Name: Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Aprende a comparar tres métodos de proliferación celular en líneas de cáncer de mama MCF-7: conteo manual, luminiscencia e imagen celular. Este protocolo ayuda a seleccionar la técnica más adecuada para cada estudio.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Hamish Campbell y al Prof. Antony Braithwaite por su ayuda en el desarrollo de las líneas celulares transducidas MCF-7-LeGO. Nos gustaría agradecer nuestro apoyo financiero por parte de la Fundación Bloomfield Group a través del Instituto de Investigación Médica Hunter. B.C.M cuenta con el apoyo de una beca APA a través de la Universidad de Newcastle y la beca MM Sawyer a través del Instituto de Investigación Médica Hunter.

1. Las células que se preparan para Ensayos de proliferación Nota: Preparar las dos líneas celulares en la misma forma y semilla en el mismo formato para a analizar cada método. <ol><li> Crecer MCF-7-Lego y MCF-7-Δ40p53 7 células a 75-80% de confluencia en T 75 cm 2 frascos de cultivo de tejidos usando fenol libre de rojo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) , 200 mM L-glutamina, 2 mg de insulina / ml y 1 mg / ml puromicina a 37 ° C con 5% de CO 2. Manejar las células en una cabina de bioseguridad de clase II estéril. Nota: La cantidad de tiempo que se necesita para crecer las células hasta confluencia varía en función de la dilución de la siembra. En preparación para el recubrimiento de las células para los ensayos de proliferación, las semillas de las células a una dilución 1: 3 en DMEM suplementado y mantener en condiciones normales de crecimiento durante 3 días hasta 75-80% de confluencia. </li><li> Para retirar las células del matraz, verter el medio enun contenedor de residuos. Inmediatamente se lava la capa de células con 2 ml de tripsina 2x pre-calentado. Aspirar tripsina. Añadir otros 2 ml de tripsina previamente calentada a la capa de células y el lugar en una incubadora durante 5 min a 37 ° C con 5% de CO 2. <ol><li> Una vez que las células se separan, se lavan las células con 10 ml calentado fresco suplementado DMEM. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml estéril y se centrifuga a 491 xg durante 5 min a TA. aspirar con cuidado y desechar el sobrenadante. </li></ol></li><li> Resuspender el sedimento celular en 5 ml de DMEM fresco suplementado. Realizar un recuento de células para determinar la densidad correcta para sembrar las células en placas de 96 pocillos. <ol><li> Diluir 100 l de la suspensión de células en 900 l de 1x solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Coloque un nuevo sensor de 60 micras en el contador de células automatizado. Mantenga presionado el émbolo y sumergir el sensor en la suspensión celular diluida. liberar lentamente el émbolo en el contador de células. Retire el sensor del COU celularnter cuando esté terminado. Nota: El número de células se mostrará en el contador de células en células / ml. </li></ol></li><li> Se siembran las células en un volumen final de 100 l (en DMEM) en una placa de 96 pocillos a ~ 20% de confluencia para dejar espacio para el crecimiento celular y la medición de la proliferación durante 3-5 días (véase la Tabla 1). Sembrar todas las líneas celulares por triplicado. Nota: Para este experimento, se evaluaron tres densidades de células diferentes para determinar la densidad celular óptima. El número de células requeridas se resumen en la Tabla 1. Se siembran las células a una densidad más baja si se requiere la medición de más crecimiento a largo plazo. <ol><li> Para el hemocitómetro y ensayos basados ​​en luminiscencia, preparar una placa por punto de tiempo (es decir, 4 placas por ensayo). Para el ensayo de imágenes de células, preparar una sola placa para la duración del experimento. </li></ol></li><li> Mantener las células a 37 ° C con 5% de CO2 durante 24 hr. </li></ol> 2. La determinación de recuento de células con nosotrosing un hemocitómetro <ol><li> Pre-caliente tanto medio y tripsina a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular, horno o baño de agua. Aspirar los medios de células en un contenedor de residuos, se lavan una vez con 30 l de tripsina 2x, y aspirar la tripsina. </li><li> Lavar las células de nuevo con 30 l de tripsina 2x, y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C. Golpear suavemente borde de la placa para desalojar las células de la placa. Añadir 50 l de DMEM suplementado y las células de la mezcla mediante pipeteo hasta que las células forman una única suspensión celular. </li><li> Preparar hemocitómetro por la superficie y cubierta de cristal de la limpieza con etanol al 70%. </li><li> Coloque el cubre de vidrio sobre las cámaras de recuento y colocarán hasta &#39;anillos de Newton refracción&#39; se pueden ver entre los bordes cubres y el hemocitómetro. Nota: Estos indican que el cubreobjetos se ha adherido correctamente al hemocitómetro. </li><li> pipeta suavemente 20 l de suspensión de células debajo de la cubierta antideslizante, llenando la cámara de recuento por el movimiento capilar.Coloque hemocitómetro bajo un aumento de 10x de un microscopio y visualizar las cámaras de recuento en el diseño de cuadrícula. </li><li> Recuento de células en las 4 plazas exteriores de la disposición de la rejilla. Para mejorar la eficiencia, la repetición de cargos de cuadrados externos adicionales si es necesario, o hasta que el recuento ha alcanzado 70 - 100 células 14,15. <ol><li> Calcular la concentración de células por ml de la siguiente manera: recuento celular medio por el factor de dilución x cuadrado (si se usa) x 10 4 </li></ol></li><li> Repita los pasos 2.1-2.8 cada 24 horas durante 96 horas después de la siembra. </li></ol> 3. Determinación de la proliferación de células utilizando un ensayo basado en luminiscencia Nota: Esta es una medición de punto final. Una vez se añade el reactivo a las células, la placa solamente se puede cuantificar de una vez. <ol><li> reactivo de luminiscencia deshielo en un baño de agua a 22 ° durante 30 minutos. </li><li> Mezclar suavemente reactivo por inversión de la botella para obtener una mezcla homogénea. </li><li> Equilibrar una placa de células sembradas (del paso1.5) a TA durante 30 min. </li><li> Añadir 100 ml de reactivo de luminiscencia a cada pocillo. Mezcle los contenidos en un agitador orbital durante 2 min. Permitir que la platina incubar durante 10 min a TA. </li><li> La creación de un experimento de la luminiscencia utilizando el multi-modo de software lector de placas. <ol><li> Encienda el lector de placas multi-modo y abrir el software. En el &quot;administrador de tareas &#39;, seleccione&#39; experimentos &#39;y&#39; crear new&#39;.Select &#39;archivo&#39; de barra de herramientas, y bajo&quot; protocolo &quot;pestaña, seleccione&quot; procedimiento &quot;. </li><li> Seleccione &#39;Grenier fondo plano 96&#39; del tipo de placas, y marca la casilla &#39;utilización tapa&#39;. Seleccione la acción &quot;leer&quot; en la casilla «método de lectura &#39;. Seleccionar método de detección de &#39;la luminiscencia&#39;. Haga clic en Aceptar&#39;. </li><li> En el cuadro de paso leer, seleccionar los pozos que hay que analizar en la pestaña &quot;plato lleno&quot; y seleccione pozos para actuar como pozos en blanco. </li><li> Establecer el conjunto de filtros para filtrar vacío (por ejemplo, el enchufe, Em: agujero, espejo: ninguno). Ajuste la ganancia de135, con un tiempo de integración de 0,5 segundos por pocillo y una altura de 6,5 mm leer. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; para guardar la configuración para la lectura de luminiscencia. </li></ol></li><li> Realización de una luminiscentes Lee <ol><li> Expulsar soporte de la placa seleccionando la pestaña &#39;control de instrumentos&#39; y hacer clic en &quot;placa out&#39;.Place placa de 96 pocillos en el soporte de la placa, asegurando la tapa está encendido. Cierre el soporte de la placa haciendo clic en &quot;placa de pestaña en&quot; control de instrumentos &#39;. Haga clic en &quot;leer ahora&quot; de la barra de herramientas para realizar lectura luminiscente. </li><li> Exportar las mediciones relativas unidad luminiscente (RLU) para cada pocillo a una hoja de cálculo para el análisis adicional. </li></ol></li><li> Repita los pasos 3.1-3.6 para registrar la proliferación cada 24 horas hasta 96 horas después de la siembra de células. </li></ol> 4. La determinación de recuento de células El uso de un generador de imágenes de la célula <ol><li> La creación de un experimento de imágenes de células usando el software de imágenes de células multimodo <ol><li> Encienda el reproductor de imágenes de células multi-modo y TH abiertosoftware de correo. </li><li> En el &quot;administrador de tareas&quot;, seleccione la pestaña &#39;experimentos&#39; y &#39;crear new&#39;.On la&#39; &#39;barra de herramientas, haga clic en &quot;archivo&quot; ficha y abierta&#39; protocolo de actuación &#39;tab.Select&#39; temperatura de ajuste de acción &#39;. Establecer incubadora en &#39;on&#39; y ajuste la temperatura a 37 ° C y comprobar &#39;precalentamiento&#39; antes de continuar con el cuadro siguiente paso &#39;. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; para guardar la configuración. </li><li> Seleccione la acción &quot;leer&quot;. Haga clic en el método de detección &quot;imagen&quot;, seleccione &quot;punto final / kinetic leer el tipo y el tipo de óptica &#39;filtros&#39;. Haga clic en &#39;OK&#39;.Click en la pestaña plato lleno&#39; y seleccione pocillos de la placa para formar imágenes. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; para guardar la configuración. </li><li> Seleccione el objetivo 2,5 veces en el menú desplegable Opciones &#39;objetivos&#39;. En la pestaña de &#39;canales&#39;, seleccionar dos canales: GFP 469, 525 y campo brillante. Compruebe la exposición &#39;auto&#39; para ambos canales y seleccione así la exposición automática. </li><li> Para determinar auto ajustes de enfoque, seleccione &quot;Ajustar el enfoque &#39;y haga clic en&quot; opciones &quot;. Para las opciones de enfoque automático, seleccione el método de &#39;escanear y luego enfoque automático&#39;. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; para guardar la configuración. </li><li> Ajuste el horizontal y el desplazamiento desde el centro del pozo (m) vertical para 0.Select para escanear varias imágenes por pocillo en un montaje 3 x 2, con una separación horizontal (m) = 2881 y el espaciamiento vertical (m) = 2,127. Haga clic en &#39;Aceptar&#39; para guardar los parámetros del procedimiento. Nota: Véase la Tabla 2 para parámetros de lectura. </li></ol></li><li> Realización Lee Experimento en la placa seleccionada <ol><li> Haga clic en la pestaña &#39;control de instrumentos&#39; y seleccionar el function.Place &#39;depositarse&#39; placa de 96 pocillos en soporte de la placa, asegurando la tapa está encendido. En la pestaña &#39;control de instrumentos&#39;, seleccione el &#39;plato en &quot;función. Seleccione &#39;leer ahora&#39; de lengüeta de la placa. Repita leer cada 24 horas hasta 96 horas después de la siembra. </li></ol></li><li> El análisis de recuento de células Utilizando elSoftware Imager celular. <ol><li> Para analizar una imagen, haga clic en la pestaña &#39;&#39; de datos en la placa de captación de imagen, &#39;foto [GFP 469, 525 + campo brillante]&#39; select. Haga doble clic en un reflejado también. </li><li> Haga clic en una imagen cargada. Seleccione &#39;analizar&#39; y seleccionar una sola imagen del montaje que va a analizarse. Haga clic en &#39;OK&#39;.Check la&#39; GFP &#39;canal sólo, y establecer parámetros como se indica en la Tabla 3. Haga clic en &quot;START&quot; para aplicar parámetros a las células fotografiadas. </li><li> Observe la máscara de recuento de células se coloca sobre las células fotografiadas, que se utiliza para determinar el recuento de células por imagen. Haga clic en &quot;aplicar los cambios &#39;y mantener estos valores para cada plancha expuesta durante todo el experimento. </li><li> Una vez de vuelta en la plancha expuesta, haga clic en el menú &quot;datos&quot; del menú desplegable y seleccione &#39;recuento de células&#39;. Esto generará el recuento total de células por pocillo. </li><li> Exportar todos los datos a una hoja de cálculo haciendo clic en la pestaña de &quot;exportar&quot; para su posterior análisis of los recuentos de células por pocillo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+p53%2C+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer. p53, guardian of the genome.</a> Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf">https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf</a> 1-12 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este protocolo se examinaron tres métodos diferentes de medir la proliferación celular en células cultivadas. Cada método era capaz de mediciones reproducibles y precisos de la proliferación celular en 96 horas, y los resultados fueron comparables entre cada uno de los métodos de prueba (Figura 2 y 3). Tanto el ensayo basado en luminiscencia y el método de formación de imágenes de células producen los resultados más robustos, mostrando aumentos lineales en la proliferación celular después de 96 hr <s...

El gen supresor de tumor, p53, es un regulador esencial de una serie de procesos celulares, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis y senescencia 1. Es responsable de mantener la estabilidad genómica, y por lo tanto es crucial para mantener el equilibrio de la muerte celular y el crecimiento celular. Las mutaciones en p53 son comunes en el cáncer y son la causa principal de la inactivación de p53 conduce a la proliferación de células de cáncer no controlado 2. Curiosamente, las mutaciones en p53 sólo representan aproximadamente el 25% de los cánceres de mama 3, lo que sugiere que otros mecanismos son responsables de la pérdida de la función p53. Las isoformas de p53 recientemente descubiertos se ha demostrado que se sobreexpresa en un número de cánceres humanos, y pueden modular la función de p53 de 4,5. Hemos demostrado anteriormente que la isoforma p53, Δ40p53, es la isoforma más altamente expresado en el cáncer de mama, y ​​se regula positivamente de manera significativa en las células de cáncer de mama, en comparación con TISS normal adyacenteue 6. A raíz de esto, estable transduced la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 para sobreexpresar Δ40p53 utilizando el Lego-ig2-puro + vectorial (GFP +) 7. Estas células se usaron para investigar si la expresión de alto Δ40p53 aumenta las tasas de proliferación celular en células de cáncer de mama. Hay muchos métodos directos e indirectos de la medición de la proliferación celular de las células cultivadas in vitro 8,9. Estos se pueden realizar ya sea como mediciones continuas en el tiempo, o ensayos de punto final como 10. Los métodos convencionales son todavía útiles, tales como el recuento de células usando un hemocitómetro. Este ensayo es un bajo costo y medida directa del número de células, pero no se basan en el recuento de células grandes y la formación altamente especializada para minimizar el error y gran estándar desviaciones de los recuentos. La necesidad de realizar mediciones compatible con los formatos de alto rendimiento ha llevado al desarrollo de ensayos de múltiples pocillos de placa. Estos ensayos basados ​​en luminiscencia Measure el número de células sobre la base de una señal luminiscente que es proporcional a la actividad metabólica de la célula 11,12. Más recientemente, la introducción de las plataformas de imágenes de alta contenido ha permitido nuevas herramientas que controlan la proliferación celular mientras que proporciona la recogida de datos fenotípica cuantitativa y cualitativa, e incluye una variedad de sistemas 13. Todos estos métodos proporcionan vías para medir el crecimiento celular, ya sea por medio de ensayos de medición o de punto final continuas, y cada uno posee una serie de ventajas y desventajas con respecto a la sensibilidad, el rendimiento de los números de muestra, y la información de células, todo lo cual puede ser pesada en consecuencia dependiendo en la pregunta de investigación. Este protocolo describe tres métodos diferentes para medir la proliferación celular in vitro, con cada método de utilización de diferentes gamas de sensibilidad, reproducibilidad y formatos de placas de múltiples pocillos. Este protocolo tiene como objetivo comparar el uso de una cha conteo de hemocitómetromber, un ensayo basado en luminiscencia viabilidad celular, y de imágenes de células, en la medición de la proliferación de células durante un tiempo de 96 horas. Para ello, el crecimiento de las células transducidas por vectores (MCF-7-LEGO) se comparó con células transducidas para sobreexpresar Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizando tres diferentes densidades de células. La proliferación celular se midió cada 24 horas para un máximo de 96 hr. Se encontró que cada método para tener sus propias ventajas y desventajas, y en función del objetivo del experimento, cada uno todavía es un método valioso para proporcionar información sobre la tasa de proliferación.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, sin rojo fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Suplementado con 10% FBS, 200 mM L-glutamina, 2 & g/ml de insulina y 1 &micro; g/ml puromicina</td></tr><tr><td>L-glutamina solución (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Solución de insulina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA al 0,5% (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Diluir a 2x en DPBS</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos, 75 cm2 </> superficie de crecimiento</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Contador de células</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Contador de células automatizado</td></tr> de <tr><td>96 pocillos de placa multipocillo, fondo plano</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Mejorado Hemocitómetro Neubauer</td><td>BOECO Alemania</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Olympus IX51</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo CellTiter-Glo 2.0</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Ensayo basado en luminiscencia</td></tr><tr><td>Citación Lector multimodo de imágenes de 3 células BioTek</td><td></td><td></td><td>Lector de placas para luminiscencia, fluorescencia y de imágenes celulares de campo claro</td></tr><tr><td>Gen5 software de análisis de datos</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

La medición de la proliferación celular se puede realizar mediante varios métodos diferentes, cada uno con diferentes niveles de sensibilidad, reproducibilidad y compatibilidad con el formateo de alto rendimiento. Este protocolo describe el uso de tres métodos diferentes para medir la proliferación celular in vitro, incluida la cámara de recuento de hemocitómetro convencional, un ensayo basado en luminiscencia que utiliza el cambio en la actividad metabólica de las células viables como medida del número relativo de células, y un generador de imágenes celulares multimodo que mide el número de células utilizando un algoritmo de conteo. Cada método presenta sus propias ventajas y desventajas para la medición de la proliferación celular, incluyendo el tiempo, el costo y la compatibilidad de alto rendimiento. Este protocolo demuestra que cada método podía medir con precisión la proliferación celular a lo largo del tiempo, y era sensible para detectar el crecimiento a diferentes densidades celulares. Además, la medición de la proliferación celular mediante un generador de imágenes celulares pudo proporcionar más información, como la morfología y la confluencia, y permitió un seguimiento continuo de la proliferación celular a lo largo del tiempo. En conclusión, cada método es capaz de medir la proliferación celular, pero el método elegido depende del usuario.

Para estudiar diferentes métodos de medición de la proliferación de las células cultivadas, la proliferación celular de las células MCF-7-Δ40p53 células transducidas se comparó con la línea celular de cáncer de mama MCF-LEGO-7 no transducidas. Los tres métodos que se compararon - la formación de imágenes método hemocitómetro convencional, ensayo de luminiscencia viabilidad de las células, y las células análisis- se describen en el diagrama esquemático (Figura 1). Cada mé...

Este protocolo describe el uso de tres métodos diferentes para analizar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama. Esto incluye el uso del recuento de células convencional, la viabilidad de las células basada en la luminiscencia y el recuento de células mediante el uso de un generador de imágenes de células. Cada uno de ellos ofrece ventajas para la medición reproducible de la proliferación celular.

Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

El objetivo general de esta demostración es comparar tres ensayos diferentes de proliferación celular y presentar las ventajas y desventajas de cada método. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, como la elección del método de proliferación celular más adecuado. La preparación de este método es fundamental, ya que los pasos con el contador celular son difíciles de aprender.Es necesario centrarse en las células antes de aplicar la máscara adecuada para el recuento celular. Para comenzar este procedimiento, cultive dos líneas celulares MCF-7 durante tres días hasta alcanzar una confluencia del 75 al 80 % en frascos de cultivo de tejidos de 75 cm² utilizando DMEM sin rojo de fenol. Después de tres días, retire las células de los frascos vertiendo el medio en un recipiente de desecho.Luego, lave inmediatamente la capa celular con dos mililitros de tripsina al 2x precalentada. Aspire la tripsina y agregue otros dos mililitros de tripsina al 2x precalentada a la capa celular antes de colocarla en un incubador. Una vez que las células se hayan desprendido, lávelas con 10 mililitros de DMEM fresco suplementado y calentado.Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros y centrifúguela durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Posteriormente, re-suspenda el botón celular en cinco mililitros de DMEM fresco suplementado.Para realizar un recuento celular, diluya 100 microlitros de la suspensión celular en 900 microlitros de DPBS al uno por uno. A continuación, coloque un sensor nuevo de 60 micrómetros en el contador celular automatizado. Mantenga presionado el émbolo y sumerja el sensor en la suspensión celular diluida.Suelte lentamente el émbolo del contador de células. Luego, retire el sensor del contador de células una vez finalizado. Siembre las células en un volumen final de 100 microlitros en una placa de 96 pocillos a una confluencia aproximada del 20 % para dejar espacio para el crecimiento celular y la medición de la proliferación durante tres a cinco días.Para determinar el número de células utilizando un hemocitómetro, caliente previamente el medio y la tripsina a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo celular, horno o baño de agua. A continuación, aspire el medio de las células hacia un recipiente de desecho. Luego, lávelas una vez con 30 microlitros de tripsina dos veces y aspire nuevamente el medio hacia el recipiente de desecho.A continuación, lave nuevamente las células con 30 microlitros de tripsina al doble, e incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Golpee suavemente el borde de la placa para desprender las células. Posteriormente, agregue 50 microlitros de DMEM suplementado y mezcle las células mediante pipeteo hasta obtener una suspensión de células individuales.Coloque el cubreobjetos de vidrio sobre las cámaras de recuento y fíjelo hasta que se observen los anillos de refracción de Newton entre los bordes del cubreobjetos y el helocitómetro. Luego, pipetee suavemente 20 microlitros de la suspensión celular debajo del cubreobjetos y permita que la cámara de recuento se llene por movimiento capilar. Posteriormente, visualice las cámaras de recuento en el diseño de cuadrícula bajo un aumento de 10x.En este procedimiento, descongele el reactivo de luminiscencia en un baño de agua a 22 grados Celsius durante 30 minutos. Invierta suavemente el frasco para obtener una mezcla homogénea. A continuación, equilibre una placa de células sembradas a temperatura ambiente durante 30 minutos.A continuación, añada 100 microlitros de reactivo de luminiscencia a cada pocillo. Mezcle el contenido en un agitador orbital durante dos minutos. Luego, deje que la placa incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.Para configurar un experimento de luminiscencia utilizando el software del lector de placas multimodal, encienda el lector de placas multimodal y abra el software. En el Administrador de tareas, seleccione Experimentos y Crear nuevo. Luego, seleccione Archivo en la barra de herramientas lateral y, en la pestaña Protocolo, seleccione Procedimiento.A continuación, seleccione Greiner 96 fondo plano como tipo de placa y marque la casilla Usar tapa. Seleccione la acción Leer en el cuadro Método de lectura. Luego, seleccione Luminiscencia como método de detección y haga clic en Aceptar. En el cuadro Paso de lectura, seleccione las pocillos a escanear en la pestaña Placa completa y seleccione los pocillos que servirán como blancos.Configure el conjunto de filtros en Filtro vacío. Ajuste la ganancia a 135, con un tiempo de integración de 5 segundos por pocillo y una altura de lectura de 6,5 milímetros. Haga clic en Aceptar para guardar la configuración de la lectura de luminiscencia.Para realizar una lectura de luminiscencia, expulse el portaplacas seleccionando la pestaña Control del Instrumento y haga clic en Placa Fuera. Coloque la placa de 96 pocillos sobre el portaplacas, asegurándose de que tenga la tapa puesta. Cierre el portaplacas haciendo clic en Placa Dentro en la pestaña Control del Instrumento.Luego, haga clic en Leer ahora en la barra de herramientas para realizar una lectura luminiscente. Después, exporte las mediciones de RLU para cada pocillo a una hoja de cálculo para su posterior análisis. Para configurar un experimento de imagen de células, encienda el imagenador celular multimodal y abra el software.En el Administrador de tareas, seleccione la pestaña Experimentos y cree uno nuevo. En la barra de herramientas Archivo, haga clic en la pestaña Protocolo y luego en la pestaña Procedimiento. Seleccione la acción Establecer temperatura.Configure el incubador en Encendido y establezca la temperatura en 37 grados Celsius. Marque Precalentar y luego haga clic en Aceptar para guardar la configuración. A continuación, seleccione la acción Leer.Haga clic en Imagen como método de detección. Luego, seleccione el tipo de lectura Punto final/Cinética y el tipo de óptica Filtros, y haga clic en Aceptar. A continuación, haga clic en la pestaña Placa completa y seleccione las pocillos de la placa que se van a imaginar. Haga clic en Aceptar para guardar la configuración.Ahora, seleccione el objetivo de 2,5 aumentos en la opción desplegable de Objetivos. En la pestaña Canales, seleccione GFP 469,525 y Campo Brillante. Active Exposición Automática para ambos canales y seleccione el pocillo de exposición automática.Para determinar la configuración del enfoque automático, haga clic en Opciones. Para las opciones de enfoque automático, seleccione el método Escanear y luego enfoque automático. Haga clic en Aceptar para guardar la configuración.Después de eso, establezca el desplazamiento horizontal y vertical desde el centro del pocillo en cero. Seleccione escanear múltiples imágenes por pocillo en un mosaico de tres por dos. Luego, haga clic en Aceptar para guardar la configuración del procedimiento.Para leer el experimento en la placa seleccionada, haga clic en la pestaña Control del Instrumento y seleccione la función Plate Out. Coloque una placa de 96 pocillos en el soporte de placas, asegurándose de que la tapa esté colocada. En la pestaña Control del Instrumento, seleccione la función Plate In.A continuación, seleccione Leer ahora en la pestaña de placa y repita la lectura cada 24 horas, hasta 96 horas posteriores al siembra. Para analizar una imagen, haga clic en la pestaña Datos de la placa imagenada y seleccione Imagen GFP 469, 525 más Campo Brillante. Luego, haga doble clic en el pocillo imagenado.Ahora, haga clic en una imagen cargada. Seleccione Analizar y luego seleccione la imagen individual del mosaico que se analizará. A continuación, haga clic en Aceptar. Posteriormente, marque solo el canal GFP y configure los parámetros según se indica en la Tabla 3.Después, haga clic en Iniciar para aplicar los parámetros a las células imagenadas. Observe la máscara de conteo celular colocada sobre las células imagenadas, que se utiliza para determinar el número de células por imagen. Haga clic en Aplicar cambios y mantenga esta configuración para cada placa imagenada durante todo el experimento.En esta figura, se realizó un análisis de regresión lineal para comparar las relaciones correlativas entre los diferentes métodos examinados para medir la proliferación celular en células MCF-7-LeGO y células MCF-7-delta 40p53. Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y se determinó la significancia entre los diferentes métodos que miden la proliferación celular. Se observó la correlación más fuerte entre la comparación del ensayo basado en luminiscencia y el contador de células.Se muestran aquí imágenes representativas de células de cáncer de mama MCF-7-LeGO y MCF-7-delta 40p53 positivas para GFP, capturadas mediante el equipo de imagen celular cada 24 horas hasta que las células alcancen una confluencia cercana al 100 %. Este método proporciona información celular útil, incluida la posibilidad de monitorear visualmente el crecimiento celular durante varios días, así como comparar el tamaño celular y la morfología entre diferentes líneas celulares. A continuación se presenta un resumen de las ventajas y desventajas de cada método evaluado, lo cual demuestra la versatilidad de cada uno de estos métodos y ayudará a los lectores a elegir el método más adecuado.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de tres ensayos diferentes de proliferación celular y debería poder determinar cuál se adapta mejor a su propio diseño experimental.

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Investigación

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