Evaluación de Generación de la Fuerza isométrica y excéntrica de los músculos esqueléticos Aislados de modelos murinos de Distrofias Musculares

El objetivo general de este procedimiento es medir las propiedades mecánicas de los músculos esqueléticos aislados de ratones. Esto se logra diseccionando primero el músculo extensor largo de los dedos o EDL, así como el músculo del diafragma del animal. Después de preparar una tira de diafragma, sujete el EDL y la tira de diafragma en un plato de solución de timbre oxigenado y luego ate los bucles de sutura a ambos extremos de los músculos.

A continuación, la EDL o tira de diafragma se asegura en un baño de órganos entre dos electrodos unidos a un transductor de fuerza o palanca en un extremo y se ajusta a su longitud óptima en función de la fuerza de contracción. El paso final es estimular el músculo utilizando una serie de protocolos mecánicos y medir la producción de fuerza. En última instancia, el cálculo de la producción de fuerza, la resistencia al daño, la relación entre la frecuencia de la fuerza y otras propiedades se utilizan para mostrar la fuerza y la integridad y otras propiedades del músculo y, si corresponde, los efectos de un tratamiento o modificación genética.

Esta técnica se puede utilizar para probar posibles terapias para las distrofias musculares porque la mayoría de estas terapias tienen como objetivo recuperar la fuerza muscular y reducir la fragilidad muscular. Aunque no somos los primeros en utilizar esta técnica, la utilizamos de forma rutinaria para estudiar una serie de diferentes modelos de ratón y evaluar su función muscular, y también para caracterizar y evaluar múltiples terapias para las distrofias musculares. Además de la Dra. Catherine Morewood, demostraremos este procedimiento utilizando dos miembros de nuestro núcleo de evaluación fisiológica, el Dr. Min Liu, investigador asociado, y el Sr. Ian, especialista en investigación.

Los ratones utilizados en este procedimiento se anestesian con ketamina y xilacina para asegurarse de que no experimenten dolor ni angustia, pero los músculos permanecen bien oxigenados por la circulación. Después de confirmar con un pellizco en el dedo del pie que el animal está suficientemente anestesiado, inmovilizar sus extremidades superiores con cinta médica y retirar la piel de la extremidad posterior anterior inferior para exponer los músculos de esta área, mantener los músculos húmedos con la aplicación de PBS a intervalos regulares. Bajo un endoscopio de disección, se realiza una pequeña incisión lateral a la rodilla para exponer el tendón proximal del músculo extensor largo de los dedos o EDL.

Hay dos tendones en esta región y ambos deben cortarse para permitir la extirpación de la EDL en el tobillo medial. Cortar el tendón del músculo tibial anterior o TA para exponer los tendones distales de la EDL, que se extienden a lo largo de los metatarsianos. Levanta el músculo TA para que no estorbe.

Tenga cuidado de no cortar ni tocar el EDL que se encuentra debajo. Regrese a los tendones distales de la EDL y corte cada uno. A continuación, agarre los tendones y separe suavemente el EDL del resto de la extremidad.

Debe soltarse libremente desde el extremo proximal. Retire el músculo EDL y colóquelo en un plato de disección lleno de escurridores oxigenados fríos. Sujeta el músculo a través de los tendones a una longitud aproximadamente en reposo, que es la longitud que se encuentra in vivo.

La longitud es demasiado corta cuando el músculo está hundido en la placa y demasiado larga si el músculo tira de los alfileres de disección. Ate las suturas a los tendones lo más cerca posible del músculo, pero sin tocar el músculo. Sujete el músculo a una longitud aproximada en reposo con las suturas.

Para iniciar este procedimiento. Hacer una incisión en la piel del animal sacrificado. Para exponer la cavidad abdominal y torácica.

Abra la cavidad abdominal y corte la pared del cuerpo justo debajo de las costillas con unas tijeras para huesos y comenzando por encima de la inserción del diafragma. Corta alrededor de toda la caja torácica siguiendo la línea de las costillas y corta a través de la columna vertebral. Corta los vasos sanguíneos que atraviesan el centro del diafragma para que el diafragma se pueda quitar fácilmente.

Retire el diafragma del ratón y colóquelo en un plato de disección lleno de timbres oxigenados. Agite suavemente el diafragma en el plato para lavar la sangre. Actualice la solución del timbre según sea necesario.

A continuación, corte una pequeña tira del diafragma desde el tendón central hasta las costillas a lo largo de la orientación de las fibras en la parte central de los hemiodiafragmas laterales. La tira debe tener entre dos y cuatro milímetros de ancho. Ate las suturas al tendón central, ate las suturas a cada uno de los extremos de las costillas que sobresalen lateralmente y luego átelas para hacer un lazo grande con tijeras para huesos.

Corta la nervadura a cada lado de la tira, dejando aproximadamente uno o dos milímetros, sobresaliendo de la nervadura a cada lado del diafragma. La evaluación de la generación de fuerza de la tira de los músculos esqueléticos aislados se realiza mediante un sistema de prueba muscular in vitro para montar los músculos en el baño mecánico, agarrar las suturas y usarlas para unir el músculo a un poste rígido en un extremo y a un transductor de fuerza en el otro extremo. Una buena aproximación es la longitud del músculo en reposo.

Como se muestra anteriormente, el baño se llena con una solución de timbres oxigenados que se mantiene a 22 grados centígrados. Para prolongar la estabilidad muscular se debe descansar durante cinco minutos en este baño previo a la prueba funcional, de manera que la temperatura muscular se equipare a 22 grados centígrados para establecer condiciones de estimulación supra máxima. Después de colocar un músculo en el baño, use pulsos de estimulación individuales de 0.5 milisegundos para generar una contracción y monitorear la salida de fuerza.

Aumente gradualmente la corriente hasta que la fuerza alcance un nivel máximo pero constante, aumente la corriente a un 10% más que este nivel para que los experimentos restantes establezcan la longitud óptima, primero, asegúrese de que el músculo no esté flojo, pero tampoco enseñado. Una buena aproximación es la longitud del músculo en reposo, como se ha mostrado anteriormente. Mediante estimulaciones de contracción isométricas, ajuste la longitud del músculo gradualmente hasta obtener una fuerza máxima.

Descansa el músculo unos 10 segundos entre cada contracción. La longitud muscular óptima se logra cuando la fuerza de contracción es la longitud muscular máxima registrada utilizando calibradores vernier. Para la EDL, es la longitud entre las uniones miotendinosas.

Para el diafragma, es la longitud entre la unión miotendinosa del tendón central y la inserción del músculo a la costilla. Para determinar la fuerza isométrica máxima del Titanic, estimule el conjunto muscular a la longitud muscular óptima durante un período de 500 milisegundos con una serie de pulsos de 0,5 milisegundos a la estimulación súper máxima y a la frecuencia de fusión. La meseta para los músculos EDL se alcanza típicamente con 120 hercios y para los músculos del diafragma con 100 hercios, estimula tres veces a la frecuencia respectiva con períodos de descanso de cinco minutos entre episodios de estimulación para cada músculo después de un descanso de cinco minutos.

Después de realizar contracciones isométricas, comience el procedimiento para las contracciones excéntricas. Estimule el músculo a 80 hercios isométricamente durante los 500 milisegundos iniciales, seguido de un estiramiento de la longitud muscular óptima del 10% en la estimulación final de 200 milisegundos. Repita el patrón de estimulación con descansos de cinco minutos entre ellos.

Para el número deseado de contracciones excéntricas, mida la fuerza de cada contracción en el período de tiempo anterior al estiramiento. Calcule la caída de fuerza entre la primera y la última contracción al finalizar la prueba funcional. Acorte la longitud del músculo y retire suavemente el músculo del transductor y el poste.

Regrese el músculo a un plato de disección con timbres. Retire las suturas de los músculos para el músculo EDL. Bloquee el músculo dos veces y luego péselo antes del procesamiento posterior.

Esto será importante para calcular el área de la sección transversal y la fuerza específica para que el músculo del diafragma se sumerja en 0,1% de pros y naranja, una membrana y un tinte permeado durante 15 a 20 minutos. Esto proporcionará un índice de daño de disección, diseccionará el músculo del diafragma lejos de la inserción ósea, así como el tendón central. Esto es necesario para proporcionar un peso preciso de la mancha muscular antes del pesaje y la preparación posterior.

El área de la sección transversal o CSA se calcula utilizando la siguiente fórmula, donde L sobre LO es la relación entre la fibra y la longitud del músculo y 1,06 es la densidad del músculo, los valores esperados para las fuerzas isométricas en los músculos salvajes C 57 y la distrofia muscular o M-D-X-E-D-L de animales de 12 semanas de edad. Debido a que los músculos MDX exhiben hipertrofia compensatoria, la fuerza total a titánica puede ser mayor en el músculo MDX en comparación con los controles de tipo salvaje de la misma edad. Una medida más apropiada de la salida funcional es la fuerza específica, donde la fuerza se normaliza para el área de la sección transversal.

Para calcular este valor, la fuerza específica depende de la capacidad funcional inherente del músculo, donde la debilidad en los músculos distróficos es más evidente cuando se tienen en cuenta tanto la fuerza absoluta como el área de la sección transversal. Se observó en este estudio que los músculos EDL de los ratones MDX generan aproximadamente un 20 a 25% menos de fuerzas específicas que los de los ratones de tipo salvaje de 10 a 26 semanas de edad. Para el diafragma, solo la fuerza específica es relevante para las comparaciones porque la preparación es una pieza del músculo que depende de la disección.

Una comparación de la fuerza específica entre el músculo de tipo salvaje C 57 indicado por la línea azul y el músculo del diafragma MDX indicado por las barras rojas refleja la patología progresiva en este tejido. La producción de fuerza isométrica disminuye con la edad, de modo que a los seis meses de edad, los músculos del diafragma de los ratones MDX no producen más de la mitad de la producción funcional de las tiras de diafragma de los controles de tipo salvaje de la misma edad. En esta figura se muestra un ejemplo de contracciones excéntricas de la prueba de diafragma.

Con cada contracción excéntrica subsiguiente, la salida de fuerza disminuye en las tiras de diafragma de ambos ratones de tipo salvaje C 57 que se muestran en azul y MDX que se muestran en rojo. Sin embargo, la pérdida de fuerza es más dramática en las muestras de músculo del ratón MDX, presumiblemente por la ausencia de distrofina y sus proteínas asociadas una vez dominadas. Esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora para un solo músculo si se realiza correctamente siguiendo esta técnica.

Se pueden utilizar otros métodos, como la Western blot u otras mediciones bioquímicas, para responder a preguntas adicionales, como si el tratamiento alteró los niveles de proteínas o normalizó la integridad muscular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar el EDL y el diafragma del mouse y cómo medir y analizar la producción de fuerza antes y después de las contracciones excéntricas.