Name: Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende a modelar la muerte neuronal y la degeneración en neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón. Este método permite estudiar mecanismos de lesión como excitotoxicidad, estrés oxidativo y daño del ADN en cultivos in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo es apoyado por Ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá y los institutos canadienses de investigación en salud otorga a A.J.-A.

este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han describen previamente 18 , 24 , 25 , 26 , 27. este protocolo es aprobado por el Comité de cuidado del Animal en la Universidad McGill.
 1. preparación experimental Nota: las siguientes soluciones stock pueden ser preparadas y mantenidas hasta su utilización.
<ol><li>Disección solución <ol><li>disolver 3,62 g de cloruro de sodio (NaCl), 0.2 g de cloruro de potasio (KCl), 0,069 g de fosfato de sodio (NaH 2 PO 4 &#8729; H 2 O) y 1,306 g de D-(+)-glucosa en 500 mL de destilada de H 2 O. Luego, añadir 12,5 mL de tampón HEPES, 450 μl de solución de rojo de fenol y 20 mL de la fracción V de la BSA a la solución. Ajustar a pH 7,4 con 1 N de hidróxido de sodio (NaOH).</li>
		<li>Esterilizar con un 0,22 μm filtro y almacenar a 4 ° C. Esta solución seguirá siendo estable por hasta una semana a 10 días.</li>
	</ol></li> <li>Tripsina <ol><li>preparar una solución stock a una concentración de 25 g/L de tripsina en cloruro de sodio 0.9%. La solución a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Inhibidor de la tripsina <ol><li>Prepare un caldo con una concentración de 10 mg/mL disolviendo 1 g de inhibidor de la tripsina de pollo clara de huevo en 100 mL de 1 m m HCl. almacenar esta solución en -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>DNasa <ol><li>disolver 100 mg de la DNasa 1 en 10 mL de agua estéril para generar un stock de 10 mg/mL. La solución a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 <ol><li>añadir a 50 mL de agua destilada (H 2 O) para generar un stock de 1 M 6,02 g de sulfato de magnesio (MgSO 4). Almacene la solución a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 <ol><li>disolver 0,735 g de cloruro de calcio (CaCl 2 &#8729; 2 H 2 O) en 50 mL de agua destilada de H 2 O a una concentración stock de 100 mM. Almacene la solución a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>KCl <ol><li>disolver 3.7275 g de KCl en 50 mL de agua destilada H 2 O a una concentración stock de 1 M. tienda solución a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>D-(+)-glucosa <ol><li>disolver 1,802 g de D-(+)-glucosa en 50 mL de agua destilada H 2 O a una concentración stock de 100 mM. Almacene la solución a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Medios de cultivo celular <ol><li>preparar medios de cultivo celular como sigue: 5 mL de calor inactiva el dializado de suero bovino Fetal, debe agregar 500 μl de 200 mM L-glutamina, 100 μl de 50 mg/mL de gentamicina y 1 mL de KCL de 1,0 M a 45 mL filtro esterilizado águila &#39; s mínimo esencial los medios de comunicación (E-MEM) que se complementa con 1,125 g/L D-glucosa para generar 50 mL de medios de cultivo de neuronas cerebelosas del gránulo. Almacenar los medios de comunicación de 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Furanoside de Beta-D-Arabino citosina <ol><li>disolver 48 mg de beta-D-arabino de citosina furanoside en 10 mL de medio de crecimiento a una concentración stock de 20 mM. Solución a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Poly-D-lisina <ol><li>para generar un poli de 2 mg/mL valores de D-lisina, añadir 10 mL de estéril de H 2 O a 20 mg de poli D-lisina. Bolsa polietileno D-lisina debe almacenarse a-80 ° C en alícuotas μl 100.</li>
	</ol></li> <li>Nota: las siguientes soluciones se deben preparar antes de la disección y mantenidas a 4 ° C hasta su uso.</li>
	<li>MgSO 4 enriquecido disección solución <ol><li>añadir 300 μL del stock de MgSO 4 a 250 mL de solución de disección.</li>
	</ol></li> <li>Solución de tripsina disección <ol><li>Agregar 100 μl del stock tripsina y 12 μl del stock de MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.</li>
	</ol></li> <li>1 de solución de tripsina inhibidor <ol><li>Agregar 164 μl de inhibidor de la tripsina stock, 250 μl de caldo de DNasa 1 y 12 μl del stock de MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.</li>
	</ol></li> <li>2 de solución de tripsina inhibidor <ol><li>Agregar 1040 μl de inhibidor de la tripsina stock, 750 μl de caldo de DNasa 1 y 12 μl de caldo MgSO4 a 10 mL de solución de disección.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 complementa la solución de disección <ol><li>añadir 10 μl del stock de CaCl 2 y 25 μl del stock de MgSO 4 a 10 mL de solución de disección.</li>
	</ol></li> <li>Poli D-lisina cubrió cultura platos <ol><li>para cubrir los platos de la cultura, diluir 100 μl del stock poly D-lisina en 40 mL de estéril H 2 O. Para platos de cultura Nunc 35 mm, añadir 2 mL de polivinílico diluido Solución D-lisina. Para 4 placas bien, añadir 300 μL de polivinílico diluido D-lisina a cada pocillo.</li>
		<li>Que el poli D-lisina se siente para 1 h antes de la aspiración y lavado cada uno bien con 4 mL o 600 μl (para 35 mm cultura platos o 4 placas bien, respectivamente) de estéril H 2 O. Luego aspirar el H 2 O y deje el aire platos secar durante 1 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Extracción y aislamiento del cerebelo del cerebro <ol><li>Decapito al día 6-7 viejo perrito de ratón usando las tijeras de la decapitación. Realizar la disección del cerebro en una campana de cultivo estériles para tejidos.</li>
	<li>Para quitar el cerebro, sujete la cabeza con un par de pinzas y cortar a través de la piel hacia la parte anterior de la cabeza usando el microdissection tijeras como se muestra en la figura 1. Cortan a través del hueso del cráneo usando un nuevo par de tijeras para minimizar el riesgo de contaminación. Retire del cráneo que cubren el cerebro con unas pinzas y embromar hacia fuera el cerebro con pinzas o una espátula de.
	<ol><li>Según sea necesario, cortar a través del nervio óptico para facilitar sacar el cerebro como un todo.</li>
	</ol></li> <li>Lugar del cerebro en la solución de disección que se complementa con MgSO 4. Mantener la solución y el cerebro en hielo.</li>
	<li>Siguiente retiro, bajo un microscopio de disección del cerebro, disecar hacia fuera el cerebelo del cerebro mientras que aún en la solución de MgSO 4 complementadas la disección y quitar las meninges con unas pinzas finas. Gire el cerebelo en su parte ventral y asegurar la eliminación del plexo coroides.</li>
	<li>Piscina el cerebelo en una placa de 35 mm ~ 1 ml de MgSO 4 complementado disección solución.</li>
	<li>Cortar el tejido en trozos pequeños y transferir a un tubo de 50 mL que contenga 30 mL de solución de MgSO 4 intermedia disección.</li>
</ol> 3. Ratón del gránulo cerebeloso neurona aislamiento y cultivo <ol><li>centrifugar el tubo de 50 mL que contiene el tejido cerebral picadito durante 5 minutos a 644 x g y 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y añadir 10 mL de solución de tripsina disección. Luego sacuda el tubo a alta velocidad durante 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir 10 mL de solución de inhibidor de tripsina 1 el tubo suavemente durante 2 minutos y</li>
	<li>Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 644 x g y 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y añadir 2 mL de solución de tripsina inhibidor 2 y entonces transfiéralo a un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Triture el tejido en la 15 mL el tubo hasta que la solución se vuelva turbia. Luego deja reposar 5 min</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo que contiene 1 mL de solución de CaCl 2 suplido disección.</li>
	<li>Añadir otro mL de tripsina inhibidor de la solución 2 a la parte inferior del tubo que contiene el precipitado del paso 3.6. Triturate otra vez y dejar que resolver por 5 minutos quite el sobrenadante y agregar al tubo que contiene el sobrenadante del paso 3.7 (que es una repetición de pasos 3.6-3.7). Repita este proceso hasta que la mayoría de los tejidos mecánicamente está disociado.</li>
	<li>Agregar 0,3 mL de CaCl 2 complementa la solución de disección a la colección sobrenadante por cada mL del sobrenadante.</li>
	<li>Mezclar el contenido del tubo y luego centrifugar durante 5 min a 644 x g.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y añadir 10 mL de medio fresco a la pastilla y se mezclan.</li>
	<li>Células pueden ser contadas y diluidas a una concentración de 1.5 x 10 6 células/mL. Tenga en cuenta que en general se esperan 10 millones de células de cada cerebro disecado, depende del tiempo de tripsinización y eficacia de la disección. Placa de células en las placas anterior poli D-lisina. Para pozo de 4 placas, placa de 0.5 mL, dando 7.5 x 10 5 células por pocillo. Para platos de 35 mm, placa de 4 mL, dando 6 x 10 6 células por placa.</li>
	<li>Después de 24 h, añadir furanoside de arabino-β-citosina (AraC) a las placas para reducir la contaminación glial. Cada mL de medio de 0,5 μl de 20 mM AraC se requiere. Además de AraC no requieren un cambio de los medios de comunicación. Si las células han de mantenerse durante 7-8 días, repetir este tratamiento el día 3.</li>
	<li>Mantener las culturas en una 5% CO 2 incubadora a 37 ° C y alimentar con 100 μl de 100 mM de glucosa agregado a la cultura por cada 2 mL de medio cada 2 días pasados 5 días. No es necesario un cambio de medios completo.</li>
</ol> 4. Embalaje de lentivirus, purificación y valoración Nota: el protocolo para el embalaje, concentración, purificación y valoración de lentivirus se ha descrito previamente en detalle sin el uso de un kit de 28, incluyendo métodos alternativos de valoración, tales como flujo cytometry 29. Aquí presentamos brevemente el protocolo usado en nuestro laboratorio para la producción de lentivirus para estudiar lesiones neuronales utilizando solución de purificación de virus rápida y un kit de regulación lentivirales de qPCR.
<ol><li>Las células Hek293T placa en platos de cultivo de 10 cm con Dulbecco &#39; s modificado Eagle &#39; s esencial medio mínimo (DMEM) suplementado con 10% FBS. Para la obtención de un alto título viral, crecer por lo menos 5 placas de células Hek293T para cada transfección. Asegúrese de que el día de las células de la transfección son confluentes de 70%. Cambiar los medios de comunicación tres horas antes de la transfección.</li>
	<li>Para cada transfección, prepare dos tubos. En el tubo 1 agregar 1.5 mL Suero reducido MEM medios y 41 μl de reactivo de transfección, mezclar bien. En el tubo 2, agregar 1,5 mL de medio MEM-reducido suero y 6 μg de plásmido de transferencia, 6 μg de pCMV-dR8.2 vector (plásmido de embalaje), 3 μg pCMV-VSV-G vector (plásmido de envolvente) y 35 μl de reactivo de potenciador de p3000 (suministrado con lipofectamine). Mezclar bien y combinar tubos 1 y 2, vortex e Incube por 15 minutos</li>
	<li>Retire el 50% de los medios de comunicación de placas Hek293T y añadir complejos lípidos de ADN a las células. Incubar durante 6 h a 37 ° C, 5% CO 2. Medios de quitar y reemplazar con 5 mL de DMEM fresco, incubar durante una noche.</li>
	<li>En 24 h transfección después, recoger el primer lote de sobrenadante viral de cada placa. Mantener los medios de comunicación viral a 4 ° C y añadir 5 mL de medio fresco en cada placa de células Hek293T. Incubar durante una noche.</li>
	<li>48 h post-transfección, recoger el segundo lote de sobrenadante viral, combinarlo con la primera tanda y centrifugar sobrenadante viral combinada durante 10 minutos a 600 x g.</li>
	<li>Filtrar el sobrenadante a través de un filtro con tamaño de poro de 45 μm.</li>
	<li>Purificar el virus usando una solución de purificación rápida de virus. Por cada 45 mL de sobrenadante viral, añadir 5 mL de solución de enlace lentivirales, mezcle y centrifugue durante 10 minutos a &#62; 5.000 x g y 4 ° C.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con cuidado para no perturbar el sedimento.</li>
	<li>Añadir 20-40 μl del medio y vuelva a suspender el sedimento. Alícuota y conservar a -80 ° C.</li>
	Se utiliza <li>para obtener el título lentivirales, un kit de regulación lentivirales de qPCR. Diluir 2 μl del virus purificado en 500 μl de PBS. Añadir 2 μl del virus diluido a 18 μL de buffer de lisis de virus (incluido en el kit).</li>
	<li>Conjunto de tres diferentes reacciones de RT-q-PCR en triplica y etiqueta como control positivo, lisado viral 1 (STD1) y control positivo 2 (STD2). Para cada reacción agregar, 12,5 μl de 2 x qPCR MasterMix, 2.5 μl de cualquiera viral lisado o STD1 (proporcionado en el kit) o STD2 (proporcionado en el kit) y 10 μl de reactivo de mezcla (proporcionado en el kit) en tubos PCR de 0,2 mL.</li>
	<li>Establecidas en el programa PCR: 20 min a 42 ° C para transcripción reversa, 10 min a 95 ° C para la activación de la enzima, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C para la desnaturalización y 1 min a 60 ° C para recocer/de la extensión.</li>
	<li>Calcular el título viral usando esta fórmula: 
	Título viral lysate = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1). 
	CTX = valor medio de la Ct de la muestra desconocida, Ct1 = valor promedio de STD1, Ct2 = valor promedio de STD2. 
	Nota: Puede mejor CGNs transduced con lentivirus o infectados con adenovirus dependiendo del modo de la lesión estudiada. Incorporación de lentiviruses en una MOI de 2-3 a la solución de cultivo celular en el momento de la galjanoplastia se utiliza para estudiar la señalización inducida por NMDA en el día 7 de la cultura. Esto se traduce en más del 80% transducción y es apropiado para proseguir con los análisis bioquímicos de estas neuronas ( figura 2). Además de adenovirus en el día 5 de cultivo (en MOI 50) y estudiar NMDA inducidos por señalización en día 7-8 se utilizan para otras técnicas como la proyección de imagen. Este tratamiento resulta en menos del 10% infección de las neuronas, lo que es ideal para la proyección de imagen y colocalización de proteínas. Adenovirus pueden utilizarse en el momento de la galjanoplastia para estudiar muerte de la célula ADN daño inducido por la adición de la camptotecina en día 2-3 o el estrés oxidativo por la adición de peróxido de hidrógeno. La presencia de proteínas de fluorescencia (GFP y RFP, CFP YFP) etiquetada con el gen de interés puede utilizarse para estimar la transducción por ciento y toxicidad potencial. Con el Ministerio del interior recomendada, vemos toxicidad mínima y máxima transducción ( figura 3).</li>
</ol> 5. Modelado Neuronal lesión <ol><li>para inducir NMDA inducidos por excitotoxicidad neuronal, después de 7 días en vitro, tratar CGNs con 100 μm NMDA y la glicina de 10 μm para 1 h. sustituir el medio por medio condicionado de culturas paralelas con no tratamiento. Esta concentración resulta en 50% la muerte celular en el tratamiento post 24 h ( figura 3). La fragmentación mitocondrial es evidente en el tratamiento post 6-8 h (ver Asl Jahani et al. 26 , 27).</li> <li>para inducir la muerte celular inducida por ROS (estrés oxidativo), tratamiento de neuroNS con 75-100 μm el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y a acondicionado medios de culturas paralelas después de la exposición de 5 min a H 2 O 2. Nota debido a la inestabilidad de H 2 O 2, optimizar la concentración a un nivel que induce la muerte celular, 50-70% en cultura tras 24 h de tratamiento.</li>
	<li>Para inducir la DNA daño muerte celular inducida, tratar CGNs con camptotecina μm 10. Esta concentración induce más que muerte celular 50% en 24 h. fragmentación mitocondrial y señalización de apoptosis temprana ocurre 2-3 h después de la adición de la camptotecina en esta concentración (ver Asl Jahani et al. 18)</li> <li>para inducir la baja K + inducida por apoptosis neuronal en CGNs, cambiar los medios de comunicación que contiene 25 mM K + a medios bajos de potasio con 5 mM K + después de 7 días en vitro.</li></ol>

<ol><li>Goldowitz, D., Hamre, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+molecules+that+make+a+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The cells and molecules that make a cerebellum.</a> Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).</li>
<li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li>
<li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultures+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li>
<li>Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+neurobiology+of+neuronal+development%3A+the+cerebellar+granule+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell.</a> Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li>
<li>Evans, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+signalling+in+cerebellar+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic signalling in cerebellar plasticity.</a> Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Arundine, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+calcium-dependent+neurodegeneration+in+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity.</a> Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).</li>
<li>Szydlowska, K., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+ischemia+and+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium, ischemia and excitotoxicity.</a> Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).</li>
<li>Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+joining+forces+to+thwart+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: joining forces to thwart cell death.</a> Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).</li>
<li>Rego, A. C., Oliveira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+reactive+oxygen+species+in+excitotoxicity+and+apoptosis%3A+implications+for+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).</li>
<li>Wei, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+BAX+and+BAK%3A+a+requisite+gateway+to+mitochondrial+dysfunction+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death.</a> Science. 292 (5517), 727-730 (2001).</li>
<li>Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).</li>
<li>Coyle, J. T., Puttfarcken, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+glutamate%2C+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders.</a> Science. 262 (5134), 689-695 (1993).</li>
<li>Cole, K., Perez-Polo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+trauma+model%3A+in+search+of+Thanatos%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal trauma model: in search of Thanatos.</a> Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).</li>
<li>Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death.</a> Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+protects+cerebellar+granule+neurons+against+injury-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death.</a> J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).</li>
<li>Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+depolarization+in+the+survival+and+differentiation+of+cerebellar+granule+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture.</a> J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).</li>
<li>Miller, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+deletion+further+orders+the+cell+death+pathway+in+cerebellar+granule+cells+and+suggests+a+caspase-independent+pathway+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death.</a> J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).</li>
<li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium%2Fserum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li>
<li>Piccioli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activation+induces+apoptosis+in+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells.</a> J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).</li>
<li>D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+in+cerebellar+granule+neurons+by+low+potassium%3A+inhibition+of+death+by+insulin-like+growth+factor+I+and+cAMP%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).</li>
<li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).</li>
<li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK5+phosphorylates+DRP1+and+drives+mitochondrial+defects+in+NMDA-induced+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death.</a> Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).</li>
<li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+inner+membrane+GTPase%2C+optic+atrophy+1+%28Opa1%29%2C+restores+mitochondrial+morphology+and+promotes+neuronal+survival+following+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity.</a> J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. (32), (2009).</li>
<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li>
<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí le ofrecemos un método simple para el cultivo de neuronas cerebelosas del gránulo de primario de ratón (CGNs), pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de diferentes mecanismos de muerte celular. Varios factores afectan la reproducibilidad de los resultados mediante este procedimiento que requieren vigilancia estrecha. Se trata de la pureza de la cultura incluyendo la eliminación de las células gliales en la cultura, la confluencia de la cultura y mantener las células sanas. Presenta variabilidad en e...

Las neuronas cerebelosas del gránulo (CGNs) están bien caracterizadas en la cultura y han servido como un modelo eficaz para estudiar la muerte neuronal y desarrollo 1,2,3,4,5, 6. la temprana expresión de los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA) en culturas CGN en vitro hace un atractivo modelo para estudiar la señalización inducida por el NMDA. Activación de estos receptores con NMDA junto con despolarización de la membrana se utiliza para modelar la estimulación fisiológica de la actividad neuronal y ha permitido para la investigación en los mecanismos de plasticidad sináptica 7,8. Por el contrario, exceso de estimulación de estos receptores por el ligando NMDA puede utilizarse para modelar la excitotoxicidad, un mecanismo importante de pérdida neuronal en aguda lesiones cerebrales y neurodegenerativas enfermedades 9. Un mecanismo para la inducción de la excitotoxicidad es a través de la inanición de ATP con oxígeno reducido, como se observa en lesión neuronal aguda. Esto se traduce en la despolarización de la membrana y liberan niveles elevados de glutamato en la sinapsis. La subsiguiente estimulación del receptor NMDA de glutamato elevados resultados en exceso Ca2 + afluencia a través de estos receptores, que a su vez activa varias vías incluyendo Ca2 +-activa proteasas, fosfolipasas, y Endonucleasas, dando por resultado la degradación incontrolada de críticos componentes celulares y muerte celular. Además, alta Ca intracelular2 + conduce a la generación de radicales libres de oxígeno y daño mitocondrial 10,11.
Mientras que la mayoría de la pérdida neuronal después de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA es debido a la afluencia del calcio y Bax/Bak independiente, no pueden excluirse otros mecanismos de muerte celular de este modelo. La aparición de ambos necrótico y apoptosis muerte celular por excitotoxicidad es parcialmente debido a la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y daño del ADN causado poralta intracelular Ca 2 + niveles 12. Daño de la DNA resulta en la muerte neuronal a través de mecanismos de apoptosis se correlacionan con señas de identidad de muerte celular por apoptosis, como la aparición de las masas de cromatina y cuerpos apoptóticos. Inducción de la apoptosis es mediada por la liberación de citocromo c desde la mitocondria y se ha demostrado para ser dependiente en la Oligomerización de Bax/Bak 13. Oligomerización de Bax/Bak promueve la formación de poros en la membrana mitocondrial externa, dando por resultado la liberación del citocromo c y la activación de pro-apoptótica reguladores con lesión isquémica leve 14.
Generación de ROS es un problema importante en el cerebro debido a los bajos niveles endógenos de antioxidantes, juntados con la necesidad de oxígeno grande para el funcionamiento neuronal 15. Cuando se expone a un evento isquémico, óxido nítrico sintasa es upregulated, produciendo óxido nítrico y aumento de especies reactivas de oxígeno 14. La mayor concentración de radicales de oxígeno puede causar daño en el ADN e indirectamente causar hambre de energía. Altos niveles de roturas de doble hebra de DNA son evacuados por la activación de la poli ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1), una proteína enlazado a la cromatina eucariota responsable de catalizar a la transferencia de unidades de ADP-ribosa del NAD+, un proceso integral que 16de reparación del ADN. Sin embargo, con excesivo daño por estrés oxidativo, activación de la PARP-1 puede causar hambre de energía debido al creciente drenaje de NAD+, un sustrato necesario para la producción de ATP mediante la fosforilación oxidativa. En última instancia, estrés oxidativo dispara la apoptosis en una manera de dependientes de Bax/Bak conduce a liberación c del citocromo mitocondrial y se ha demostrado para inducir el remodelado mitocondrial en CGNs 17.
Finalmente, cambios en la concentración de cloruro de potasio (KCl) en las culturas de la CGN pueden utilizarse para modelar bajo potasio/despolarización mediada por apoptosis 18,19,20. Cuando está expuesto a bajos niveles de K+, CGNs experimentan cambios fisiológicos distintos, dando por resultado la reducción de la respiración mitocondrial y la glicolisis, atribuido a disminución demanda celular 21, así como reducción en los niveles de nuclear factor-KB (NFκB) que regula las actividades incluyendo inflamación y transmisión sináptica 22. Este modelo es de particular interés para el estudio de la muerte celular durante el desarrollo neuronal. El ambiente K+ bajo más de cerca se asemeja a las condiciones fisiológicas y hace señas de identidad de muerte celular durante el desarrollo neuronal 23.
En Resumen, CGNs proporcionan un modelo de larga data para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de degeneración y muerte neuronal. El siguiente protocolo permitirá aislamiento y cultivo de CGNs, expresión o represión de una particular vía genética con el virus y la inducción de la muerte neuronal por mecanismos diferentes que representan la degeneración y lesión neuronal.

<table><tbody><tr><td>kit de valoración lentivitral qPCR&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV900</td><td></td></tr><tr><td>solución rápida de purificación de virus&nbsp;</td><td>ABM</td><td>#LV999</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VS.VG</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#15230162</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>#25030081</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Platos de cultivo Nunc</td><td>Gibco</td><td>#174913</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR green master</td><td>mix life technologies</td><td>#A25742</td><td></td></tr><tr><td>BSA V Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A-8412</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-7902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-9911</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina de clara de huevo de gallina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Citosina beta-D-Arabino Furanósido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-1768</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-7528</td><td></td></tr><tr><td>DNase1&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Eagle-medio esencial mínimo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2279</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-5417</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino dializado inactivado por calor&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#F-0392</td><td></td></tr><tr><td>Amortiguador Hepes&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#H-0887</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#216763</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/mL Gentamicina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-1397</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Ácido N-metil-D-aspártico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-3262</td><td></td></tr><tr><td>Solución de rojo de fenol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T-4549</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>p3000 reactivo potenciador</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#CABDH9258 <tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#CABDH9286 NaH2PO4H2O&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>#CABDH9298 <tr><td>Poly D-lisina&nbsp;</td><td>VWR</td><td>#89134-858</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>#080-450</td><td></td></tr></tbody></table>

modelado de la muerte neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Las neuronas cerebelosas del gránulo (CGNs) son un modelo neuronal comúnmente utilizado, formando una abundante población homogénea en el cerebelo. A la luz de su desarrollo post-natal, abundancia y accesibilidad, CGNs son un modelo ideal para el estudio de procesos neuronales, incluyendo el desarrollo neuronal, la migración neuronal y estimulación de la actividad neuronal fisiológico. Además, las culturas de la CGN proporcionan un excelente modelo para estudiar modos de muerte celular como excitotoxicidad y apoptosis. Dentro de una semana en cultura, CGNs expresan los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA), un receptor de glutamato ionotrópicos específicos con muchas funciones esenciales en salud neuronal y la enfermedad. La adición de bajas concentraciones de NMDA junto con despolarización de la membrana para roedores cultivos primarios de la CGN se ha utilizado para estimulación de la actividad neuronal fisiológica mientras que la adición de altas concentraciones de NMDA puede ser empleada para modelar lesión neuronal excitotóxicos. Aquí, se describen un método de aislamiento y cultivo de CGNs de cachorros 6 días de edad, así como la manipulación genética de CGNs por adenovirus y lentivirus. Tenemos también presente protocolos optimizados sobre cómo estimular la apoptosis inducida por potasio bajo, estrés oxidativo, excitotoxicidad inducida por NMDA y daño de la DNA después de la transducción de estas neuronas.

Con disección cuidadosa, debe quitarse el cerebro intacto con daño mínimo como se ve en la figura 1A-B. Esfuerzo debe tomarse para minimizar los daños al cerebro durante la extracción, particularmente daños a cerebelo. Daños en el cerebelo hacen de más difícil identificación y eliminación completa de las meninges y aumenta la probabilidad de contaminación de la cultura neuronal. Una vez que se hayan removido las meninges, cerebelo puede disec...

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener poblaciones puras y sanas de neuronas granulares cerebelosas y manipularlas genéticamente para modelar diferentes mecanismos de lesión neuronal en cultivo primario in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la lesión neuronal. Utilizamos este protocolo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de las lesiones nerviosas tras daño cerebral agudo y enfermedades neurodegenerativas.La principal ventaja de este protocolo es que podemos modelar diferentes mecanismos de muerte celular, como la excitotoxicidad, el estrés oxidativo, el daño en el ADN y los eventos de desarrollo, utilizando el sistema de cultivo. Aunque este método puede proporcionar información sobre la lesión neuronal, también puede utilizarse con neuronas cerebelosas de rata para estudiar la actividad neuronal y la morfogénesis en respuesta a factores de crecimiento y eventos secundarios. Para extraer el cerebro de un ratón de seis a siete días de edad, use un par de pinzas para sujetar la cabeza y, con tijeras de disección microquirúrgicas, corte la piel en dirección anterior hacia la cabeza.Replegar la piel para revelar el cráneo. A continuación, penetrar el cráneo con la punta de las tijeras y cortar en dirección anterior y lateral. Teniendo cuidado de no dañar el cerebelo, y para facilitar la identificación y eliminación de las meninges, usar luego una pinza para retirar el cráneo y exponer el cerebro.Con un par de pinzas o espátula, separe suavemente el cerebro en solución de disección fría. Para aislar el cerebelo, coloque el cerebro en la solución de disección suplementada con sulfato de magnesio y mantenga la solución y el cerebro sobre hielo. Bajo el microscopio de disección, retire las meninges utilizando pinzas finas, luego seccione el cerebelo del cerebro en la solución de disección suplementada con sulfato de magnesio.Esto facilita la eliminación de las meninges restantes y permite separar las capas para limpiar los pliegues del cerebelo. La presencia de meninges en cultivos neuronales provoca células enfermas y, eventualmente, muerte celular. Por tanto, es importante asegurar la eliminación completa de las meninges antes de proceder con el cultivo.A continuación, gire el cerebelo hacia su lado ventral y asegúrese de eliminar el plexo coroideo. Luego, coloque los cerebelos en una placa de 35 milímetros que contenga un mililitro de solución de disección suplementada con sulfato de magnesio. Corte los tejidos en trozos pequeños y transfiéralos a un tubo de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de solución de disección tamponada con sulfato de magnesio.En este paso, centrifugue el tubo de 15 mililitros que contiene el tejido cerebral picado durante cinco minutos a 644 ×g y cuatro grados Celsius. A continuación, elimine el sobrenadante y agregue 10 mililitros de solución de disgregación con tripsina. Luego, agite la mesa a alta velocidad durante 15 minutos a 37 grados Celsius.Añada dos mililitros de solución de inhibidor de tripsina uno al tubo y agite suavemente durante dos minutos. Posteriormente, centrifugue el tubo durante cinco minutos a 644 ×g y cuatro grados Celsius. Después de cinco minutos, retire el sobrenadante y añada dos mililitros de solución de inhibidores de tripsina dos antes de transferirlo a un tubo de 15 mililitros.Luego, triture el tejido en el tubo de 15 mililitros hasta que la solución se vuelva turbia. Deje reposar durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante claro y transfiéralo a un nuevo tubo que contenga un mililitro de solución de disección suplementada con cloruro de calcio.Agregue otros dos mililitros de solución de inhibidor de tripsina 2 al fondo del tubo que contiene el precipitado. Pase nuevamente por la pipeta y deje reposar durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y añádalo al tubo que contiene el sobrenadante del paso anterior.Repita este proceso hasta que la mayor parte del tejido esté disociada mecánicamente. Añada 0,3 mililitros de solución de disección suplementada con cloruro de calcio a la recolección del sobrenadante por cada mililitro de sobrenadante. Mezcle el contenido del tubo y luego centrifugue durante cinco minutos a 644 ×g a temperatura ambiente.A continuación, elimine el sobrenadante. Añada 10 mililitros de medio fresco al precipitado y mezcle. Luego cuente las células viables y dilúyalas a una concentración de 1,5 × 10⁶ células por mililitro.Siembre las células en las placas de poli-D-lisina preparadas previamente. Para placas de cuatro pocillos, siembre 0,5 mililitros de la muestra, obteniendo 7,5 × 10⁵ células por pocillo. Para placas de 35 milímetros, siembre 4 mililitros de la muestra, obteniendo 6 × 10⁶ células por placa.Para cubreobjetos, siembre 0,5 mililitros que proporcionen 7,5 × 10⁵ células por pocillo. Después de 24 horas, agregue AraC a las placas para reducir la contaminación por células gliales. Si las células deben mantenerse durante siete u ocho días, repita este tratamiento en el día tres y mantenga los cultivos en un incubador con 5 % de CO₂ a 37 grados Celsius.Para los cultivos mantenidos por más de cinco días, alimente el cultivo con glucosa cada dos días a partir del día cinco. Para inducir la excitotoxicidad neuronal con NMDA, tras siete días in vitro, trate las neuronas granulares cerebelosas con 100 micromolar de NMDA y 10 micromolar de glicina durante una hora. Luego, reemplace el medio con medio condicionado proveniente de cultivos paralelos sin tratamiento.Esta concentración provoca la muerte del 50 % de las células a las 24 horas posteriores al tratamiento. Para la muerte celular inducida por ERO, trate las neuronas con peróxido de hidrógeno a una concentración de 75 a 100 micromolar durante cinco minutos. Después de cinco minutos, cámbielo al medio condicionado de cultivos paralelos.Debido a la inestabilidad del peróxido de hidrógeno, la concentración debe optimizarse a un nivel que induzca entre un 50 y un 70 % de muerte celular tras 24 horas. Esta concentración suele estar entre 75 y 100 micromolar. Para inducir la muerte celular mediante daño en el ADN, trate los neuronas granulares cerebelosas con 10 micromolar de camptotecina para inducir más del 50 % de muerte celular dentro de las 24 horas.Para inducir la apoptosis neuronal por bajo potasio en neuronas granulares cerebelosas, cambie el medio que contiene 25 milimolares de potasio a un medio de bajo potasio con cinco milimolares de potasio tras siete días in vitro. Las neuronas fueron transducidas con lentivirus para RFP a una MOI de tres en el momento del sembrado. Fijadas y teñidas a los siete días in vitro.La co-localización de la señal de RFP con MAP2 y Hoechst se muestra para demostrar neuronas sanas que han sido completamente transducidas por lentivirus. Las imágenes mostradas aquí representan análisis del ensayo de viabilidad celular en neuronas infectadas con diferentes MOI de adenovirus para medir la toxicidad. La infección de neuronas granulares del cerebelo con adenovirus que expresan LacZ a un MOI entre 25 y 50 permite una eficiencia máxima manteniendo una toxicidad mínima.Se observa menos de un 1% de diferencia en la supervivencia celular en comparación con el control al infectar con este MOI. Estas figuras muestran la tinción con Hoechst de neuronas granulares del cerebelo de control y de neuronas granulares del cerebelo tratadas con NMDA para inducir la muerte celular. Observe la formación de núcleos piqnóticos tras el tratamiento con NMDA.Esto es un indicio de muerte celular y puede observarse en aproximadamente el 50 % de la cultura 24 horas después del tratamiento con 100 micromolar de NMDA y 10 micromolar de glicina. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas y media con seis cerebros de ratón, si se realiza adecuadamente. Al llevar a cabo esta técnica, es importante utilizar técnica aséptica e instrumentos quirúrgicos en cadena según sea necesario para minimizar el riesgo de contaminación de la cultura.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia estudiaran el desarrollo neuronal y la lesión neuronal en neuronas primarias de ratón. Después de ver este video, usted debería ser capaz de cultivar neuronas granulares cerebelosas, manipularlas genéticamente utilizando virus e inducir diversos mecanismos de lesión neural. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como inmunofluorescencia o ensayos de viabilidad celular para responder preguntas como si un gen de interés mejora la supervivencia celular en respuesta a la excitotoxicidad, al estrés oxidativo o al daño del ADN.

modeling-neuronal-death-degeneration-mouse-primary-cerebellar-granule

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.

Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

Este video muestra la técnica para aislar y cultivar neuronas cerebelosas primarias de ratón. Las células se tratan con un antimetabolito para eliminar las células gliales proliferantes y producir un cultivo puro de neuronas granulosas cerebelosas.

Aislamiento y cultivo de neuronas cerebelosas primarias de ratón

Este video demuestra la generación de un modelo de lesión neuronal en neuronas cerebelosas primarias de ratón. Describe los pasos involucrados en la inducción de la lesión neuronal utilizando NMDA, un agonista del receptor de neurotransmisores excitatorios, y glicina, un coagonista. El NMDA y la glicina se unen a receptores neuronales específicos, lo que provoca su sobreestimulación y provoca una afluencia masiva de calcio intracelular, que provoca daño y muerte de las células neuronales.

Modelado de la lesión neuronal en neuronas cerebelosas primarias de ratón

Este video describe la generación de un modelo de lesión neuronal utilizando especies reactivas de oxígeno (ROS) en neuronas cerebelosas primarias de ratón. En él se detalla el proceso de inducción del estrés oxidativo mediante la adición de altas concentraciones de peróxido de hidrógeno. La exposición a las ROS provoca roturas de cadenas de ADN e inestabilidad genómica. Además, la oxidación de las proteínas celulares perjudica sus funciones, mientras que la peroxidación lipídica compromete la...

Modelado de la muerte neuronal inducida por especies reactivas de oxígeno en neuronas granulosas cerebelosas de ratón

Source: Chan, U., et al., utilizando la electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de las neuronas de gránulos cerebelosos y el desarrollo de sinapsis. J. Vis. Exp. (2021).Este video demuestra el análisis del desarrollo de neuronas granulosas cerebelosas mediante la obtención de imágenes de cortes de tejido cerebral prefijados de ratones marcados con una proteína fluorescente, Capturar imágenes de alta resolución de la pila Z con un microscopio confocal y medir los parámetros...

Visualización de la sinaptogénesis de las neuronas granulosas cerebelosas en diferentes etapas de desarrollo

Morfogénesis neuronal y la migración son eventos cruciales que subyacen el desarrollo adecuado del cerebro. Aquí se describen los métodos para manipular genéticamente las neuronas granulares de cerebelo en cultivo y el cerebelo en desarrollo para la evaluación de la morfología y las características migratorias de las neuronas.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

La capa externa del gránulo del cerebelo es el sitio de la amplificación de tránsito más grande en el cerebro en desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para orientar la modificación genética a esta capa en el pico de la proliferación mediante electroporación ex vivo y la cultura de las rebanadas del cerebelo a partir de embriones Día 14 embriones de pollo.

Ex Vivo Cultura de polluelo cerebelosos Rebanadas y espacialmente focalizadas Electroporación de gránulos precursores celulares

Este protocolo describe cómo medir con precisión la viabilidad neuronal utilizando fluoresceína diacetato (FDA) y Propidium Iodide (PI) doble tinción en neuronas cultivadas de gránulos cerebelosos, un cultivo neuronal primario utilizado como un modelo in vitro en neurociencia y neurofarmacología investigación.

Evaluación de la Viabilidad Neuronal Utilizando Colorante de Fluoresceína-Ioduro de Propidio Doble Coloración en Gránulos Cerebelosos Cultura de Neuronas

Realizar experimentos in vitro para reflejar las condiciones in vivo lo más adecuadamente posible no es una tarea fácil. El uso de cultivos celulares primarios es un paso importante hacia la comprensión de la biología celular en todo un organismo. El protocolo proporcionado describe cómo crecer y cultivar con éxito las neuronas cerebelosas de ratón embrionarios.

Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

Aquí describimos un método para visualizar la sinaptogénesis de las neuronas granulares en el cerebelo del ratón durante el curso del desarrollo cerebral postnatal cuando estas células refinan sus estructuras sinápticas y forman sinapsis para integrarse en el circuito cerebral general.

Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis

Aprende a modelar la muerte neuronal y la degeneración en neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón. Este método permite estudiar mecanismos de lesión como excitotoxicidad, estrés oxidativo y daño del ADN en cultivos in vitro.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Explorar más videos