti-CD tres FE, PKH 26 de dos micromolar y el colorante de viabilidad pro tres dio resultados mucho peores debido a la superposición significativa del PKH 26 en el canal per CP.

No fue posible separar las células positivas y negativas para CD4 entre sí en los datos sin compensar y solo se logró una resolución marginal cuando se aplicó la compensación. Aumentar la concentración final de PKH26 a cuatro micromolares provocó una pérdida completa de la capacidad de distinguir eventos CD4 positivos de eventos CD4 negativos, incluso después de aplicar la compensación. Observe cómo las muestras que incluían o carecían de anti-CD4 per CP fueron esencialmente idénticas.

Cuando se analiza un perfil de dilución de colorante mediante software de modelado de picos para estimar la frecuencia de células en generaciones hijas sucesivas, las posiciones y/o anchos de los picos hijas sucesivos pueden mantenerse fijos o variables, con respecto a los valores del pico parental. Estos valores se estiman a partir del control no estimulado.

Por ejemplo, este perfil de intensidad PKH26 proviene de un cultivo no estimulado de 96 horas de un respondedor moderado y se utilizó para proporcionar al asistente de proliferación Mod Fit la primera estimación de la posición y anchura del pico que representa las células parentales no divididas. El uso de una configuración fija para la posición del pico requiere que la media de cada pico generacional sea exactamente la mitad de la intensidad de fluorescencia del pico anterior. Una configuración flotante para la posición del pico permite que las posiciones finales de los picos generacionales varíen respecto a las intensidades esperadas según sea necesario para obtener el mejor ajuste.

De manera similar, una configuración fija para el ancho del pico requiere que el ancho de cada pico generacional sea igual al del pico de control parental o no estimulado. Una configuración flotante para el ancho del pico permite que los anchos finales varíen independientemente según sea necesario para obtener el mejor ajuste en esta tabla. Se muestran los resultados de los análisis de las figuras anteriores para dos donantes diferentes, en aquellos donantes en los que eran evidentes picos generacionales distinguibles.

Los mejores valores de chi cuadrado reducido se obtuvieron cuando se permitió que tanto la posición del pico como el ancho variaran en los perfiles de proliferación donde no son evidentes picos generacionales distinguibles; en tales casos, se recomienda un ajuste fijo para la posición del pico. Estos datos ilustran el uso de dos colorantes de rastreo para monitorear por separado las historias de proliferación de diferentes tipos de células inmunitarias en un ensayo de supresión inmunitaria por citometría de flujo. Las células T efectoras mostradas en verde fueron marcadas con CFSE y las células T reguladoras mostradas en azul fueron marcadas con cell view.

Se mezclaron poblaciones celulares marcadas con clarete en diferentes proporciones y se cultivaron en presencia de anti-CD3, anti-CD28 y células accesorias irradiadas durante 96 horas. Posteriormente, las células se recolectaron y tiñeron con anti-CD4, PE-Cy7 y violeta para distinguir células muertas. Aquí se muestran datos representativos para una proporción de células Treg a células T efectoras de 0,25 a 1, tras la exclusión de células positivas para violeta para distinguir células muertas.

Se aplicó una puerta de dispersión de la luz que incluía linfocitos y blastos, pero excluía agregados y restos celulares, seguida de una puerta para incluir eventos CD4 positivos. La tinción con clarete Cell View permitió distinguir fácilmente las células Treg viables de las células T efectoras viables, que estaban altamente proliferadas, y por lo tanto, los perfiles de proliferación CFSE tenue para las células T efectoras CFSE positivas y las células Treg positivas para clarete Cell View se analizaron mediante software de modelado de picos ModFit. Se analizaron aproximadamente 25.000 eventos.

De estas, el 48 % eran linfocitos T efector viables, el 6 % eran linfocitos T reguladores viables y el resto eran células muertas, células accesorias y restos celulares. El índice de proliferación calculado, que refleja el incremento de la cantidad de células durante el período del ensayo, fue de 3,85 para los linfocitos T efector y de 1,83 para los linfocitos T reguladores. Aquí se muestra el efecto de la concentración de células T reguladoras sobre el índice de proliferación de las células T efector, calculado a partir del perfil de dilución del colorante CFSE.

Los resultados fueron los mismos, ya fueran las células Treg marcadas con el colorante Cell View Claret o dejadas sin teñir, lo que indica que la función de las Treg no se alteró debido a la tinción. Al realizar el seguimiento, como era de esperar, el grado de proliferación de las células T efectoras aumentó a medida que disminuyó la concentración de células Treg. Los índices de proliferación de las células Treg también se calcularon a partir de los perfiles de dilución del colorante Cell View Claret en diferentes proporciones de células Treg respecto a células T efectoras.

Como era de esperar, las células Treg experimentaron una proliferación mínima en ausencia de células efectoras T, a medida que aumentaba la concentración de células efectoras T. Sin embargo, el grado de proliferación de las células Treg también aumentó. Tras ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar con éxito colorantes de rastreo celular para monitorear la proliferación celular, cómo elegir fluorocromos y controles de compensación de color adecuados, y cómo seleccionar un modelo apropiado para cuantificar la división celular basado en la dilución del colorante.

Junto con este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para responder preguntas experimentales, como la tinción de linfocitos T específicos para antígenos o la clasificación por citometría de flujo para el aislamiento de células con características de células madre que se encuentran en estado de quiescencia o división lenta. Muchas gracias por ver este video.