Células Madre Programación para Terapéutico Angiogénesis Uso Biodegradable polimérico nanopartículas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso de nanopartículas poliméricas para la sobreexpresión de genes terapéuticos en células madre utilizando un modelo de isquemia de extremidades traseras marinas. Esto se logra sintetizando primero polímeros biodegradables a través de una reacción de edición de micrófono de dos pasos, seguida de la fabricación de nanopartículas poliméricas que codifican genes terapéuticos. El segundo paso es transfectar células madre derivadas del tejido adiposo humano in vitro al factor de crecimiento endotelial vascular sobreexpresado.

A continuación, las células madre programadas se inyectan por vía intramuscular en una extremidad posterior isquémica para la producción de dos factores terapéuticos. El paso final es monitorizar la supervivencia celular y la reperfusión sanguínea en la extremidad isquémica a lo largo del tiempo mediante imágenes de bioluminiscencia y láser Doppler. En última instancia, se puede realizar la expresión génica cuantitativa y la histología para mostrar la expresión localizada de los factores terapéuticos y la eficacia de la regeneración de tejidos.

La ventaja de esta técnica sobre los métodos convencionales para la angiogénesis es el uso de células madre como vehículos para la administración de fármacos. Esta estrategia nos permite emplear la capacidad natural de las células madre para migrar hacia la isquemia, y también permite respuestas dinámicas a las señales microambientales. Las nanopartículas utilizadas para la entrega de ADN plasmático son altamente eficientes y biodegradables, lo que permite una menor citotoxicidad y un mayor número de copias de ADN entregadas intracelularmente.

Esta técnica se puede aplicar a muchas terapias basadas en células clínicamente relevantes porque utiliza un vector no viral biodegradable para insertar genes en células autólogas que trabajan en una campana extractora, pesa el dial de butano DLI y transfiere el material a un vial de inhalación de vidrio que contiene una barra de agitación. A continuación, agregue cinco pentol de cinco aminoácidos precalentados al mismo vial. Coloque inmediatamente el vial en una placa de agitación y ajuste la velocidad a 600 RPM.

Transfiera el vial a un horno configurado a 90 grados centígrados y aumente la velocidad de agitación a 1000 RPM después de cuatro horas, baje la velocidad a 300 RPM y revuelva durante 12 a 16 horas adicionales. Cuando esté listo, agregue 10 mililitros de tetra hidrourán anhidro a cinco gramos de C 32 en un vial de vidrio que contenga una barra agitadora. Después de envolver en un vórtice de aluminio a temperatura alta hasta que se disuelva por completo en un vial de vidrio separado que contenga una barra de agitación, agregue 10 milimolares de tetraetilenglicol diamina.

Agregue 40 mililitros de THF a este vial, coloque ambos viales en una placa para remover durante cinco minutos antes de combinarlos. Cubra el resultado con papel de aluminio y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 24 horas. El producto final se denomina C 32 1 22.

A continuación, transfiera 30 mililitros de éter dathyl anhidro a cada uno de los cinco tubos falcon de 50 mililitros. Después de agregar C 32 1 22 al éter dil anhidro, una solución turbia blanca forma un vórtice en el tubo y luego lo centrifuga. El polímero extraído se acumulará en la base del tubo, desechará la solución superior y repetirá estos pasos dos veces más.

Una vez extraídos, coloque los tubos abiertos en el desecado y aspire durante la noche, asegúrese de que los tubos estén protegidos de la luz. Al día siguiente, pesa los tubos que contienen C 32 1 22 para determinar la masa final. Finalmente, disuelva el polímero extraído en DMSO anhidro a una concentración de 100 miligramos por mililitro.

Para la preparación de nanopartículas. Primero diluir el ADN plasmático hasta una concentración final de 120 microgramos por mililitro en acetato de sodio, en un segundo tubo diluir C 32 1 22 hasta una concentración final de 3,6 miligramos por mililitro. En acetato de sodio, combine el contenido de cada tubo en un solo tubo Falcon de 15 mililitros y haga vórtice inmediatamente en alto durante 10 segundos.

Deje que el tubo se asiente a temperatura ambiente durante 10 minutos para que se formen nanopartículas mientras se forman las nanopartículas. Reemplace el medio en un matraz de cultivo de tejidos previamente asentado con 7,8 mililitros. DMEM totalmente complementado.

Transfiera la solución de nanopartículas al matraz de cultivo de tejidos y extiéndala uniformemente antes de colocarla en la incubadora. Después de dos horas, reemplace el medio que contiene nanopartículas con DMEM. Después de cuatro horas, las células están listas para la inyección in vivo.

Cuando las células transfectadas estén listas, cuente las células giradas a una densidad de 10 veces 10 de las seis células por mililitro en PBS para asegurarse de que cada ratón reciba una cantidad igual. Separe las suspensiones celulares en tubos de einor a un volumen de 110 microlitros. A continuación, anestesia a un ratón que haya sufrido previamente isquemia de las extremidades traseras.

Después de confirmar la anestesia con un pellizco en el dedo del pie, limpie el sitio de la inyección con una jeringa de calibre 27. Vuelva a suspender las celdas y extraiga 100 microlitros de la suspensión. Inyecte la mitad de la suspensión celular en la región del músculo aductor y luego inyecte la otra mitad en la región del músculo de la pantorrilla.

Después de inyectar, deje la jeringa en su lugar durante al menos 15 a 30 segundos para evitar fugas. Cuando se completen las inyecciones, mantenga al animal caliente hasta que se recupere por completo. Para obtener imágenes de bioluminiscencia, confirme la anestesia con un pellizco en el dedo del pie y luego limpie el sitio de la inyección como se muestra anteriormente.

Llene una jeringa de insulina con 100 microlitros de Lucifer e inyéctela por vía intraperitoneal. Antes de colocar al animal en la cámara de imágenes de luciferasa ivus, tome imágenes de los ratones con un tiempo de exposición de un minuto. Cuando se adquiera la imagen, marque la región de interés.

En este caso, la extremidad isquémica en el sitio de inyección de la célula continúa midiendo la señal de luciferasa cada tres a cinco minutos hasta que la señal alcanza un pico y comienza a disminuir. Este es el valor utilizado para la comparación entre ratones y, a lo largo del tiempo, cuando se complete, retire los ratones de la cámara y mantenga al animal caliente hasta que se recupere por completo. Los tejidos se cosechan en el momento seleccionado.

Puntos después de la transfección después de la eutanasia, corte la piel que rodea la extremidad posterior circunferencialmente en la región abdominal distal y proximal a la extremidad posterior. Después de tirar de la piel hacia atrás, amputa la extremidad entre la articulación pélvica y el fémur. Por último, se aíslan el aductor medial y los músculos gástricos.

Para un análisis más detallado, estas imágenes retratan la síntesis de C 32 1 22. Aquí, el C 32 AC terminado relacionado con ACR se formó mediante una reacción de edición de micrófono entre un monómero con grupos extremos DAL y un monómero con un grupo final medio am primario. En este ejemplo, los polímeros PBAE modificados se pueden formar mediante la adición de monómeros terminados en una media para mejorar la eficiencia de la transfección.

Una transfección exitosa es evidente por la sobreexpresión de la proteína fluorescente verde como se ve aquí. Estos datos de imágenes de bioluminiscencia muestran un ratón en el día cero y el día 14. Después de inyectar células madre derivadas del tejido adiposo positivo para GFP luciferasa en la extremidad posterior, las imágenes Doppler representativas demuestran la inducción de isquemia en un lado de la extremidad posterior en espejo en el día cero y una reperfusión sanguínea exitosa.

14 días después de la inyección de VEGF con sobreexpresión de células madre derivadas del tejido adiposo. R-T-P-C-R confirmó el éxito de la regulación positiva de vgf, la proteína terapéutica codificada en el grupo tratado, cuatro días después de la inyección celular, mientras que no se detectó ninguna expresión en el control PBS. Se pueden realizar otros métodos que aplican un enfoque combinado de administración de células madre y genes para identificar nuevos objetivos terapéuticos para promover la regeneración de tejidos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo sintetizar polímeros biodegradables para la terapia génica no viral y usar estos polímeros para programar células madre para el tratamiento de la isquemia y la vida.