La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la cutícula en la elegancia del mar vivo y transparente utilizando el ojo de tinte lipofílico fluorescente rojo. Esto se logra preparando una población de nematodos para la tinción. A continuación, se añade un ojo de tinte diluido a la población y se les permite incubar.

A continuación, los animales se recuperan de la solución de tinción. Las imágenes de fluorescencia de la cutícula teñida con Dai muestran detalles en la superficie, incluidas las estructuras reproductivas de los ojos de Ailey y Ann y otras características morfológicas externas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes para visualizar la cutícula en este organismo transparente, como la imagen directa, la fluorescencia, la expresión de transgenes, la tinción de anticuerpos, la microscopía electrónica y la aglutinina de germen de trigo marcada, es que esta técnica es fácil de realizar, relativamente rápida y económica, y produce una hermosa resolución de las estructuras cuticulares en animales vivos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en muchos campos que utilizan el sistema modelo de elegancia marina y su cutícula, como la secreción celular y la organización de la cutícula, el desarrollo de células epidérmicas, las vías genéticas heterocrónicas, la inmunidad innata, el desarrollo de rasgos morfológicos y la evolución de nematodos. El demostrador del procedimiento será Robbie Schultz, un estudiante graduado de mi laboratorio. Cuando trabaje con D Eye, tenga en cuenta que es sensible a la luz.

Proteja siempre el ojo D de la luz envolviéndolo en papel de aluminio. También use guantes y una bata de laboratorio, ya que el DMF es tóxico y el DAI es un automóvil. El cianuro Dai es muy poderoso.

Una dilución de trabajo de fuerza estándar es de 30 microgramos por mililitro de DII en M nine, y una sola población solo requiere 400 microlitros de dilución de trabajo. Comience con una placa de 60 milímetros poblada de nematodos no contaminados. Lavar los animales del plato en 1,5 mililitros de 0,5%Triton X 100.

En el tampón M nine, agite suavemente el líquido con movimientos circulares para aflojar todas las larvas y animales adultos, y luego transfiera el lavado a un tubo de 1,5 mililitros. Gira inmediatamente los animales a 2000 PVP M durante 30 segundos para recoger animales en el fondo del tubo. Deseche la mayor cantidad posible de sobrenadante sin molestar a los animales.

Ten cuidado, no seas codicioso. Lavar los animales con un mililitro de M nueve. Girar hacia abajo y eliminar el sobrenadante.

Repite el lavado. Gire hacia abajo nuevamente y retire el sobrenadante. A continuación, a 400 microlitros de 30 microgramos por mililitro de Dai en M nueve al tubo.

Agite el tubo brevemente para volver a suspender a los animales. A continuación, agite el tubo a 20 grados centígrados en posición horizontal durante tres a 16 horas a 350 RP M en un entorno protegido de la luz. El momento de estos últimos pasos es importante.

En primer lugar, el Triton X debe lavarse antes de que elimine los lípidos a los que se une el dai. En segundo lugar, los animales deben teñirse con una solución ocular de tinte el tiempo suficiente para permitir que la cutícula se tiña uniformemente. Un poco más tarde, se debe permitir que los animales se recuperen con comida el tiempo suficiente para quitar el ojo suelto.

Al final de la tinción, centrifuga los animales y retira la solución de tinte. Lavar los animales con un mililitro de M nueve. Para eliminar el tinte suelto, gire los animales y retire el sobrenadante.

Vuelva a suspender a los animales en 400 microlitros de tampón M nine y viértalos en una porción libre de bacterias de una microplaca NGM. Las semillas con OP 50 E Coli permiten que los animales se recuperen en la oscuridad durante al menos 30 minutos, pero no más de un día porque la fluorescencia del tinte se desvanece durante el tiempo de recuperación. Los animales deben alejarse del líquido que mancha el tinte y llegar a la comida.

Estos animales son más fáciles de fotografiar ya que tienen menos fluorescencia de fondo del ojo con tinte libre. Comience preparando una almohadilla agrícola en un portaobjetos para garantizar un grosor uniforme de la almohadilla agrícola utilizada. Dos espaciadores.

Un espaciador se hace colocando dos trozos de cinta de laboratorio en un portaobjetos de vidrio. Los espaciadores se pueden usar indefinidamente. A continuación, coloque un portaobjetos de vidrio limpio a lo largo entre dos portaobjetos espaciadores, pipetee unos 150 microlitros de agar cuatro fundidos.

En el centro del deslizamiento de vidrio limpio. Cubra rápidamente el AER fundido con un portaobjetos adicional colocado perpendicularmente sobre el AER y ambos espaciadores para formar una almohadilla de agar. Deslice con cuidado la corredera de la cubierta, manteniendo la almohadilla centrada en la parte superior de la corredera de montaje.

Ahora pipetee cinco microlitros de anestésico nematodo en la almohadilla, monte de ocho a 12 animales en el anestésico y cúbralo suavemente con un cubreobjetos de microscopio. Observe a los animales utilizando un microscopio compuesto o confocal equipado con un objetivo de al menos 40 x y un filtro trissy u otro filtro compatible. El máximo de excitación fluorescente del ojo de tinte es de 549 nanómetros y su emisión máxima es de 565 nanómetros.

Para la matriz unida, la imagen es la parte más desafiante de este protocolo. Mostramos cómo montar animales para la obtención de imágenes, pero debe estar debidamente capacitado en el visor compuesto o confocal que utilizará. Descubrimos que el uso de un objetivo con un aumento de al menos 60x es mejor para resolver los detalles iluminados por el método de tinción.

Cada una de las imágenes de esta sección ha sido tomada utilizando un objetivo de 63 x en cartel de sello embrionario elegance. La superficie de la cutícula contiene anualmente separadas por surcos circunferenciales y en algunas etapas crestas longitudinales llamadas ailey. Cada una de las imágenes de esta sección fue tomada con un objetivo de 63x en elegancia C post embrionaria.

La superficie de la cutícula contiene surcos anualizados separados por circunferenciales y en algunas etapas crestas longitudinales llamadas aley. Cada etapa de desarrollo tiene estructuras de cutícula con composiciones y patrones distintos, crestas o surcos de tinción aley y aly fluorescente. Dependiendo de la composición de la superficie.

A lo largo de todas las etapas de larvas y adultos que utilizan este método de tinte en pie, permanecen visibles hasta un día después de la recuperación. A veces se observan manchas fluorescentes de fondo, pero no de forma rutinaria. Esta es la cutícula de animales mutantes adultos que muestran defectos moderados en la organización de la cutícula.

Las crestas de Ailey son discontinuas y supernumerarias. Las crestas de Ailey están fusionadas y ramificadas o bifurcadas, un marcador transgénico común. Un alelo dominante del rollo seis provoca la torsión de la cutícula, que se puede ver en el ailey y puede hacer que los anillos tengan un patrón irregular.

Dai también tiñe otras estructuras exteriores de la cutícula, como el hermafrodita adulto, la vulva y el macho adulto que elevan la cola y el fan dai también puede resaltar defectos sutiles en la morfología externa como esta cola bifurcada, tinción insuficiente. Por ejemplo, una tinción de dos horas conduce a una tinción cuticular irregular, aunque las neuronas expuestas al medio ambiente pueden mancharse. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas, sin incluir las imágenes si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo teñir la elegancia del mar con el ojo de troquel para observar la cutícula y otras estructuras morfológicas externas.