Name: Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprende a preparar neuronas primarias de rata para microscopía crioelectrónica mediante vitrificación en rejillas de EM. Este protocolo permite visualizar la ultraestructura de neuritas en estado hidratado congelado sin fijadores químicos.

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Esta investigación ha sido apoyada por las subvenciones del NIH (PN2EY016525 y P41GM103832). SHS fue apoyado por una beca del Programa de Postgrado de Formación Nanobiología Interdisciplinario del Centro WM Keck Interdisciplinarias Bioscience Formación de la Costa del Golfo de Consorcios (NIH Grant N º T32EB009379). SHS disecado, creció y DRG y las células del hipocampo vitrificada; recolectó datos crio-ET de DRG y axones del hipocampo crio-EM y, reconstruido y color anotado la serie de inclinación. MRG disecada y proporcionó las células del hipocampo en el laboratorio del MNR. SC asistido en la anotación serie inclinación. SHS fue entrenado por CW sobre la forma de diseccionar y crecer neuronas. SHS, WCM y WC concibieron los experimentos. SHS preparado el manuscrito con el aporte de otros autores. Este video fue filmado en el Centro de la Imagen y Celular NanoAnalytics (C-CINA) del Biozentrum de tque la Universidad de Basilea. C-CINA se integra en el Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas (D-BSSE) de la ETH Zürich, ubicado en Basilea, Suiza.

1. La preparación de platos con EM Grids for Plating neuronas primarias <ol><li> Examine la integridad de carbono perforado en las redes de EM oro utilizando un microscopio óptico con un aumento de por lo menos 25 veces. Haga agujeros de carbono estén&gt; 98% intacto. </li><li> Para chapado neuronas primarias, use un mechero Bunsen a la llama-esterilizar las redes de EM y al mismo tiempo hacerlas hidrófilas. Utilice pinzas para recoger la red EM por los bordes, no en la zona cuadriculada central. PRECAUCIÓN: Nunca deje un mechero Bunsen encendida sin supervisión, y no use guantes o pinzas con componentes de plástico, mientras que la realización de estos pasos: <ol><li> Antes de encender el mechero Bunsen, fijar los ajustes de aire y gas a una posición mínimamente abierta. </li><li> Encender el quemador Bunsen usando un pedernal delantero o butano. </li><li> Modificar los ajustes de aire y de gas para lograr una pequeña llama interior, azul dentro de un encendedor de llama azul / violeta más alto. La punta de la llama interior es la parte más caliente de la llama. La manzana debajoNeath el quemador ajusta la cantidad de gas que entra en el tubo del quemador, mientras que el barril del quemador se puede girar para ajustar la cantidad de aire que entra en el quemador. Al girar el ajuste de aire en sentido horario disminuye el aire (lo que resulta en una llama púrpura) y sentido antihorario, aumentará el aire (lo que resulta en una llama amarilla). </li><li> Con unas pinzas de metal (no hay piezas de plástico) para sujetar la rejilla EM, pasar rápidamente a través de la llama dos veces, con el lado de carbón. El lado de carbono aparecerá más mate (menos brillante) y con más de un tinte de color grisáceo que el otro lado. </li><li> Transferir inmediatamente la rejilla (del lado de carbono hacia arriba) en el centro del plato con fondo de vidrio colocado dentro de los 10 cm del mechero Bunsen. Utilice una rejilla EM por placa (Figura 1). Sólo use platos con fondo de cristal que se Preesterilizadas, es decir, a través de irradiación gamma. </li></ol></li><li> Utilice un microscopio de luz para comprobar la integridad de red (agujeros de carbono intacta), mientras que todavía mantiene la rejilla EM dentro del cristal-bottplato om (para evitar la contaminación). Cuando la aplicación de cualquier sustancia en la parrilla o cualquier cosa que entre en contacto con las neuronas, utilice el procedimiento estéril y puntas de pipeta estériles. </li><li> En una campana de cultivo de tejido utilizando el procedimiento estéril, aplicar 250 l de la sustancia de recubrimiento apropiado lentamente y con cuidado a la zona central de cristal de la placa de Petri. Asegúrese de que la sustancia de recubrimiento adecuado cubre toda la red de EM. <ol><li> Para las neuronas del hipocampo, usar poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) como la sustancia de recubrimiento, preparado como se ha descrito previamente 19. Tenga en cuenta que se necesitan 250 l por rejilla EM, por plato, así que la escala del lote correspondiente. Para ganglio de la raíz dorsal (DRG), las neuronas, utilizar una mezcla de proteína gelatinosa secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de ratón (véase la Tabla de Materiales y Reactivos) como la sustancia de recubrimiento, preparar como sigue. Tenga en cuenta que se necesitan 250 l por rejilla EM, por plato, así que la escala del lote correspondiente. <ol><li> Descongele una botella stockde la mezcla de proteína gelatinosa secretada por Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratón (EHS) la noche a 4 ° C. </li><li> Mantener frío la mezcla de proteína gelatinosa secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de ratón, y todos los componentes utilizados para hacer la solución, es decir, manteniéndolos en hielo. </li><li> Mientras que en el hielo, se diluye esta mezcla proteína gelatinosa en medio Neurobasal para producir una dilución 1:20 (es decir, diluir 500 l de la mezcla de proteína gelatinosa en 10 ml de Neurobasal). </li><li> Divide diluye mezcla de proteína gelatinosa en alícuotas de 1 ml y almacenar inmediatamente cualquier alícuotas adicionales a -20 ° C. </li><li> Aplicar 250 l por rejilla EM, por plato, como se describe en la Sección 1.4. </li></ol></li></ol></li><li> Cubrir la placa de Petri con su parte superior e incubar (ya sea con PLL para las muestras de hipocampo, OR con la mezcla de proteína gelatinosa para los especímenes DRG) durante 1 hora a temperatura ambiente en la campana de cultivo de tejido. </li><li> Aspievaluar todas PLL (para los especímenes de hipocampo) o la mezcla de proteína gelatinosa (para los especímenes DRG) de los platos. Para ello, utilice el sistema de vacío en la campana de cultivo de tejidos. Utilice una punta de pipeta estéril conectada al tubo de vacío. Evite el contacto directo con la red de EM. </li><li> Usar una pipeta de desplazamiento de aire ajustable para aplicar cuidadosamente 250 l de PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato) a la red de EM en el área de vidrio central de cada placa de Petri, de tal manera que la rejilla EM está totalmente cubierto por PBS. Luego, aspirar el PBS de cada plato. Repita 3 veces. </li><li> Permitir a los platos con redes de EM se sequen bajo la campana de cultivo de tejido durante 15 min. Asegúrese de que estén completamente secos marcando bajo el microscopio de luz en la sala de cultivo de tejidos. Asegúrese de que no haya burbujas de la humedad en la cuadrícula. Si es así, cuidadosamente aspirado al lado de la rejilla EM para eliminar esta humedad adicional. La rejilla recubierta debe utilizarse inmediatamente para el recubrimiento de las neuronas. </li></ol> 2. Preparación y PlCIONES neuronas primarias en EM Grids <ol><li> Para la placa neuronas primarias, primera disección, trypsinize (utilizando tripsina al 2,5%) y se tritura para disociar los hipocampos (o dorsal ganglio de la raíz de 18 días de edad embriones de rata) en células individuales, como se ha descrito anteriormente 19. <ol><li> Se tritura es un término común usado por neurobiólogos para describir disociación grupos de células en células individuales, en particular mediante el uso de una pipeta de vidrio con una punta pulida al fuego. El resultado se consigue mediante la cuidadosa y lentamente dibujo y la liberación de las células, arriba y abajo, varias veces (~ 30) a través de la pipeta. </li></ol></li><li> Siga los procedimientos descritos anteriormente para la disección DRG y el aislamiento celular 24, tomando nota de usar 0,25% de tripsina (en HBSS) para aislar las neuronas DRG de rata, en lugar de utilizar las enzimas sugeridos (papaína, colagenasa / dispasa) que son más adecuados para el ratón DRG neuronas. </li><li> Calcular el número de neuronas aisladas (es decir, utilizando un hemocitómetro)y usar este valor para calcular el volumen apropiado de células para aplicar a cada plato para conseguir una concentración de 50.000 células / ml por placa. El volumen máximo a aplicar es de 250 l. Tenga en cuenta que esto sólo llena el área central de cristal, no todo el plato. </li><li> Incubar los platos durante 30 minutos en una incubadora de CO 2 a 37 ° C. Permiten a las células se recuperen y se adhieren. </li><li> Poco a poco agregue 1.5 ml de medio calentado a cada plato, con cuidado de no molestar a la red EM. El tipo de medios de comunicación depende del tipo de célula (hipocampo o DRG). <ol><li> Prepare el soporte de impresión adecuado, ya sea para las neuronas del hipocampo dorsal 19 o neuronas del ganglio de la raíz 24, lo que es para ser calentado en un baño de agua a 37 ° C antes de su uso. Incubar los platos durante la noche en la incubadora de CO 2. </li><li> Para las neuronas del hipocampo, cambiar los medios de comunicación al día siguiente. Cambiar medio de los medios de comunicación cada dos días durante 14 días en adelante. Calentar los medios de comunicación en un 37 ° C baño de agua antes de su uso. </li&gt; <li> Para las neuronas DRG, el día después de la disección / placas, preparar un material fresco de los medios de comunicación con un agente anti-mitótico (uridina y 5&#39;-fluoro-2&#39;-desoxiuridina) preparar una solución madre 10 mM de cada uno, por separado, el uso de una final concentración de 10 mM para cada uno. Retire medio de los medios de comunicación DRG (875 l) y añadir 875 l de medio fresco con el agente anti-mitótico. <ol><li> Para DRG neuronas, cada dos días durante la primera semana, se alternan entre el cambio de los medios de comunicación anti-mitótico y medios DRG estándar. Para la segunda semana, cambiar el medio de GRD estándar cada dos días. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vitrificar neuronas en EM Grids <ol><li> Prepare el equipo y todos los materiales para la congelación y el almacenamiento de las redes de EM oro a temperatura criogénica: un dispositivo de vitrificación con una cámara de humedad 17, pinzas especializadas de punta fina para la máquina de la vitrificación, pinzas de punto larga y plana, Dewar (s) de nitrógeno líquido (LN 2), Ccontenedor oolant, caja de almacenamiento de red EM, papel de filtro libre de calcio. </li><li> Inicie el dispositivo de vitrificación. Ajuste la humedad al 100% y la temperatura a 32 ° C. En la sección &quot;Consola&quot;, ajuste el tiempo de transferencia de cero segundos. Esto permite manual de secante a través de la ventana lateral de cámara de humedad de la máquina de la vitrificación. </li><li> Maneje el papel de filtro libre de calcio con guantes, capas ellos de tal manera que tres documentos se apilan. Corte la pila en 0,5 cm de ancho tiras que son ~ 2 cm de largo. Doblar en un ángulo de 90 ° de tal manera que un lado de el papel tiene una 0,5 cm x 0,5 cm de la cara (Figura 2). Con unas pinzas, retire el papel central y colocarlo en otro papel de filtro libre de calcio hasta su uso. </li><li> Ponga el botón de almacenamiento de red en el soporte de botón dentro de la cámara de la vitrificación. Llenar la cámara interior del envase del líquido refrigerante con nitrógeno líquido y esperar hasta la evaporación completa. Llenar la cámara exterior de the envase del líquido refrigerante con nitrógeno líquido hasta que se alcanza una temperatura estable para proceder al siguiente paso. Llenar la cámara interior con alta pureza etano gaseoso que se condensa a un estado líquido dentro de la cámara de enfriado. </li><li> Mueva el plato (s) de la incubadora a un gran plato de 100 mm de poliestireno para el transporte a la sala de vitrificación, si no dentro de la vecindad inmediata. Utilice las pinzas especializadas de vitrificación para escoger con cuidado la rejilla EM de la antena. Nota que lado las neuronas están creciendo en la parrilla de EM, la posición importará para el siguiente paso. Utilice el bloqueo deslizante negro de las pinzas para bloquear de forma segura las pinzas en la parrilla de EM. </li><li> Inserte las pinzas en la máquina de vitrificación de tal manera que el lado de la red de EM en el que las neuronas se adhieren caras a la izquierda, lejos del agujero de apertura lateral de la máquina de la vitrificación. Repliegue las pinzas especializadas en la máquina de vitrificación. </li><li> Coloque el envase del líquido refrigerante en el soporte apropiadode la máquina de la vitrificación. Debe estar lleno de LN adecuada 2 y etano líquido. Usando el comando de pantalla apropiado de la máquina de la vitrificación, elevar la cámara de refrigerante hacia arriba hasta que se inundó con la parte inferior de la cámara de humedad. </li><li> Con las pinzas de punto plana, sujete un borde del papel de filtro de tal manera que el lado más corto (los 0,5 cm x 0,5 cm de la cara) es perpendicular a las pinzas. Esta cara se encuentran en contacto directo con la red de EM para Blot (Figura 2B). Introduzca con cuidado el papel de filtro en el orificio lateral de la cámara de humedad de la máquina de la vitrificación (Figura 2A). De forma estable sostener el papel contra la rejilla EM (el lado alejado de la muestra) durante 10 s. Deseche el papel después e inmediatamente sumergirse a congelar la muestra en el etano líquido mediante la automatización de la máquina de la vitrificación. </li><li> Transferir con cuidado la rejilla EM-hidratado congelado a una de las ranuras en uno de losBotones de almacenamiento de red. Repita el proceso para redes de EM adicionales en los platos. Los botones de EM de almacenamiento de red utilizados en estos experimentos pueden almacenar múltiples redes de EM-congelados hidratado. </li></ol> 4. La colección de imágenes, producción y anotación <ol><li> Proceda a recoger micrografías electrónicas en 2-D y / o 3-D serie de inclinación 5 de las neuritas utilizando un microscopio crioelectrónica bajo una condición de baja dosis. Las imágenes 2-D estaban destinadas a evaluar la calidad de la red en términos de espesor de hielo y las áreas posibles para ser útil para 3-D serie de inclinación. <ol><li> En este caso, todas las imágenes fueron recolectados a través de una cámara 4k x 4k CCD conectada a un microscopio de 200 kV de electrones equipado con un soporte para la transferencia de nitrógeno criogénico líquido de inclinación única, en 20k microscopio óptico a un blanco underfocus de 7 micras y muestreo de 4,4 Å / píxel. </li><li> Para obtener una tomografía 3D de la muestra, tomar una serie de imágenes de proyección, mientras que de forma incremental al inclinar la muestraOng un eje del microscopio electrónico de transmisión (TEM). Teniendo en cuenta los ángulos de inclinación y otros parámetros experimentales, hay varios programas diferentes disponibles para recopilar automáticamente la serie de inclinación 5. La serie de inclinación 3-D que se muestra aquí se recogieron en el mismo microscopio utilizando el software semi-automáticos de adquisición serie de inclinación 26 en un rango de -60 ° a 60 ° en incrementos de 5 ° con una dosis acumulada de ~ 60 E / A 2. </li></ol></li><li> Reconstruir la serie de la inclinación de las neuritas utilizando el software de procesamiento de imágenes 21 como se describió anteriormente para otras muestras de 5,29. </li><li> Color-anotar las características 3-D de las neuritas por primera segmentación de la tomografía y la creación de un modelo de superficie usando un software de procesamiento de imagen 3-D como se describe anteriormente 5. </li></ol>

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<li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li>
<li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li>
<li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li>
<li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+LR+%22Fundamental+neuroscience%22">Fundamental neuroscience</a>. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).</li>
<li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li>
<li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+expression+of+glycine+and+GABA%28A%29+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se demuestra que las neuronas embrionarias de rata (ganglio de la raíz dorsal y del hipocampo) que se puede cultivar en el microscopio electrónico de oro (EM) rejillas y congelado en hielo vítreo lo suficientemente delgada como para sus neuritas para ser fotografiados utilizando 2-D crio-EM y 3-D de la crio- ET. Mientras neuritas hipocampo previamente han sido fotografiadas usando crio-ET 8,10,18,23, un protocolo lo suficientemente detallada para la replicación exitosa utilizando dispositivos disponibles en e...

Las neuronas establecen el complejo esencial de circuitos para la función de los sistemas nerviosos central y periférico mediante la elaboración de dendritas para recibir información y axones, a menudo bastante largo, para comunicarse con las neuronas aguas abajo. El crecimiento de neuritas juega un papel fundamental durante el desarrollo embrionario y la diferenciación y el mantenimiento de las neuritas neuronal apoya críticamente la función del sistema nervioso. Procesos neuríticas también disponen de forma crítica en la lesión y la regeneración neuronal, así como trastornos del sistema nervioso. El estudio de la arquitectura neuronal es fundamental para comprender tanto el cerebro normal y enfermo. Afortunadamente, existen sistemas de cultivo de células neuronales fisiológicamente relevantes que pueden recapitular las estructuras celulares complejas y heterogéneas. Basado en la elucidación de las plataformas experimentales sólidas, estrategias de visualización eficaces que permitan a los análisis cualitativos y cuantitativos de morfología neuronal se necesitan. Especialmente útil seríaser una metodología detallada que proporciona una plataforma consistente para la visualización de las neuritas, tanto axones y dendritas en la escala nanométrica. Microscopía electrónica tradicional requiere el uso de disolvente orgánico durante la deshidratación y la incrustación de resina, que puede inducir distorsiones en los especímenes de su verdadero estado. Hasta la fecha, la mayoría de las caracterizaciones estructurales a escala nanométrica se basan en células más grandes o los tejidos que se someten a este tipo de productos químicos agresivos - limitando así la interpretación de los hallazgos 4,9,25. Por otra parte, para la penetración del haz de electrones, se requiere de seccionamiento para los organismos o protuberancias celulares que presentan un espesor superior a 1 m 12. Finalmente, seccionada o blanqueado resultados de tejido en la colección de conjuntos de datos sobre el tramo específico discretas, lo que hace engorrosa la definición de la función alargada de neuritas. Incluso para la crio-EM, en la que el corte una muestra congelada hidratado es posible, el método introduce Artif compresiónHechos 1. En los últimos años, los investigadores han aprendido cómo hacer crecer las neuronas del hipocampo directamente en redes de EM y el flash de congelación en etano líquido para visualizar posteriormente neuritas utilizando crio-ET 8,10,18,23. Sin embargo, tales estudios o bien utilizar un producto a medida 10,23, o los detalles de la falta en el paso de secante para la generación de hielo vítreo lo suficientemente delgada como para la visualización de rutina 8,18. Por ejemplo, un estudio recomienda el uso de 30 a 40 segundos para secar la rejilla EM 10, sin embargo, este valor no está optimizado para su uso general, pero es específica para ese dispositivo de inmersión congelación a medida. El uso de un producto a medida en lugar de un comercialmente disponible un 17 para el mantenimiento de la humedad antes de sumergirse de congelación de la muestra podría representar un obstáculo para la reproducibilidad generalizada. Si bien estos estudios han sido pioneras en la visualización de neuritas por crio-ET, hemos dado un paso más para explorar la apaplicabilidad de la crio-ET a una variedad de especímenes neuronales (neuronas del hipocampo y del ganglio de la raíz dorsal). Además, se discuten tanto los resultados óptimos y subóptimos, así como los posibles artefactos que uno podría encontrar utilizando la crio-ET para tales especímenes. Definición de una técnica detallada para la preservación y la visualización de las neuritas enteros a escala nanométrica en un estado casi nativo aumentaría la capacidad de más investigadores para llevar a cabo estudios ultraestructurales. Para ello, se describe un protocolo eficaz y detallada utilizando equipos disponibles comercialmente para preparar, neuronas no marcadas no fijadas para visualizar las neuritas. Este es un importante primer paso hacia la que detalla la ultraestructura de neuritas saludables y para sentar las bases para la comprensión de cuáles son las diferencias estructurales presentes en modelos de enfermedades del sistema nervioso. Desde crio-ET puede resolver, las características de neuritas sin teñir no fijadas en 3-D en la escala nanométrica, el método hará posible que nunca seatanto para definir la arquitectura neurítico 12.

<table><tbody><tr><td>Dumont #7 Pinzas</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>72803-01</td><td>Para el manejo de rejillas EM</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>Para muestras en crecimiento</td></tr><tr><td>Rejillas de microscopía electrónica</td><td>Quantifoil</td><td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td><td>Para muestras en crecimiento</td></tr><tr><td>Papel de filtro sin calcio</td><td>Whatman</td><td>1541-055</td><td>Para muestras secantes</td></tr><tr><td>Pinzas largas de punta plana grande</td><td>Excelta Corporation</td><td>E003-000590, 25-SA</td><td>Para muestras secantes&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo de vitrificación y pinzas</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark III</td><td>Para congelar</td></tr><tr><td>muestras Cajas de almacenamiento de minigrid</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>160-40</td><td>Para el almacenamiento de rejillas EM</td></tr><tr><td>Soporte de transferencia criogénica</td><td>Gatan</td><td>626 Soporte de transferencia criogénica de nitrógeno líquido de inclinación simple</td><td>Para muestras</td></tr><tr><td>de imagen Software de adquisición de series de inclinación semiautomatizada</td><td>SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td> <td>Para muestras de imagen</td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes</td><td>IMOD eTomo</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td> <td>Para el procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión para cryoEM</td><td>JEOL, Tokio</td><td>Microscopio electrónico LaB6 de 200 k JEM2100 V</td><td>Para la obtención de imágenes de muestras</td></tr><tr><td>Cámara CCD 4k x 4k</td><td>Gatan</td><td>N/A</td><td>Para la adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>de muestras Software de anotación 3D</td><td>Visage Imaging GmbH</td><td>Amira/Avizo</td><td>Para el procesamiento de datos 3D</td></tr><tr><td>Software para la unión digital de imágenes 2D</td><td>Adobe</td><td>Adobe Photoshop</td><td>Para el procesamiento de datos 2D</td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>Invitrogen</td> de alta glucosa <td>11965-118</td><td>Para el cultivo del hipocampo</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-0252</td><td>Para el cultivo del hipocampo</td></tr><tr><td>Tetraborato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-9876</td><td>Para el cultivo del hipocampo</td></tr><tr><td>Poly-L-lisina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636-500MG</td><td>Para cultivo de hipocampo</td></tr><tr><td>Sistema</td><td>de filtrado Corning</td><td>430758</td><td>Para cultivo de hipocampo</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Para cultivo de DRG</td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Para cultivo de DRG</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Para cultivo de DRG</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Para cultivo DRG</td></tr><tr><td>Rata recombinante b-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>556-NG</td><td>Para cultivo DRG</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003-5G</td><td>Para cultivo DRG</td></tr><tr><td>5'-Fluoro-2'-desoxiuridina</td><td></td><td>Sigma F0503-100MG</td><td>Para cultivo DRG</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Para cultivo DRG</td></tr></tbody></table>

preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un estado frozen-hidratado con cryo-tomografía electrónica

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Las neuritas, ambos dendritas y axones, son procesos celulares neuronales que permiten la conducción de impulsos eléctricos entre las neuronas. Definición de la estructura de neuritas es fundamental para la comprensión de cómo estos procesos se mueven materiales y señales que permiten la comunicación sináptica. La microscopía electrónica (EM) se ha utilizado tradicionalmente para evaluar las características ultraestructurales dentro de neuritas, sin embargo, la exposición a disolventes orgánicos durante la deshidratación y la incrustación de resina puede distorsionar las estructuras. Una meta insatisfecha importante es la formulación de procedimientos que permitan evaluaciones estructurales no afectados por este tipo de artefactos. Aquí, hemos establecido un protocolo detallado y reproducible para el cultivo y el flash de congelación neuritas enteras de diferentes neuronas primarias sobre rejillas de microscopía electrónica, seguida de su examen con la crio-tomografía electrónica (crio-ET). Esta técnica permite la visualización 3-D de las neuritas, hidratados congelados a una resolución de nanómetros, facilitando ASSEssment de sus diferencias morfológicas. Nuestro protocolo se obtiene una visión sin precedentes de la raíz dorsal (GRD) ganglio neuritas, y una visualización de neuritas hipocampo en su estado casi nativo. Como tales, estos métodos crean una base para futuros estudios sobre neuritas de las neuronas normales y los afectados por trastornos neurológicos.

Antes de la congelación y de imagen a través de la crio-ET, imágenes de microscopio de luz se deben tomar de la red de EM en el que las neuronas están creciendo. Las neuritas deben ser claramente visibles y sin solapamiento significativo entre sí. Un cuadro de color en la Figura 3A representa un área que está ampliada-en para mostrar un aumento mayor en la Figura 3B, en la que las neuritas se extienden a través de la celosía de la red. Cada cuadrícula de cuadrados se compone de una pelí...

Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar neuronas primarias de rata de manera que sus neuronas sean adecuadas para la visualización mediante microscopía electrónica de congelación. Esto se logra primero preparando placas con rejillas de microscopía electrónica para sembrar las neuronas primarias. El segundo paso consiste en preparar y sembrar las neuronas primarias sobre las rejillas de microscopía electrónica.A continuación, se realiza la vitrificación de neuronas sobre rejillas de microscopía electrónica. El paso final consiste en obtener imágenes mediante microscopía electrónica criogénica, seguido de procesamiento posterior y anotación. En última instancia, se utiliza la microscopía electrónica criogénica y la tomografía para mostrar la ultraestructura de las neuritas en un estado congelado e hidratado.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que puede utilizarse para la visualización tridimensional de neuritas hidratadas congeladas con resolución nanométrica, sin necesidad de utilizar fijadores químicos. Por lo tanto, facilita la evaluación de características morfológicas más cercanas al estado nativo. Comience este procedimiento examinando la integridad del carbono perforado sobre las rejillas de microscopía electrónica de oro.Utilizando un microscopio óptico con un aumento de al menos 25 veces, asegúrese de que los orificios de carbono estén intactos en más del 98%. Para sembrar neuronas primarias, use un mechero Bunsen para esterilizar por flama las rejillas de microscopía electrónica y, al mismo tiempo, volverlas hidrófilas. Transfiera inmediatamente la rejilla con el lado de carbono hacia arriba al centro del vidrio.Placa inferior, coloque una rejilla de ME por placa y utilice únicamente placas con fondo de vidrio previamente esterilizadas. Luego, utilice un microscopio óptico para verificar la integridad de la rejilla, manteniendo aún la rejilla de ME dentro de la placa con fondo de vidrio en una cabina de cultivo celular; aplique 250 microlitros de la sustancia de recubrimiento adecuada sobre la zona central de vidrio de la placa de Petri. Lentamente y con cuidado, asegúrese de que la sustancia de recubrimiento adecuada cubra completamente toda la rejilla de ME.Posteriormente, cubra la placa de Petri con su tapa e incube las muestras durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, aspire con una punta de pipeta estéril conectada al tubo de vacío en la cabina toda la mezcla de poliol lisina de las placas. Evite el contacto directo con la rejilla de ME.Posteriormente, utilice una pipeta de desplazamiento de aire ajustable para aplicar cuidadosamente 250 microlitros de PBS estéril y cubrir completamente la rejilla de ME en la zona central de vidrio de cada placa de Petri. Luego aspire el PBS de cada placa. Repita el procedimiento tres veces más después de eso.Deje secar las placas con las rejillas de ME en la cabina de cultivo tisular durante 15 minutos. Compruebe al microscopio óptico. Asegúrese de que estén completamente secas y de que no haya burbujas de humedad en la rejilla.De lo contrario, aspire cuidadosamente junto a la rejilla de ME para eliminar esta humedad adicional; la rejilla recubierta debe usarse inmediatamente para sembrar las neuronas. En este procedimiento, calcule el volumen apropiado de células para cada placa con el fin de obtener una concentración de 50.000 células por mililitro por placa. La cantidad máxima que debe aplicarse es de 250 microlitros, para llenar únicamente el área central de vidrio, no toda la placa.A continuación, incubar las placas durante 30 minutos en una incubadora de CO₂ a 37 grados Celsius para permitir que las células se recuperen y se adhieran; después de 30 minutos, añadir lentamente 1,5 mililitros del medio celular calentado a cada placa y evitar tocar la rejilla de EM para neuronas del hipocampo. Cambiar el medio al día siguiente y luego cambiar la mitad del medio cada dos días durante 14 días. En este procedimiento, preparar el equipo y todos los materiales para congelar y almacenar las rejillas de oro de EM a temperatura criogénica, lo que incluye un dispositivo de vitrificación con una cámara de humedad, papel de filtro sin calcio, una pinza plana de punta larga, una pinza especializada de punta fina para la máquina de vitrificación, un recipiente de nitrógeno líquido, un contenedor de refrigerante y la caja de almacenamiento para rejillas de EM.A continuación, encienda el dispositivo de vitrificación. Establezca la humedad en 100 % y la temperatura en 32 grados Celsius. En la sección de opciones, configure el tiempo de bloqueo en cero segundos.Esto permite el secado manual a través de la ventana lateral de la cámara de humedad. Luego, apile tres papeles de filtro libres de calcio. Corte la pila en tiras de 0,5 centímetros de ancho y aproximadamente dos centímetros de largo; después, dóblelas en un ángulo de 90 grados de manera que una sección del papel quede de 0,5 centímetros por 0,5 centímetros.Esta sección se utilizará para el traslado de la muestra. Retire el papel del medio y colóquelo sobre otro papel filtro libre de calcio hasta su uso. A continuación, utilice la pinza especializada para vitrificación para tomar cuidadosamente la rejilla de microscopía electrónica del recipiente.Observe el lado de la rejilla de ME en el que están creciendo las neuronas, ya que la posición será importante para el siguiente paso. Luego, utilice la palanca deslizante negra de las pinzas para fijarlas firmemente a la rejilla de ME. A continuación, introduzca las pinzas en la máquina de vitrificación de manera que el lado de la rejilla de ME al que están adheridas las neuronas quede orientado hacia la izquierda y alejado del orificio circular lateral de la máquina de vitrificación.Luego, retraiga las pinzas que sostienen la rejilla de ME hacia la máquina de vitrificación. Posteriormente, coloque el recipiente de refrigerante lleno con LN2 adecuado y etano líquido en el soporte correspondiente de la máquina de vitrificación utilizando el comando de pantalla adecuado de la máquina de vitrificación. Eleve la cámara de refrigerante hacia arriba hasta que quede alineada con la parte inferior de la cámara de humedad utilizando las pinzas de punta plana.Sujete un borde del papel de filtro de manera que el lado más corto sea perpendicular a las pinzas. Esta cara entrará en contacto directo con la rejilla de microscopía electrónica para el secado por absorción. A continuación, inserte cuidadosamente el papel de filtro en el orificio lateral de la cámara de humedad. Sostenga el papel contra la rejilla de microscopía electrónica durante 10 segundos, deseche el papel e inmerja inmediatamente.Congele la muestra en etano líquido utilizando la automatización de la máquina de vitrificación. Posteriormente, transfiera cuidadosamente la rejilla de microscopía electrónica (EM) congelada e hidratada a una de las ranuras del almacenamiento de rejillas. Esta es una imagen de microscopía óptica de la zona central de una rejilla de EM a 10 aumentos, en la cual han estado creciendo neuronas primarias de rata durante dos semanas.Aquí se muestra la vista ampliada del cuadro de color aguamarina donde se observan las neuronas y sus proyecciones neuríticas. Esta es una micrografía electrónica de un neurita que se proyecta hacia afuera desde el cuerpo neuronal a un aumento de 4K. El cuadro azul se observa de cerca aquí, donde las características internas de los neuritas son claramente visibles a un aumento de 20 K.Este video muestra una pila reconstruida en 3D de micrografías de una neurita procedente de un cultivo primario de neuronas del hipocampo de rata. Se obtuvo mediante tomografía y seguido de la correspondiente anotación tridimensional a color. Aquí hay otro video que muestra una pila reconstruida en 3D de imágenes de un axón del ganglio raquídeo dorsal de rata, recopiladas mediante tomografía crioelectrónica, seguida de la correspondiente anotación tridimensional a color, y se muestra aquí un mosaico de cuatro imágenes de criomicroscopía electrónica en 2D de un axón separado del ganglio raquídeo dorsal de rata, tomadas a un aumento de 20 K.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar neuronas primarias sobre rejillas de microscopía electrónica de forma adecuada para visualizar sus neuronas en un estado congelado hidratado mediante tomografía electrónica criogénica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Schönherr, S., et. al. Inmunomarcaje combinado optogenético y réplica de fractura por congelación para examinar la disposición específica de entrada de los receptores de glutamato en la amígdala de ratón. J. vis. exp. (2016)Este vídeo muestra el inmunomarcaje de réplicas fracturadas por congelación de tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica. Las réplicas fracturadas y recubiertas se digieren para exponer los receptores. Se añaden anticuerpos primarios y secundarios...

Inmunomarcaje de proteínas de membrana neuronal en un espécimen de tejido cerebral de ratón fracturado por congelación

Se presenta un protocolo por el método de tinción de Golgi-Cox en secciones de cerebro de espesor, con el fin de visualizar las neuronas con árboles dendríticos largas contenidos dentro de muestras de tejido individuales. También se presentan dos variantes de este protocolo que implica cresilo contratinción violeta, y la congelación de los cerebros no transformadas para almacenamiento a largo plazo.

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Aquí, proporcionamos una, de bajo costo fácil, y eficiente en el tiempo de protocolo para fijar químicamente el tejido cerebral de los primates con fijador acroleína, lo que permite la conservación a largo plazo que es compatible con inmunohistoquímica pre-inclusión para microscopía electrónica de transmisión.

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Aquí, se presenta un protocolo que describe los pasos de preparación de la muestra y recolección de datos requeridos en la tomografía de rayos X criobla (SXT) para obtener imágenes de la ultraestructura de células crioconservadas enteras a una resolución de medio paso de 25 nm.

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Presentamos un protocolo para la preparación de láminas de especímenes biológicos congelados por inmersión mediante micromecanizado de haz de iones crioenfocado para estudios estructurales de alta resolución de macromoléculas in situ con tomografía crio-electrónica. El protocolo presentado proporciona pautas para la preparación de láminas de alta calidad con alta reproducibilidad para la caracterización estructural de macromoléculas dentro de las Saccharomyces cerevisiae.

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El objetivo de este protocolo es dirigir la adhesión y el crecimiento celular a áreas específicas de rejillas para criomicroscopía electrónica. Esto se logra mediante la aplicación de una capa antiincrustante que se ablaciona en patrones especificados por el usuario seguido de la deposición de proteínas de matriz extracelular en las áreas modeladas antes de la siembra celular.

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

La tomografía crio-STEM proporciona un medio para visualizar orgánulos de células intactas sin incrustación, seccionamiento u otras preparaciones invasivas. La resolución 3D obtenida se encuentra actualmente en el rango de unos pocos nanómetros, con un campo de visión de varios micrómetros y un espesor accesible del orden de 1 μm.

Visualización de orgánulos in situ mediante tomografía crio-STEM

Este protocolo de video ilustra cómo realizar una tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido de muestras virológicas. Para obtener resultados óptimos, las muestras se preparan mediante congelación a alta presión y posterior sustitución por congelación.

Tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido en virología: imágenes 3D de muestras congeladas a alta presión y sustituidas por congelación

Este protocolo estandariza la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para tejidos gruesos integrando la congelación a alta presión (HPF) con el método waffle, el levantamiento por haz de iones de foco criogénico (crio-FIB) y la adquisición paralela simétrica en dosis, produciendo láminas uniformemente finas y muestras vitrificadas para análisis in situ reproducibles en el hipocampo del ratón.

Flujo de trabajo de criotomografía electrónica para tejidos gruesos demostrado en hipocampo de ratón

Aprende a preparar neuronas primarias de rata para microscopía crioelectrónica mediante vitrificación en rejillas de EM. Este protocolo permite visualizar la ultraestructura de neuritas en estado hidratado congelado sin fijadores químicos.

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica (Video) | JoVE Journal

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

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