Un método automatizado para determinar el rendimiento de Drosophila en respuesta a cambios de temperatura en el espacio y el tiempo
12 de octubre de 2018
Aquí presentamos un protocolo para determinar automáticamente el funcionamiento locomotor de Drosophila en cambios de temperatura con un campo de control de temperatura programable que produce cambios de temperatura rápida y precisa en tiempo y espacio.
Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave sobre la respuesta de las moscas a los cambios de temperatura, como las diferencias entre los genotipos, la interacción con otras señales sensoriales o la función de diferentes receptores de temperatura. La principal ventaja de esta técnica es que permite múltiples cambios de temperatura rápidos y precisos controlando el tiempo y el espacio y de forma automatizada. Comience colocando 20 moscas machos y 20 hembras en una botella de cría que contenga 45 mililitros de medio de comida para moscas, y colocando la botella dentro de una incubadora de 25 grados centígrados bajo 12 horas de luz, 12 horas de oscuros ciclos.
Después de 10 días, anestesia las moscas recién cerradas sobre almohadillas de dióxido de carbono durante un máximo de cuatro minutos. Y usa un pincel para recoger moscas vírgenes en viales de cría de mosca de 2,5 por 9,5 centímetros que contienen 6,5 mililitros de medio de comida mosca fresca, separados por sexo en grupos de 20 moscas por vial. A continuación, devuelva los viales a la incubadora durante cinco a siete días.
Para configurar una arena con control de temperatura, encienda la arena y abra el script de fases de temperatura en el ordenador de control. Compruebe que la secuencia de temperatura esté correctamente ajustada y compruebe que la duración de cada fase experimental esté establecida en 60 segundos. En la sección de bloque experimental de inicio, confirme estos ajustes: el número deseado de fases, la configuración iterativa de encendido/apagado de los diodos indicativos emisores de luz roja, el aumento de temperatura de dos grados centígrados por fase y los 16 grados centígrados como temperatura de inicio.
A continuación, ejecute el script de fases de temperatura. El software se inicializará durante cinco segundos y luego se detendrá. Para experimentos de comportamiento de temperatura, coloque una hebra de cinta conductora blanca en la parte superior de las baldosas de cobre de la arena, asegurando que todos los bordes estén cubiertos.
Coloque un anillo de aluminio calentado alrededor de las baldosas de cobre y use un tejido limpio para limpiar la cubierta de vidrio. Coloque la cubierta en la parte superior del anillo de aluminio, dejando un hueco a través del cual se puede soplar una mosca y toque un vial de mosca aclimatada dos veces para forzar las moscas a la parte inferior del vial. Con un aspirador bucal, atrapa una mosca y cierra el vial antes de volver a colocarlo en la incubadora.
Soplar la mosca en la arena a través de la brecha entre la cubierta de vidrio y el anillo de aluminio e inmediatamente empujar el trébol de vidrio para cerrar la brecha. Coloque un marco de luces alrededor de la arena para garantizar la iluminación simétrica y comience a grabar con el programa de grabación de vídeo. A continuación, presione la barra espaciadora del equipo de control para comenzar a ejecutar las fases experimentales.
Para realizar un seguimiento de los vídeos, abra el software de seguimiento de pasos flotantes y abra el archivo de configuración dentro de la carpeta fly tracker. Establezca la ubicación de los vídeos en la carpeta de vídeo y los nombres de los vídeos en los archivos de vídeo. Especifique los bordes de la arena de vuelo en la configuración de la arena en función de las coordenadas de píxeles x/y de varios puntos en el borde de la arena.
Específicamente la ubicación de los LED rojos inactivos en la configuración del LED, en función de las coordenadas de píxel x/y de la ubicación del centro de los LED. Para comprobar la ubicación de los bordes de la arena fly, establezca debug en true en la configuración de la arena, haga clic en guardar y ejecute el script en el terminal. Aparecerá una captura de pantalla del vídeo con un cuadrado azul formado por las coordenadas introducidas en los ajustes de la arena.
A continuación, cambie la depuración en la configuración de arena a false. Haga clic en Guardar y vuelva a ejecutar la pantalla en el terminal para iniciar el proceso de seguimiento. En un experimento típico de comportamiento de temperatura, las moscas individuales expuestas a 16, 20 o 24 grados centígrados exhiben una locomoción más alta al comienzo del experimento, que después de cinco minutos.
La arena controlada por temperatura también se puede utilizar para comparar las respuestas conductuales de la mosca de diferentes orígenes genéticos con los cambios dinámicos de temperatura. Por ejemplo, en este experimento, la velocidad de todas las especies probadas aumentó de acuerdo con sus propias curvas de respuesta a medida que aumentaba la temperatura, hasta llegar a un punto de máximo rendimiento, después de lo cual sus velocidades decayeron y las moscas perecieron. Cuando las moscas individuales fueron expuestas a 40 grados centígrados en el medio y una baldosa lateral, con la otra baldosa lateral en un cómodo 22 grados centígrados, las moscas de tipo salvaje rápidamente dejaron de moverse a lo largo de la arena y permanecen en la ubicación cómoda.
Por el contrario, el clásico mutante de memoria Dunce vuela a explorar la arena y pasa menos tiempo que los controles en la cómoda ubicación. Además, las combinaciones de pruebas de temperatura y ubicación también son útiles para comprender la función de los diferentes receptores de temperatura durante los cambios dinámicos de temperatura. Como se ilustra en este experimento en el que los mutantes individuales d melanogaster fueron expuestos a temperaturas crecientes, mientras que también se proporcionó un lugar cómodo y cambiante a 22 grados centígrados.
Al realizar este procedimiento, recuerde realizar los pasos en orden y rápidamente para que pueda capturar la mayor cantidad de comportamiento de las moscas como sea posible. Junto a este procedimiento se pueden utilizar otros métodos como geotaxis negativa o ensayos de estrangulación térmica para responder preguntas adicionales como dónde se mueven normalmente las moscas o tienen una resistencia al calor normal. Las implicaciones de esta técnica se extienden a nosotros la comprensión de trastornos neurológicos o mutaciones en las que la percepción de la temperatura o el dolor juegan un papel.
Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán porque cada paso es simple por sí mismo, pero se requiere que estén perfectamente coordinados por lo que la técnica necesita ser practicada.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para evaluar el desempeño locomotor de Drosophila en respuesta a cambios de temperatura utilizando una arena programable con control de temperatura. El método permite variaciones rápidas y precisas de temperatura, facilitando el estudio de las respuestas de las moscas a cambios ambientales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del comportamiento
- Sensibilidad a la temperatura
Antecedentes
- Drosophila sirve como organismo modelo para estudiar las interacciones genéticas y ambientales.
- Los cambios de temperatura pueden afectar significativamente la actividad locomotora y el comportamiento.
- Comprender estas respuestas puede proporcionar información sobre el procesamiento sensorial y la adaptación.
- Los métodos automatizados mejoran la precisión en las condiciones experimentales.
Objetivo del estudio
- Investigar el rendimiento locomotor de Drosophila a diferentes temperaturas.
- Explorar las diferencias en las respuestas entre diversos genotipos.
- Analizar las interacciones con otras señales sensoriales.
Métodos Utilizados
- Uso de un recinto programable con control de temperatura.
- Colocación de moscas macho y hembra en ambientes controlados.
- Monitoreo de la actividad locomotora bajo condiciones variables de temperatura.
- Recolección automatizada de datos para un análisis preciso.
Resultados principales
- Demuestra la capacidad de cambiar rápidamente las temperaturas y evaluar el comportamiento de las moscas.
- Identificó diferencias significativas en el desempeño locomotor entre diferentes genotipos.
- Mostró interacciones entre las respuestas a la temperatura y las señales sensoriales.
Conclusiones
- Este método proporciona un marco robusto para estudiar la sensibilidad térmica en Drosophila.
- Los hallazgos contribuyen a comprender las influencias genéticas y ambientales sobre el comportamiento.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para aplicaciones más amplias en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la evaluación automatizada y de alto rendimiento del desempeño locomotor dependiente de la temperatura en Drosophila, proporcionando datos fenotípicos cuantitativos para la validación de objetivos en estudios neurogenéticos. Al registrar respuestas conductuales dinámicas a estímulos térmicos controlados espacial y temporalmente, apoya la reducción mecanicista de riesgos en vías de detección de temperatura relevantes para modelos de dolor y trastornos sensoriales. El seguimiento automatizado y el control ambiental reproducible aumentan la confianza predictiva en flujos de trabajo iniciales de descubrimiento que involucran estudios de función génica e interacción con el ambiente.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las contribuciones genéticas a los fenotipos de respuesta térmica, apoyando la validación funcional de genes y vías neuronales implicados en la detección de temperatura.
- Valor operativo: Facilita la comparación directa de cepas mutantes y silvestres bajo condiciones ambientales idénticas y programables para aislar efectos específicos del genotipo.
- Valor predictivo: Genera curvas de rendimiento similares a una relación dosis-respuesta a lo largo de gradientes de temperatura, lo que ayuda a identificar umbrales funcionales y gradientes de gravedad fenotípica para la priorización de objetivos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce resultados locomotores cuantificables (velocidad, preferencia de ubicación) que sirven como lecturas fenotípicas robustas y de alto contenido para la selección de bibliotecas genéticas o moduladores farmacológicos de la sensibilidad térmica.
- Valor operativo: El seguimiento automatizado por video y la estandarización de la arena reducen la variabilidad entre experimentos, permitiendo ensayos escalables y reproducibles adecuados para campañas de cribado de medio a alto rendimiento.
- Preparación del ensayo: Genera métricas conductuales normalizadas que pueden ser comparadas entre genotipos y lotes experimentales, apoyando la validación del ensayo y la reproducibilidad entre laboratorios.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia traslacional: Modela mecanismos de adaptación térmica en ectotermos, aportando información sobre vías conservadas de termosensación neuronal con posible relevancia para dianas de dolor y termorregulación en mamíferos.
- Continuidad preclínica: Permite la evaluación longitudinal de curvas de rendimiento térmico, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo en procesos de validación de dianas mediante el establecimiento de relaciones genotipo-fenotipo-ambiente.
- Reducción de incertidumbre mecanicista: Facilita el análisis de la función de receptores térmicos mediante perfiles térmicos espaciales y temporales, reduciendo la ambigüedad al vincular lesiones genéticas con déficits en el procesamiento sensorial.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se enmarca en la fase inicial del descubrimiento, vinculando la perturbación genética con una salida conductual cuantificable en un contexto ambiental controlado, apoyando así los esfuerzos de validación de objetivos guiados por hipótesis y la identificación de compuestos prometedores en la investigación neuroconductual.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la interrogación sistemática de la función de genes sensoriales de temperatura mediante la correlación del fondo genético con respuestas locomotoras dinámicas a estímulos térmicos controlados.
- Tamizaje: Proporciona lecturas conductuales cuantitativas y estandarizadas (por ejemplo, velocidad, preferencia espacial) que permiten un tamizaje fiable de compuestos o genotipos en vías sensibles a la temperatura.
- Análisis: Genera conjuntos de datos conductuales resueltos en función del tiempo y la temperatura, adecuados para la comparación estadística de curvas de desempeño, umbrales térmicos similares a EC50 y métricas de área bajo la curva entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos de respuesta térmica en Drosophila con mecanismos conservados de transducción sensorial, aportando información para la validación cruzada de especies de dianas en la investigación de termosensación y dolor.
- Reutilización Empresarial: La arena automatizada y la canalización de seguimiento representan una plataforma reutilizable para estudiar interacciones gen-ambiente en múltiples modalidades sensoriales más allá de la termosensación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona claridad mecanicista sobre los circuitos neuronales de detección de temperatura al permitir un desafío térmico espaciotemporalmente preciso y la cuantificación automatizada del comportamiento.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante un control estandarizado del entorno, la adquisición automatizada de datos y la reducción del manejo manual, minimizando la variabilidad dependiente del operador.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos fenotípicos objetivos y cuantitativos que reducen la dependencia de puntuaciones conductuales subjetivas en cribados neurogenéticos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de objetivos estratificados por riesgo al vincular lesiones genéticas con déficits medibles en el desempeño térmico, facilitando la identificación temprana de objetivos terapéuticos de alta confianza.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, diseño de ensayos conductuales y configuración de software de seguimiento basado en video.
- Depende de hardware de arena con control de temperatura, iluminación sincronizada y sistemas de grabación de video para capturar con precisión datos ambientales y conductuales.
- Necesita la estandarización entre equipos de la calibración de la arena, los parámetros de seguimiento y las definiciones de protocolos térmicos para garantizar la reproducibilidad entre sitios o usuarios.
- La adaptación a otros modelos de insectos o estímulos sensoriales puede requerir la recalibración de las dimensiones de la arena, los umbrales de seguimiento y las tasas de aumento térmico, según el tamaño específico de la especie y la cinética de respuesta.
- Las limitaciones prácticas incluyen restricciones en la capacidad de procesamiento de la arena (una mosca por ensayo) y la necesidad de una coordinación meticulosa de los procedimientos para mantener el alineamiento temporal entre los cambios térmicos y el registro conductual.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
