Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.

El objetivo general de este procedimiento es hacer crecer las neuronas primarias de rata de tal manera que sus neuronas sean adecuadas para la visualización mediante criomicroscopía electrónica. Esto se logra preparando primero platos con rejillas EM para enchapar las neuronas primarias. El segundo paso es preparar y colocar las neuronas primarias en rejillas EM.

A continuación, se realiza la vitrificación de las neuronas en rejillas EM. El paso final es recolectar imágenes mediante criomicroscopía electrónica, seguido de posprocesamiento y anotación. En última instancia, la criomicroscopía electrónica y la tomografía se utilizan para mostrar la ultraestructura de las neuritas en un estado hidratado congelado.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que se puede utilizar para la visualización en 3D de neuritas hidratadas congeladas a una resolución nanométrica sin el uso de fijadores químicos. Por lo tanto, facilita la evaluación de características morfológicas más cercanas al estado original. Comience este procedimiento examinando la integridad del carbono sagrado en las rejillas EM de oro.

Usando un microscopio óptico con un aumento de al menos 25 veces, asegúrese de que los orificios de carbono estén intactos en más del 98%. Para el recubrimiento de las neuronas primarias, use un quemador Bunsen para esterilizar con llama las rejillas EM y, al mismo tiempo, hacerlas hidrófilas. Transfiera inmediatamente la rejilla con el lado de carbono hacia el centro del vidrio.

Plato inferior, coloque una rejilla EM por plato y use solo platos con fondo de vidrio preesterilizados. A continuación, utilice un microscopio óptico para comprobar la integridad de la rejilla mientras se mantiene la rejilla EM dentro del plato con fondo de vidrio en una campana de cultivo de tejidos, aplique 250 microlitros de la sustancia de recubrimiento adecuada en el área central de vidrio de la placa de Petri. Lenta y cuidadosamente, asegúrese de que la sustancia de recubrimiento adecuada cubra toda la rejilla E EM.

Después, cubra la placa de Petri con su tapa e incube los especímenes durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, aspire toda la mezcla de poliol lisina de los platos con una punta de pipeta estéril conectada al tubo de vacío de la campana. Evite el contacto directo con la rejilla E EM.

A continuación, utilice una pipeta de desplazamiento de aire ajustable para aplicar cuidadosamente 250 microlitros de PBS estéril para cubrir completamente la rejilla EM en el área central del vidrio de cada placa de Petri. A continuación, aspire el PBS de cada plato. Repita el procedimiento tres veces después de eso.

Deje que los platos con rejillas EM se sequen en la campana de cultivo de tejidos durante 15 minutos. Comprobación bajo el microscopio óptico. Asegúrate de que estén completamente secos y de que no haya burbujas de humedad en la rejilla.

De lo contrario, aspire cuidadosamente junto a la rejilla EM para eliminar esta humedad adicional, la rejilla recubierta debe usarse inmediatamente para colocar las neuronas. En este procedimiento, calcule el volumen apropiado de células para cada plato con el fin de lograr una concentración de 50.000 células por mililitro por plato. La cantidad máxima de aplicación debe ser de 250 microlitros para llenar solo el área central del vaso, no todo el plato.

A continuación, incube las placas durante 30 minutos en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados para permitir que las células se recuperen y se adhieran, después de 30 minutos agregue lentamente 1,5 mililitros de los medios celulares calentados a cada placa y evite tocar la rejilla EM para las neuronas del hipocampo. Cambie el medio al día siguiente y luego cambie la mitad del medio cada dos días durante 14 días. En este procedimiento, prepare el equipo y todos los materiales para congelar y almacenar las rejillas EM de oro a temperatura criogénica, que incluyen un dispositivo de vitrificación con una cámara de humedad, papel de filtro sin calcio, un par de pinzas largas de punta plana, un par de pinzas especializadas de punta fina para la máquina de vitrificación, un hacedor de nitrógeno líquido, un contenedor de refrigerante y la caja de almacenamiento de rejilla EM.

A continuación, encienda el dispositivo de vitrificación. Ajuste la humedad al 100% y la temperatura a 32 grados centígrados. En la sección de opciones, establezca el tiempo de bloqueo en cero segundos.

Esto permite el secado manual a través de la ventana lateral de la cámara de humedad. A continuación, apila tres papeles de filtro sin calcio. Corta la pila en tiras de 0,5 centímetros de ancho que tengan unos dos centímetros de largo después de eso, dóblalas en un ángulo de 90 grados de modo que una sección del papel tenga 0,5 centímetros por 0,5 centímetros.

Esta sección se utilizará para secar la muestra. Retire el papel del medio y colóquelo sobre otro papel de filtro sin calcio hasta su uso. A continuación, utilice la vitrificación especializada con pinzas para recoger cuidadosamente la rejilla EM del plato.

Observe el lado de la rejilla EM en el que crecen las neuronas, ya que la posición será importante para el siguiente paso. A continuación, utilice el bloqueo deslizante negro de las pinzas para bloquear de forma segura las pinzas en la rejilla EM. Ahora inserte las pinzas en la máquina de vitrificación de manera que el lado de la rejilla EM en el que se adhieren las neuronas mire hacia la izquierda y lejos del orificio de apertura circular en el lado de la máquina de vitrificación.

A continuación, retraiga las pinzas que sujetan la rejilla EM en la máquina de vitrificación. A continuación, coloque el depósito de refrigerante lleno de LN 2 adecuado y etano líquido en el soporte adecuado de la máquina de vitrificación utilizando el comando de pantalla adecuado de la máquina de vitrificación. Levante la cámara de refrigerante hacia arriba hasta que esté enjuagada con la parte inferior de la cámara de humedad con las pinzas de punta plana.

Sujete un borde del papel de filtro de manera que el lado más corto quede perpendicular a las pinzas. Esta cara entrará en contacto directo con la rejilla EM para el secado. Ahora, inserte con cuidado el papel de filtro en el orificio lateral de la cámara de humedad de manera estable Sostenga el papel contra la rejilla EM durante 10 segundos, deseche el papel e inmersión inmediata.

Congele la muestra en el etano líquido utilizando la automatización de la máquina de vitrificación. Luego, transfiera con cuidado la rejilla EM hidratada congelada a una de las ranuras del almacenamiento de la red. Esta es una imagen de microscopio óptico del área central de una rejilla EM con un aumento de 10 veces en la que las neuronas primarias de rata han estado creciendo durante dos semanas.

Aquí está la vista ampliada de la caja de agua donde se observan las neuronas y sus proyecciones de neuritas. Se trata de una micrografía electrónica de una neurita que se proyecta hacia el exterior desde el cuerpo de la neurona con un aumento de 4K. La caja azul se ve de cerca aquí, donde las características internas de las neuritas son claramente visibles con un aumento de 20 K.

Este video muestra una pila de micrografías reconstruidas en 3D de una neurita del cultivo primario de neuronas de hipocampo de rata. Se obtienen imágenes mediante tomografía y se sigue con la anotación de color 3D correspondiente. Aquí hay otro video que muestra una pila de imágenes reconstruidas en 3D de un axón del ganglio de la raíz dorsal de una rata recolectadas mediante tomografía crioelectrónica seguida de la anotación de color 3D correspondiente y aquí se muestra el montaje de cuatro imágenes crio-EM en 2D de un axón de ganglio de raíz dorsal de rata separado tomadas con un aumento de 20 K.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica de tal manera que sea adecuada para visualizar sus neuronas en un estado hidratado congelado mediante criotomografía electrónica.