Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es observar la simbia bacteriana marcada con fluorescencia dentro de su huésped nematodo. Esto se logra marcando primero las bacterias con una proteína fluorescente a través de la conjugación. El segundo paso es aislar los nematodos AIC mediante la recolección de huevos.

A continuación, los nematodos AIC se cultivan en combinación con su simbionte bacteriano marcado con fluorescencia para permitir la asociación natural, en última instancia, la localización del simbianto bacteriano dentro del huésped nematodo. Y la frecuencia de esta asociación dentro de la población de nematodos se puede determinar mediante microscopía de fluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la simbiosis, como ¿dónde se localizan las bacterias dentro de su huésped y cuál es la distribución del transporte bacteriano en una población de huéspedes?

Después del crecimiento nocturno de las cepas bacterianas, el subcultivo, el receptor donante y las cepas auxiliares en medios de crecimiento ricos en nutrientes que carecen de antibióticos en una proporción de uno a 100 de cultivo a medio, luego cultivan los cultivos a la temperatura adecuada para cada cepa hasta que alcanzan la etapa de crecimiento logarítmica media. A continuación, combine las cepas en un solo tubo de microcentrífuga y centrifuga los cultivos mezclados durante dos minutos A 17, 900 Gs, decantar el sobrenadante y centrifugar el pellet en 30 microlitros de medio fresco. A continuación, coloque la suspensión en una placa de medios ricos en nutrientes sin antibióticos y deje que la mancha se seque cuando la suspensión se haya secado.

Incubar la placa invertida durante la noche a una temperatura óptima para la bacteria receptora y permitida para el donante y el ayudante, si procede. Ahora, raspe la mancha y la raya para obtener colonias individuales en una placa de antibiótico selectivo para obtener un cultivo puro de rayas de bacterias, una sola colonia para el aislamiento. Por último, asegúrese de que las colonias resultantes sean del receptor y no de la cepa donante.

Mediante el cribado de la presencia de fenotipos específicos del receptor. Por ejemplo, las bacterias cino abdi se pueden distinguir de la e. coli mediante la realización de una prueba de catalizador para detectar la presencia del plásmido mediante la confirmación de la fluorescencia en la longitud de onda correspondiente a la proteína del plásmido fluorescente. Después de cultivar el simbianto bacteriano natural durante la noche, esparcir 600 microlitros del cultivo bacteriano en ocho a 10 aireados lipídicos de 10 milímetros, y luego incubar las placas en la oscuridad sin humedad a 25 grados centígrados.

Después de dos días, agregue 5.000 nematodos juveniles infecciosos en 500 microlitros de medio a los céspedes bacterianos. Después de incubar las placas a 25 grados centígrados durante tres días más, coloque 20 microlitros de agua en un portaobjetos de microscopio. Luego, use un palito estéril para raspar una pequeña cantidad de nematodos del césped bacteriano.

Coloque el palo en el agua para permitir que los nematodos se alejen nadando. Mire este portaobjetos con un aumento bajo. Si los huevos y las hembras son visibles, continúe cuando las hembras contengan huevos, coloque unos mililitros de agua en la superficie de las placas, agite suavemente las placas y luego vierta el agua en un tubo cónico de 50 mililitros.

Los nematodos deben desprenderse de las placas y dejar de ser visibles en la superficie de la placa. Deje que los nematodos se asienten en el fondo del tubo, luego coloque el exceso de agua desde la parte superior del tubo y vuelva a llenar el tubo con agua limpia. Después de permitir que los nematodos adultos se asienten y pipetear el exceso de agua una vez más, llene los tubos cónicos con solución de huevo.

A continuación, mezcle los tubos mediante una inversión suave durante exactamente 10 minutos a temperatura ambiente. Después de agitar, centrifugar inmediatamente los tubos cónicos durante exactamente 10 minutos a 1.250 Gs y temperatura ambiente con el freno puesto. A continuación, decantar rápidamente el sobrenadante, volver a suspender el pellet con solución de huevo pipeteando y llenar el tubo cónico con solución de huevo fresco.

Mezcle bien la suspensión de huevo invirtiendo el tubo de tres a cinco veces y luego después de peletizar los huevos y decantar el sobrenadante como se acaba de mostrar. Vuelva a suspender el pellet en misoginia, caldo o LB por pipeteo, y luego transfiera la suspensión de huevo a un tubo cónico de 15 mililitros. Ahora llene el tubo de 15 mililitros con libras, lave los huevos tres veces en el caldo usando la misma técnica de paso rápido que se acaba de demostrar, y luego diluya los huevos de nematodos P resuspendidos a por lo menos 10 huevos por microlitro.

Transfiera los huevos a una placa de Petri de seis centímetros que contenga cinco mililitros de LB y antibióticos contra las bacterias colonizadoras. La placa puede almacenarse envuelta en perfil hasta cuatro días después del crecimiento nocturno y la selección de las bacterias fluorescentes. Utilice una varilla estéril para esparcir 600 microlitros del cultivo bacteriano en aireados lipídicos de 10 milímetros e incubar el cultivo a 25 grados centígrados.

Después de dos días, dispense de 500 a 5.000 huevos de nematodos en cada placa lipídica. Si el plato ha sido almacenado, lave los huevos en 15 mililitros de LB como se acaba de demostrar al menos una vez antes de inocular los huevos en el césped bacteriano previamente preparado. A continuación, incubar los cocultivos de bacterias nematodos en la oscuridad sin humedad a 25 grados centígrados hasta que los juveniles infecciosos aparezcan como un anillo blanco difuso en el borde de la placa.

Cuando se hayan observado los juveniles infecciosos. Retire la tapa de la placa de agar lipídico y coloque la parte inferior de la placa en el fondo de una placa de Petri vacía de 100 milímetros por 20 milímetros. Luego, llene la placa de Petri con suficiente agua para que llegue hasta aproximadamente la mitad de la altura de la placa más pequeña e incube la trampa de agua hasta que los juveniles infecciosos de la progenie hayan emergido al agua.

Después de recolectar los nematodos del agua o en la etapa de vida deseada del césped bacteriano apropiado, disuelva unos pocos granos de ole en 30 microlitros de agua, y de uno a dos microlitros de este agente paralizante por cada 50 microlitros de muestra de nematodos. A continuación, transfiera unos 20 a 30 microlitros de la muestra de nematodo paralizado a un portaobjetos de microscopio y coloque un cubreobjetos encima de la muestra. Observe los nematodos con microscopía óptica para asegurarse de que los nematodos estén en el campo de visión.

Identificar la localización bacteriana. Fotografíe los nematodos bajo microscopía fluorescente además de la configuración de microscopía óptica y luego superponga las imágenes. Puede ser necesario probar varios aumentos y vistas del nematodo para encontrar las bacterias.

Se contó una población de nematodos de dos medios y se puntuó la colonización por el simbiante bacteriano. Para obtener estadísticas sólidas, es mejor contar al menos 100 nematodos por muestra, con al menos 30 en cada categoría, como se ve en la tabla. Estos nematodos se colonizan a un nivel de aproximadamente 14,6% cuando se cultivan en agar lipídico y 68,6% cuando se cultivan en agar hígado y riñón.

Se ha demostrado que otras especies de nematodos y bacterias tienen diferentes niveles de colonización. Este esquema ilustra la apariencia general de las hembras Steiner NEMA. El recuadro muestra la imagen de contraste de interferencia diferencial de una hembra gráfica S fot con un aumento de 20x.

La flecha negra en el recuadro indica la vulva, mientras que las flechas blancas indican huevos visibles. Esta imagen muestra un huevo de nematodo voltio desarrollado pero sin eclosionar con un aumento de 40x, y estos huevos aislados de los nematodos Volta se fotografiaron con un aumento de 10x. Aquí, se muestran imágenes de microscopio representativas de los nematodos Steiner Nima asociados con la bacteria Xeno aptus en esta primera imagen.

Los nematodos de Alvin se asociaron con su exposición simpática bacteriana que expresa GFP para crear esta imagen compuesta. Una imagen de contraste de fase se superpuso con una imagen fluorescente. La flecha indica las bacterias presentes dentro del nematodo juvenil infeccioso.

Esta imagen muestra un nematodo juvenil de S. carpa capsi con GFP que expresa X nla. La imagen se construyó de manera similar a la imagen anterior y muestra el nematodo juvenil con bacterias marcadas con proteína fluorescente verde visualizadas como los bastones verdes localizados en todo el lumen intestinal del nematodo. Además del procedimiento descrito, se pueden incorporar otros métodos como la manipulación genética del simbio bacteriano antes de la asociación con el huésped nematodo para responder a preguntas adicionales como cuáles son los mecanismos moleculares necesarios para la asociación del microbio huésped.