Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo

Este experimento utiliza citometría de flujo para detectar y cuantificar proteínas nucleares en núcleos aislados y marcados inmunológicamente a partir de neutrófilos, con el fin de purificar los neutrófilos de sangre periférica humana. Elimine los glóbulos rojos con dextrina seguido de centrifugación en gradiente de densidad del plasma. Luego, utilizando anticuerpos antirreceptores, estimule los neutrófilos purificados a través de integrinas o receptores Fc.

Proceda a aislar los núcleos y fije las muestras para inmunomarcar con anticuerpos específicos contra el factor nuclear NU de interés. Por ejemplo, NF kappa B, y finalmente analice los núcleos mediante citometría de flujo para detectar pequeños cambios en la activación del factor nuclear. Se obtienen resultados que muestran que la estimulación de los neutrófilos a través de sus integrinas conduce a un aumento en la concentración nuclear del factor de transcripción N de kappa B. Las vías de señalización que llevan a la activación del factor nuclear generalmente se estudian mediante ensayos de genes reporteros o mediante ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética en células primarias.

A menudo, estos métodos no son adecuados. La citometría de flujo ofrece una detección y cuantificación rápidas de proteínas nucleares en núcleos aislados. Comience con 10 mililitros de sangre recién recolectada de voluntarios adultos sanos.

Pipetee dos mililitros de solución de dextrina al 6 % T 500 en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros. A continuación, agregue 10 mililitros de sangre mezclada invirtiendo el tubo dos o tres veces y deje 45 minutos para la sedimentación eritrocítica por gravedad en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros nuevo. Coloque cinco mililitros del envase FI fial.

Recolecte el plasma rico en leucocitos que se formó por encima de los eritrocitos sedimentados. Colóquelo cuidadosamente encima del fial pack para formar dos fases, centrifugue a 516 G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante y rompa el botón celular golpeando el tubo contra el rack.

Luego, resuspenda las células en 10 mililitros de PBS frío. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de centrífuga de 50 mililitros y centrifugue a 290 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Desintegre el sedimento celular como antes y agregue 10 mililitros de solución hipotónica fría para lisar los eritrocitos.

Mezcle agitando suavemente el tubo exactamente durante un minuto. A continuación, agregue 10 mililitros de la mezcla fría de solución hipertónica y almacene en hielo. Ahora cuente las células tras el pellet de neutrófilos por centrifugación.

Suspendemos los PMN a 10 a la siete células por mililitro. Mantenemos las células en hielo en PBS frío. Aliquotamos 100 microlitros de la suspensión de PMN en tubos eppendorf de 1,5 mililitro.

Luego, agregue el anticuerpo monoclonal correspondiente a 10 microgramos por mililitro e incube en hielo durante 15 minutos. Para lavar las células, agregue un mililitro de PBS frío, centrifugue y aspire el sobrenadante. A continuación, rompa suavemente el botón celular y lave dos veces más con PBS.

Para eliminar el anticuerpo no unido, re suspenda los PMN lavados en el mismo volumen inicial de PBS tibio que contiene 60 microgramos por mililitro de IgG anti ratón, incube a 37 grados Celsius durante uno a 20 minutos según el factor nuclear de interés. Ahora agregue un mililitro de PBS frío. Después de pelotar las células por centrifugación, retire el sobrenadante y congele inmediatamente los pellet celulares en un baño de hielo seco con etanol. Para cada muestra, retire el tubo del baño de hielo seco con etanol, límpielo y re suspenda.

Suspenda los pellet de PMN congelados en 100 microlitros de solución hipotónica fría. Coloque todas las muestras en hielo para monitorear la integridad de los núcleos. Tiña un Eloqua de la suspensión de núcleos con azul de trian.

Si la suspensión de núcleos contiene muchas células intactas o restos celulares, es preferible descartar la preparación e iniciar el procedimiento con otra muestra. Después de sedimentar los núcleos por centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante y luego fije los núcleos en 100 microlitros de solución fría de paraformaldehído al 4 % e incube los núcleos en hielo. Después de sedimentar cuidadosamente los núcleos, retire el sobrenadante y añada 100 microlitros de tampón frío de permeabilización e incube las muestras en hielo durante 10 minutos.

Luego, recoger los núcleos permeables mediante centrifugación. En este punto, los pellets de núcleos no se adhieren bien al fondo del tubo. Se recomienda centrifugar nuevamente.

Si el precipitado se suelta, para bloquear los sitios de unión no específicos, suspendemos los núcleos en 500 microlitros de suero bovino fetal al 4 % frío en PBS e incubamos en hielo durante 20 minutos. Precipitamos los núcleos por centrifugación, luego resuspendemos los núcleos en 100 microlitros de PBS frío que contiene 4 % de FBS y 2,5 microgramos por mililitro del anticuerpo monoclonal contra el factor nuclear de interés. Incubamos las muestras en hielo durante 20 minutos; tras lavar las muestras dos veces con 500 microlitros de PBS frío con 4 % de FBS, suspendemos los núcleos en 100 microlitros de PBS frío que contiene 4 % de FBS y 10 microgramos por mililitro del anticuerpo secundario marcado con FZ correspondiente; incubamos en hielo durante 20 minutos. Tras dos lavados, resuspendemos los núcleos en 400 microlitros de paraformaldehído frío al 4 % en PBS.

Analice los núcleos inmunomarcados en un citómetro de flujo, como un FACS Scan o un aparato similar. Ajuste la configuración de adquisición con dos FSC en escala logarítmica a 10 elevado a menos uno, SSC en escala logarítmica a 196, y seleccione los núcleos en un gráfico bivariado. Adquiera 10.000 núcleos por muestra.

Luego analice la fluorescencia de los núcleos teñidos con fitsy mediante el canal FL1 ajustado a escala logarítmica a 400. Este método de purificación de PMN generalmente proporciona neutrófilos no estimulados con una pureza superior al 95 %; los núcleos de PMN se aíslan con altos rendimientos y, una vez aislados, pueden reconocerse fácilmente como una población distinta de PMN intactos en el citómetro de flujo mediante un diagrama de dispersión tras la estimulación. Al entrecruzarse las integrinas beta1, NF-kappa B se transloca al núcleo y este incremento en NF-kappa B nuclear se detecta como un aumento en la fluorescencia.

De manera similar, la estimulación de los PMN mediante el entrecruzamiento de integrinas beta dos también induce la activación de NF-kappa B, como lo indica un aumento en la fluorescencia. La sensibilidad de este método permite la detección de pequeños cambios en los niveles del factor nuclear, como se evidencia por el hecho de que las integrinas beta uno, que se unen a proteínas de la matriz extracelular como la fibronectina, inducen una activación más fuerte de NF-kappa B que las integrinas beta dos, que se unen a moléculas de adhesión en otras células. Este método ofrece una gran flexibilidad porque se pueden utilizar muchos fluorocromos diferentes y permite la preparación de núcleos provenientes de distintos tipos celulares; utilice este enfoque sencillo y económico para estudios de transducción de señales que impliquen cambios en los niveles de proteínas en el núcleo de una variedad de tipos celulares.