Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo

Este experimento utiliza citometría de flujo para detectar y cuantificar proteínas nucleares en núcleos aislados e inmunomarcados de neutrófilos para purificar los neutrófilos de sangre periférica humana. Extracción de los glóbulos rojos con dextrina seguida de centrifugación en gradiente de densidad del plasma. Luego, usando anticuerpos antirreceptores, estimule los neutrófilos purificados a través de integrinas o receptores FC.

Se procede al aislamiento de los núcleos y a la fijación de las muestras para su inmunomarcaje con anticuerpos específicos frente al factor nuclear NU de interés. Por ejemplo, NF kappa B finalmente analiza los núcleos por citometría de flujo con el fin de detectar pequeños cambios en la activación del factor nuclear. Se obtienen resultados que muestran que la estimulación de los neutrófilos a través de sus integrinas conduce a un aumento en la concentración nuclear del factor de transcripción N de kappa B. Las vías de señalización que conducen a la activación del factor nuclear generalmente se estudian mediante ensayos de genes reporteros o mediante ensayos de cambio de movilidad electroforética en células primarias.

A menudo, estos métodos no son adecuados. La citometría de flujo ofrece una rápida detección y cuantificación de proteínas nucleares en núcleos aislados. Comience con 10 mililitros de sangre recién recolectada de voluntarios adultos sanos.

Pipetear dos mililitros de solución de T 500 al 6% de dextrina en un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros. Luego agregue 10 mililitros de sangre mezclada invirtiendo el tubo dos o tres veces y deje pasar 45 minutos para la sedimentación globular por gravedad en un tubo centrífugo cónico fresco de 15 mililitros. Coloque cinco mililitros del paquete FI fial.

Recolecta el plasma rico en leucocitos que se formó por encima de los eritrocitos sedimentados. Colóquelo con cuidado en la parte superior del paquete de fial para formar dos fases, centrifugar a 516 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y rompa el pellet de la celda golpeando el tubo contra la rejilla.

A continuación, vuelva a suspender las células en 10 mililitros de PBS frío. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga cónico de 50 mililitros y centrifugue a 290 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Rompa el pellet celular como antes y agregue 10 mililitros de solución hipotónica fría a los eritrocitos de lejía.

Mezcle girando el tubo suavemente durante exactamente un minuto. A continuación, agregue 10 mililitros de mezcla de solución hipertónica fría y almacene en hielo. Ahora enumere las células después de peletizar los neutrófilos por centrifugación.

Suspendemos el PMN a 10 a las siete celdas por mililitro. En PBS frío, mantenga las celdas en hielo. Alícuota de 100 microlitros de suspensión de PMN en tubos einor de 1,5 mililitros.

A continuación, añadir el anticuerpo monoclonal correspondiente a 10 microgramos por mililitro e incubar en hielo durante 15 minutos. Para lavar las células, agregue un mililitro de centrífuga PBS fría y aspire el sobrenadante. A continuación, rompa suavemente el pellet de la celda y lávelo dos veces más con PBS.

Para eliminar el anticuerpo no unido, vuelva a suspender el PMN lavado en el mismo volumen inicial de PBS caliente que contenga 60 microgramos por mililitro de IgG go anti muse incubado a 37 grados Celsius durante uno a 20 minutos, dependiendo del factor nuclear de interés. Ahora agregue un mililitro de PBS frío Después de peletizar las celdas por centrifugación, retire el snat y congele los gránulos de celdas inmediatamente en un baño de etanol con hielo seco. Para cada muestra, retire el tubo del juego de hielo seco, limpie y resuelva.

Suspender los pellets de PMN congelados en 100 microlitros de solución hipotónica fría. Coloque todas las muestras en hielo para monitorear la integridad de los núcleos. Teñir un Eloqua de la suspensión de los núcleos con azul triano.

Si la suspensión de núcleos contiene muchas células intactas o desechos, es mejor descartar la preparación y comenzar el procedimiento con otra muestra. Después de peletizar los núcleos por centrifugación, retire el sobrenadante con mucho cuidado y luego fije los núcleos a 100 microlitros de solución fría de aldehído paraformado al 4% e incube los núcleos en hielo. Después de peletizar los núcleos, retire con cuidado el snat a 100 microlitros de tampón de permeación fría e incube las muestras en hielo durante 10 minutos.

A continuación, recoja los núcleos de perme por centrifugación. En este punto, los gránulos de los núcleos no se adhieren bien en la parte inferior del tubo. Se recomienda volver a centrar el futuro.

Si el pellet se afloja Para bloquear los sitios de unión inespecíficos, suspendemos los núcleos en 500 microlitros de suero bovino fetal frío al 4% en PBS e incubamos en hielo durante 20 minutos. Granular los núcleos por centrifugación, luego resuspender los núcleos y 100 microlitros de PBS frío que contienen 4% de FBS y 2,5 microgramos por mililitro del anticuerpo monoclonal contra el factor nuclear de interés. Incubar las muestras en hielo durante 20 minutos después de lavar las muestras dos veces con 500 microlitros de PBS frío con 4% de FBS, suspendemos los núcleos en 100 microlitros de PBS frío que contienen 4% de FBS y 10 microgramos de mililitros del anticuerpo secundario marcado con FZ correspondiente incubamos en hielo durante 20 minutos después de dos lavados, volvemos a suspender los núcleos en 400 microlitros de 4% de paraldehído frío en PBS.

Analice los núcleos inmunomarcados en un citómetro de flujo, como un escáner de datos o un aparato similar. Ajuste la configuración de adquisición dos FSC a escala logarítmica a 10 a la negativa SSC a escala logarítmica a 196 y núcleos de puerta en la gráfica de adopción. Adquiere 10.000 núcleos por muestra.

A continuación, analice la fluorescencia de los núcleos de tinción fitsy a través del FL de un canal establecido a escala logarítmica a 400. Este método de purificación de PMN generalmente proporciona neutrófilos no estimulados con una pureza superior al 95% de los núcleos de PMN aislados con altos rendimientos, aislados a núcleos, se pueden reconocer fácilmente como una población diferente de PMN intacto en el citómetro de flujo con un diagrama de puntos tras la estimulación. Mediante la reticulación de las integrinas beta one, NF kappa B se traslada al núcleo y este incremento en la NF kappa B nuclear se detecta como un aumento en la fluorescencia.

De manera similar, la estimulación de PMN mediante la reticulación de integrinas beta dos también induce la activación de NF kappa B, como lo indica un aumento en la fluorescencia. La sensibilidad de este método permite la detección de pequeños cambios en los niveles de factores nucleares, como lo demuestra el hecho de que las integrinas beta uno, que se unen a proteínas de la matriz extracelular como la fibronectina, inducen una activación más fuerte de NF kappa B que las integrinas beta dos, que se unen a moléculas de adhesión en otras células. Este método presenta una gran flexibilidad debido a que se pueden utilizar muchos fluorocromos diferentes y debido a que permite la preparación de núcleos de diferentes tipos de células, utilizando este enfoque simple y económico para estudios de transducción de señales que involucran cambios en los niveles de proteínas en el núcleo de una variedad de tipos de células.