Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama

El objetivo general de esta demostración es comparar tres ensayos diferentes de proliferación celular y presentar las ventajas y desventajas de cada método. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, como el uso del método de proliferación celular más adecuado. La preparación de este método es fundamental, ya que los pasos del generador de imágenes celulares son difíciles de aprender.

Requieren que se concentre en las células antes de aplicar la mascarilla de recuento de células adecuada. Para comenzar este procedimiento, cultive dos líneas celulares MCF-7 durante tres días hasta una confluencia del 75 al 80% en los matraces de cultivo de tejidos de centímetros cuadrados T75 utilizando DMEM sin rojo de fenol. Después de tres días, retire las células de los matraces vertiendo el medio en un contenedor de desechos.

Luego, lave inmediatamente la capa celular con dos mililitros de tripsina precalentada dos veces. Aspire la tripsina y agregue otros dos mililitros de tripsina precalentada a la capa celular antes de colocarla en una incubadora. Una vez que las células se hayan desprendido, lávelas con 10 mililitros de DMEM recién suplementado calentado.

Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de DMEM fresco suplementado.

Para realizar un recuento de células, diluya 100 microlitros de la suspensión celular en 900 microlitros de una vez DPBS. A continuación, coloque un nuevo sensor de 60 micrómetros en el contador de células automatizado. Mantenga presionado el émbolo y sumerja el sensor en la suspensión de celda diluida.

Suelte lentamente el émbolo en el contador de celdas. A continuación, retire el sensor del contador de celdas cuando haya terminado. Siembre las células en un volumen final de 100 microlitros en una placa de 96 pocillos con aproximadamente un 20% de confluencia para dejar espacio para el crecimiento celular y la medición de la proliferación durante tres a cinco días.

Para determinar el recuento de células con un hemocitómetro, precaliente el medio y la tripsina a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivos celulares, un horno o un baño de agua. A continuación, aspire el medio de las celdas a un contenedor de residuos. A continuación, lávelos una vez con 30 microlitros de dos veces tripsina y aspire el medio en el contenedor de residuos de nuevo.

A continuación, vuelve a lavar las células con 30 microlitros de tripsina dos veces, e incubarlas durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Golpee suavemente el borde de la placa para desalojar las células. Posteriormente, agregue 50 microlitros de DMEM suplementado y mezcle las células pipeteando hasta que se forme una suspensión de una sola célula.

Coloque la cubierta de vidrio sobre las cámaras de conteo y fíjela hasta que se vean los anillos de refracción de Newton entre los bordes de la cubierta y el helocitómetro. A continuación, pipetee suavemente 20 microlitros de la célula por debajo del cubreobjetos y deje que la cámara de recuento se llene por capilaridad. A continuación, visualice las cámaras de recuento en el diseño de cuadrícula con un aumento de 10x.

En este procedimiento, descongele el reactivo de luminiscencia en un baño de agua a 22 grados centígrados durante 30 minutos. Invierta suavemente la botella para obtener una mezcla homogénea. Luego, equilibre un plato de células sembradas a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después, añada 100 microlitros de reactivo de luminiscencia a cada pocillo. Mezcle el contenido en un agitador orbital durante dos minutos. Luego, deje que la placa se incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Para configurar un experimento de luminiscencia utilizando el software del lector de placas multimodo, encienda el lector de placas multimodo y abra el software. En el Administrador de tareas, seleccione Experimentos y Crear nuevo. A continuación, seleccione Archivo en la barra de herramientas lateral y, en la pestaña Protocolo, seleccione Procedimiento.

A continuación, seleccione Greiner 96 flat bottom como tipo de placa y marque la casilla Usar tapa. Seleccione la acción Leer en el cuadro Método de lectura. A continuación, seleccione Luminiscencia como método de detección y haga clic OK.In el cuadro Paso de lectura, seleccione los pocillos que se van a escanear en la pestaña Placa completa y seleccione los pocillos que actúen como pozos en blanco.

Establezca el conjunto de filtros en Filtro vacío. Establezca la ganancia en 135, con un tiempo de integración de 5 segundos por pocillo y una altura de lectura de 6,5 milímetros. Haga clic en Aceptar para guardar la configuración de la lectura de luminiscencia.

Para realizar una lectura de luminiscencia, expulse el soporte de la placa seleccionando la pestaña Control de instrumentos y haga clic en Salida de placa. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa, asegurándose de que la tapa esté puesta. Cierre el soporte de la placa haciendo clic en Plate In en la pestaña Control de instrumentos.

A continuación, haga clic en Leer ahora en la barra de herramientas para realizar una lectura luminiscente. Después de eso, exporte las mediciones de RLU para cada pozo a una hoja de cálculo para su posterior análisis. Para configurar un experimento de adquisición de imágenes de células, encienda el generador de imágenes de células multimodo y abra el software.

En el Administrador de tareas, seleccione la pestaña Experimentos y Crear nuevo. En la barra de herramientas Archivo, haga clic en la pestaña Protocolo y luego en la pestaña Procedimiento. Seleccione la acción Establecer temperatura.

Ponga la incubadora en Encendido y establezca la temperatura en 37 grados centígrados. Marque Precalentar y, a continuación, haga clic en Aceptar para guardar la configuración. A continuación, seleccione la acción Leer.

Haga clic en Imagen como método de detección. A continuación, seleccione el tipo de lectura Endpoint/Kinetic y el tipo de óptica Filters y haga clic en Aceptar. Después de eso, haga clic en la pestaña Placa completa y seleccione los pocillos de la placa que se van a visualizar. Haga clic en Aceptar para guardar la configuración.

Ahora, selecciona el objetivo 2,5 veces en la opción desplegable Objetivos. En la pestaña Canales, seleccione GFP 469.525 y Campo brillante. Marque Exposición automática para ambos canales y seleccione bien la exposición automática.

Para determinar la configuración del enfoque automático, haga clic en Opciones. Para las opciones de enfoque automático, seleccione el método Escanear y, a continuación, el enfoque automático. Haga clic en Aceptar para guardar la configuración.

Después de eso, establezca el desplazamiento horizontal y vertical desde el centro del pozo a cero. Seleccione esta opción para escanear varias imágenes por pocillo en un montaje de tres por dos. A continuación, haga clic en Aceptar para guardar la configuración del procedimiento.

Para leer el experimento en la placa seleccionada, haga clic en la pestaña Control de instrumentos y seleccione la función Plate Out. Coloque una placa de 96 pocillos en el soporte de la placa, asegurándose de que la tapa esté puesta. En la pestaña Control de instrumentos, seleccione la función Plate In.

A continuación, seleccione Leer ahora en la pestaña de placas y repita la lectura cada 24 horas, hasta 96 horas después de la siembra. Para analizar una imagen, haga clic en la pestaña Datos de la placa de la imagen y seleccione Imagen GFP 469, 525 más campo brillante. A continuación, haga doble clic en el pozo de la imagen.

Ahora, haga clic en una imagen cargada. Seleccione Analizar y, a continuación, seleccione la imagen única del montaje que se va a analizar. A continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, compruebe únicamente el canal GFP y establezca los parámetros como se describe en la Tabla 3.

Después de eso, haga clic en Iniciar para aplicar los parámetros a las celdas de la imagen. Observe la máscara de recuento de células colocada sobre las células de las que se toma la imagen, que se utiliza para determinar el recuento de células por imagen. Haga clic en Aplicar cambios y mantenga estos ajustes para cada placa de la que se haya tomado una imagen a lo largo del experimento.

En esta figura, se realizó un análisis de regresión lineal para comparar las relaciones correlativas entre los diferentes métodos examinados para medir la proliferación celular en células MCF-7-LeGO y células MCF-7-delta 40p53. Se calculó un coeficiente de correlación de Pearson y se determinó la significancia entre los diferentes métodos de medición de la proliferación celular. La correlación más fuerte se observó entre la comparación del ensayo basado en luminiscencia y el generador de imágenes celulares.

A continuación se muestran las imágenes representativas de las células de cáncer de mama MCF-7-LeGO y MCF-7-delta 40p53 positivas para GFP capturadas con el generador de imágenes celulares cada 24 horas hasta que las células alcanzan casi el 100% de confluencia. Este método proporciona información celular útil, incluida la capacidad de monitorear visualmente el crecimiento celular durante varios días y comparar el tamaño y la morfología celular entre diferentes líneas celulares. Aquí se muestra un resumen de las ventajas y desventajas de cada método probado, lo que demuestra la versatilidad de cada uno de los métodos y ayudará a los lectores a elegir el método más apropiado.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de tres ensayos diferentes de proliferación celular y debería ser capaz de determinar cuál se adapta mejor a su propio diseño experimental.