Básico

En este video, vamos a mostrarle cómo sincronizar C. elegans en la etapa de primer estadio. Este es un método sencillo, pero muy común, por lo que será bastante útil. Aún es principiante.

Si usted es un experto en C, puede encontrar aquí algunos consejos para optimizar este protocolo. La base de la sincronización de los gusanos depende de la resistencia relativa de los adultos y los embriones a la solución alcalina de hipoclorito frente a los adultos. Estos gusanos adultos, que contienen muchos embriones en su interior, se incuban con una solución de hipoclorito de manera que mueren, dejando únicamente los embriones.

La segunda parte de la sincronización se logra mediante la falta de alimento, de modo que, aunque los embriones eclosionen en momentos diferentes, no desarrollen más allá del estadio L1. El primer paso para iniciar un protocolo de "blitzing" es tener gusanos en la etapa de puesta de huevos, con varios huevos dispersos en la placa. Utilice M9 para recuperar los adultos con el fin de cosecharlos.

Además, los embriones que ya han llegado a la superficie de la placa pueden rasparse con un material suave, como un trozo de película de rayos X, para eliminar las bacterias, recuperando los embriones con varios lavados con medio M nueve. Por lo general, un par de lavados son suficientes. Una vez que los gusanos han sido lavados, es momento de agregar la solución de blanqueo recién preparada de acuerdo con nuestras preferencias.

Controle el tiempo de incubación mientras agita el tubo. Puede monitorear la aparición de los adultos bajo el microscopio estereoscópico. Una vez que queden casi sin restos, detenga la reacción agregando M nueve hasta que el tubo esté completamente lleno.

Para finalizar el protocolo, realice al menos tres lavados. Con M nueve, los huevos se incuban con agitación continua durante la noche en tampón M nueve, lo que permite la eclosión pero evita el desarrollo posterior de los gusanos. Aunque la sincronización puede realizarse a cualquier temperatura entre 15 y 25 grados, se recomienda 15.

Dado que el desarrollo es más lento, como hemos mencionado durante su desarrollo, *C. elegans* atraviesa cuatro estadios larvales antes de alcanzar la edad adulta, un periodo cuya duración depende de la temperatura a la que se críe. Aunque *C. elegans* tolera temperaturas de crecimiento que van desde 15 hasta 25 grados, la velocidad de crecimiento es mayor.

La temperatura superior aquí, puede observarse cómo después de 24 horas, las etapas en las que se encuentran los gusanos son diferentes. A las 15 y 25 grados, después de 48 horas a 25 grados, ya observamos embriones. Sin embargo, debemos esperar más de 80 horas para ver embriones en la superficie de las placas.

Con gusanos cultivados a 15 grados para obtener resultados óptimos, deben considerarse varios aspectos al realizar un experimento de blitzing. También es importante reconocer los gusanos que se encuentran en la etapa deseada para la realización del experimento. Por lo tanto, le mostraremos cómo distinguir las etapas ya sea por tamaño, microscopía de contraste de interferencia diferencial o tinción.

En este gráfico, puede apreciarse la tasa de crecimiento de los gusanos de GaN según la temperatura, ya que, como decimos, crecen mucho más rápido a 25 grados. Existe una correlación entre el tamaño del animal y su desarrollo en los elementos marinos. Con el software adecuado, los animales pueden medirse y luego clasificarse en el estado de desarrollo adecuado.

Según este gráfico, sin embargo, el sitio es un marcador general de las etapas de desarrollo. Se puede lograr una mayor concordancia en la clasificación mediante la observación de partes de los estadios, anatomía que puede ser utilizada y reconocida ya sea por interferencia diferencial, microscopía de contraste de fase, o tinción con DPI. En nuestro laboratorio, hemos utilizado este protocolo para sincronizar gusanos para diferentes experimentos, como micro huevos en tinción monocromática, visualización in situ y tinción con up.

Además, este Protocolo también ayuda a eliminar la contaminación. Se utiliza microscopía de contraste de interferencia diferencial o microscopía normal para mejorar el contraste. En muestras transparentes sin tinción, los animales se montan vivos sobre una base de Agros al 2 %, que puede prepararse previamente y almacenarse a cuatro grados cuando sea necesario.

Se puede fundir y mantener a 65 grados. Una vez que el agaros está fundido, coloque una cinta adhesiva en un portaobjetos y colóquela en ambos lados de un tercer portaobjetos. Tome cuidadosamente algo de agaros y coloque una gota sobre el portaobjetos sin cinta.

Cubra los agros con otra laminilla colocada transversalmente. Una vez que el camino esté sólido, separe las dos laminillas deslizando cuidadosamente una sobre la otra. La almohadilla se adherirá a una de ellas.

Agregue un poco de Amazon sobre el portaobjetos para mantener los gusanos inmovilizados. Seleccione algunos gusanos bajo el microscopio estereoscópico y transfiéralos a la gota de lele. Evite dañar el camino.

Tome una cubeta y agregue algo de esmalte de uñas en los bordes. Coloque cuidadosamente la cubeta sobre esta preparación, evitando la formación de burbujas. La muestra puede observarse inmediatamente al microscopio. Una de las características más sencillas de la anatomía de c Elgan es Alva.

Por ejemplo, una aava con forma de tres de Navidad es característica de la etapa L cuatro. Se puede obtener información detallada sobre la anatomía de c elgan durante el desarrollo en www.orla.org. La tinción con tapis es un procedimiento común para identificar células individuales.

La fijación con el túnel es un método rápido para fijar gusanos. Para la tinción dappy, primero agregue una gota de tampón M nueve sobre la superficie de un portaobjetos. Seleccione algunos gusanos directamente de la placa y transfiéralos a la gota de M nueve.

Elimine el exceso de medio M9 ya sea con una pipeta o con un tejido suave. Añada un túnel a los gusanos. Repita el procedimiento.

Una vez que la primera gota esté seca, añada un poco de medio de montaje con API y la muestra sobrepuesta antes de llevar la preparación al microscopio. El desarrollo del go se puede observar fácilmente en un stent cálido con api.