Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

El objetivo general de este procedimiento es producir poblaciones puras y sanas de neuronas granulosas cerebelosas y manipularlas genéticamente y modelar diferentes mecanismos de lesión neuronal en el cultivo primario in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las lesiones neuronales. Utilizamos este protocolo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de las lesiones neuronales después de un daño cerebral agudo y enfermedades neurogenerativas.

La principal ventaja de este protocolo es que podemos modelar diferentes mecanismos de muerte celular como la excitotoxicidad, el estrés oxidativo, el daño al ADN y el evento de desarrollo utilizando el sistema de cultivo. Aunque este método puede proporcionar información sobre la lesión neuronal, también se puede utilizar con las neuronas cerebelosas de rata para estudiar la actividad neuronal y la morfogénesis en respuesta a factores de crecimiento y eventos secundarios. Para extraer el cerebro de un ratón de seis a siete días de edad, use un par de pinzas para agarrar una cabeza y, con unas tijeras de microdisección, corte la piel anteriormente hacia la cabeza.

Empuja la piel hacia atrás para revelar el cráneo. A continuación, penetra en el cráneo con la punta de las tijeras y corta anterior y lateralmente. Teniendo cuidado de no dañar el cerebelo y facilitar la identificación y extracción de las meninges, luego use fórceps para despegar el cráneo exponiendo el cerebro.

Con un par de pinzas o una espátula, extrae suavemente el cerebro y conviértelo en una solución de disección fría. Para aislar el cerebelo, coloque el cerebro en la solución de disección suplementada con sulfato de magnesio y mantenga la solución y el cerebro en hielo. Bajo el microscopio de disección, extirpe las meninges con pinzas finas, luego diseccione el cerebelo del cerebro en una solución de disección suplementada con sulfato de magnesio.

Esto ayuda a despegar las meninges restantes y permite pasar entre las capas para limpiar los pliegues cerebelosos. La presencia de meninges en el cultivo neuronal da lugar a células enfermas y a la eventual muerte celular. Por lo tanto, es importante asegurarse de que las meninges se extirpen por completo antes de proceder con el cultivo.

Después de eso, gire el cerebelo hacia su lado ventral y asegure la eliminación del plexo coroideo. A continuación, coloque la cerebela en un plato de 35 milímetros que contenga un mililitro de solución de disección suplementada con sulfato de magnesio. Pica los tejidos en trozos pequeños y transfiérelos a un tubo de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de solución de disección tamponada con sulfato de magnesio.

En este paso, centrifuga el tubo de 15 mililitros que contiene el tejido cerebral picado durante cinco minutos a 644 veces g y cuatro grados centígrados. Después de eso, retire el sobrenadante y agregue 10 mililitros de solución de disección de tripsina. Luego agite la mesa a alta velocidad durante 15 minutos a 37 grados centígrados.

Agregue dos mililitros de solución inhibidora de tripsina uno al tubo y mueva suavemente durante dos minutos. Posteriormente, centrifugar el tubo durante cinco minutos a 644 veces g y cuatro grados centígrados. Después de cinco minutos, retire el sobrenadante y agregue dos mililitros de la solución dos de inhibidores de tripsina antes de transferirlo a un tubo de 15 mililitros.

Luego triture el tejido en el tubo de 15 mililitros hasta que la solución se vuelva turbia. Déjalo reposar durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante transparente y transfiéralo a un nuevo tubo que contenga un mililitro de solución de disección suplementada con cloruro de calcio.

Agregue otros dos mililitros de la solución inhibidora de tripsina dos al fondo del tubo que contiene el pellet. Trituramos de nuevo y dejamos reposar durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y agréguelo al tubo que contiene el sobrenadante del paso anterior.

Repita este proceso hasta que la mayor parte del tejido se disocie mecánicamente. Agregue 0.3 mililitros de solución de disección suplementada con cloruro de calcio a la colección de sobrenadante por cada mililitro de sobrenadante. Mezclar el contenido del tubo y luego centrifugar durante cinco minutos a 644 veces G a temperatura ambiente.

Después de eso, retire el sobrenadante. Agregue 10 mililitros de medio fresco al pellet y mezcle. A continuación, cuente las células vivas y dilúyalas hasta una concentración de 1,5 por 10 a las seis células por mililitro.

Coloque las células en las placas de poli D-lisina previamente preparadas. Para placas de cuatro pocillos, la placa limita 0,5 milímetros de la muestra, lo que da 7,5 veces 10 a la quinta celda por pocillo. Para platos de 35 milímetros, coloque cuatro mililitros de la muestra, dando seis veces 10 a la sexta celda por placa.

Para los cubreobjetos, coloque 0,5 mililitros dando 7,5 veces 10 a la quinta celda por pocillo. Después de 24 horas, agregue AraC a las placas para reducir la contaminación glial. Si las células se van a mantener durante siete u ocho días, repita este tratamiento el tercer día y mantenga los cultivos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 grados centígrados.

Para los cultivos mantenidos por más de cinco días, alimente el cultivo con glucosa cada dos días a partir del día cinco. Para inducir excitotoxicidad neuronal con NMDA, después de siete días in vitro, tratar las neuronas granulosas cerebelosas con 100 micromolares NMDA y 10 micromolares de glicina durante una hora. Luego, reemplace el medio con medio acondicionado de los cultivos paralelos sin tratamiento.

Esta concentración da como resultado la muerte celular del 50% a las 24 horas después del tratamiento. Para la muerte celular inducida por ROS, trate las neuronas con peróxido de hidrógeno a 75 a 100 micromolares durante cinco minutos. Después de cinco minutos, cámbielo a los medios condicionados de referencias culturales paralelas.

Debido a la inestabilidad del peróxido de hidrógeno, la concentración debe optimizarse a un nivel que induzca entre el 50 y el 70% de la muerte celular después de 24 horas. Esta concentración suele estar entre 75 y 100 micromolares. Para inducir la muerte celular por daño en el ADN, trate las neuronas granulosas cerebelosas con 10 micromolares de camptotecina para inducir más del 50% de la muerte celular en 24 horas.

Para la apoptosis neuronal inducida por bajo potasio en neuronas granulosas cerebelosas, cambie el medio que contiene 25 milimolares de potasio a un medio bajo en potasio con cinco milimolares de potasio después de siete días in vitro. Las neuronas se transducieron con lentivirus para RFP a un MOI de tres en el momento de la siembra. Se fija y se tiñe a los siete días in vitro.

Se ha demostrado que la colocalización de la señal RFP MAP2 y Hoechst demuestra neuronas sanas que son completamente transducidas por lentivirus. Las imágenes que se muestran aquí representan análisis de ensayos de vidas y muertos de neuronas infectadas con diferentes MOI de adenovirus para medir la toxicidad. Las neuronas granulosas cerebelosas infectadas con adenovirus que expresan LacZ a un MOI entre 25 y 50 permiten una máxima eficiencia mientras mantienen una toxicidad mínima.

Se observa una diferencia de menos del 1% en la supervivencia celular en comparación con el control cuando se infecta en este MOI. Estas figuras muestran la tinción de Hoechst de las neuronas granulosas cerebelosas de control y las neuronas granulosas cerebelosas tratadas con NMDA para inducir la muerte celular. Nótese la formación de núcleos picnóticos con el tratamiento NMDA.

Esta es una indicación de muerte celular y se puede observar en aproximadamente el 50% del cultivo 24 horas después del tratamiento con NMDA de 100 micromolares y glicina de 10 micromolares. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas y media con seis pulsaciones del ratón, si se realiza correctamente. Al realizar esta técnica, es importante utilizar una técnica aséptica e instrumentos quirúrgicos encadenados según sea necesario para minimizar el riesgo de contaminación del cultivo.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del campo de la neurociencia estudiaran el desarrollo neuronal y la lesión neuronal en neuronas primarias de ratón. Después de ver este video, debería poder cultivar neuronas granulares cerebelosas, manipularlas genéticamente usando virus e inducir diversos mecanismos de lesión neuronal. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunofluorescencia o los ensayos de viabilidad celular para responder a preguntas como si un gen de interés mejora la supervivencia celular en respuesta a la excitotoxicidad, el estrés oxidativo o el daño del ADN.