Un método automatizado para determinar el rendimiento de Drosophila en respuesta a cambios de temperatura en el espacio y el tiempo

Aquí presentamos un protocolo para determinar automáticamente el funcionamiento locomotor de Drosophila en cambios de temperatura con un campo de control de temperatura programable que produce cambios de temperatura rápida y precisa en tiempo y espacio.

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre la respuesta de las moscas a los cambios de temperatura, como las diferencias entre los genotipos, la interacción con otras señales sensoriales o la función de diferentes receptores de temperatura. La principal ventaja de esta técnica es que permite múltiples cambios de temperatura rápidos y precisos controlando el tiempo y el espacio y de forma automatizada. Comience colocando 20 moscas machos y 20 hembras en una botella de cría que contenga 45 mililitros de medio de comida para moscas, y colocando la botella dentro de una incubadora de 25 grados centígrados bajo 12 horas de luz, 12 horas de oscuros ciclos.

Después de 10 días, anestesia las moscas recién cerradas sobre almohadillas de dióxido de carbono durante un máximo de cuatro minutos. Y usa un pincel para recoger moscas vírgenes en viales de cría de mosca de 2,5 por 9,5 centímetros que contienen 6,5 mililitros de medio de comida mosca fresca, separados por sexo en grupos de 20 moscas por vial. A continuación, devuelva los viales a la incubadora durante cinco a siete días.

Para configurar una arena con control de temperatura, encienda la arena y abra el script de fases de temperatura en el ordenador de control. Compruebe que la secuencia de temperatura esté correctamente ajustada y compruebe que la duración de cada fase experimental esté establecida en 60 segundos. En la sección de bloque experimental de inicio, confirme estos ajustes: el número deseado de fases, la configuración iterativa de encendido/apagado de los diodos indicativos emisores de luz roja, el aumento de temperatura de dos grados centígrados por fase y los 16 grados centígrados como temperatura de inicio.

A continuación, ejecute el script de fases de temperatura. El software se inicializará durante cinco segundos y luego se detendrá. Para experimentos de comportamiento de temperatura, coloque una hebra de cinta conductora blanca en la parte superior de las baldosas de cobre de la arena, asegurando que todos los bordes estén cubiertos.

Coloque un anillo de aluminio calentado alrededor de las baldosas de cobre y use un tejido limpio para limpiar la cubierta de vidrio. Coloque la cubierta en la parte superior del anillo de aluminio, dejando un hueco a través del cual se puede soplar una mosca y toque un vial de mosca aclimatada dos veces para forzar las moscas a la parte inferior del vial. Con un aspirador bucal, atrapa una mosca y cierra el vial antes de volver a colocarlo en la incubadora.

Soplar la mosca en la arena a través de la brecha entre la cubierta de vidrio y el anillo de aluminio e inmediatamente empujar el trébol de vidrio para cerrar la brecha. Coloque un marco de luces alrededor de la arena para garantizar la iluminación simétrica y comience a grabar con el programa de grabación de vídeo. A continuación, presione la barra espaciadora del equipo de control para comenzar a ejecutar las fases experimentales.

Para realizar un seguimiento de los vídeos, abra el software de seguimiento de pasos flotantes y abra el archivo de configuración dentro de la carpeta fly tracker. Establezca la ubicación de los vídeos en la carpeta de vídeo y los nombres de los vídeos en los archivos de vídeo. Especifique los bordes de la arena de vuelo en la configuración de la arena en función de las coordenadas de píxeles x/y de varios puntos en el borde de la arena.

Específicamente la ubicación de los LED rojos inactivos en la configuración del LED, en función de las coordenadas de píxel x/y de la ubicación del centro de los LED. Para comprobar la ubicación de los bordes de la arena fly, establezca debug en true en la configuración de la arena, haga clic en guardar y ejecute el script en el terminal. Aparecerá una captura de pantalla del vídeo con un cuadrado azul formado por las coordenadas introducidas en los ajustes de la arena.

A continuación, cambie la depuración en la configuración de arena a false. Haga clic en Guardar y vuelva a ejecutar la pantalla en el terminal para iniciar el proceso de seguimiento. En un experimento típico de comportamiento de temperatura, las moscas individuales expuestas a 16, 20 o 24 grados centígrados exhiben una locomoción más alta al comienzo del experimento, que después de cinco minutos.

La arena controlada por temperatura también se puede utilizar para comparar las respuestas conductuales de la mosca de diferentes orígenes genéticos con los cambios dinámicos de temperatura. Por ejemplo, en este experimento, la velocidad de todas las especies probadas aumentó de acuerdo con sus propias curvas de respuesta a medida que aumentaba la temperatura, hasta llegar a un punto de máximo rendimiento, después de lo cual sus velocidades decayeron y las moscas perecieron. Cuando las moscas individuales fueron expuestas a 40 grados centígrados en el medio y una baldosa lateral, con la otra baldosa lateral en un cómodo 22 grados centígrados, las moscas de tipo salvaje rápidamente dejaron de moverse a lo largo de la arena y permanecen en la ubicación cómoda.

Por el contrario, el clásico mutante de memoria Dunce vuela a explorar la arena y pasa menos tiempo que los controles en la cómoda ubicación. Además, las combinaciones de pruebas de temperatura y ubicación también son útiles para comprender la función de los diferentes receptores de temperatura durante los cambios dinámicos de temperatura. Como se ilustra en este experimento en el que los mutantes individuales d melanogaster fueron expuestos a temperaturas crecientes, mientras que también se proporcionó un lugar cómodo y cambiante a 22 grados centígrados.

Al realizar este procedimiento, recuerde realizar los pasos en orden y rápidamente para que pueda capturar la mayor cantidad de comportamiento de las moscas como sea posible. Junto a este procedimiento se pueden utilizar otros métodos como geotaxis negativa o ensayos de estrangulación térmica para responder preguntas adicionales como dónde se mueven normalmente las moscas o tienen una resistencia al calor normal. Las implicaciones de esta técnica se extienden a nosotros la comprensión de trastornos neurológicos o mutaciones en las que la percepción de la temperatura o el dolor juegan un papel.

Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán porque cada paso es simple por sí mismo, pero se requiere que estén perfectamente coordinados por lo que la técnica necesita ser practicada.