Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila

Este método se puede utilizar para abordar una cuestión clave en el campo de la somatosensación, el mecanismo por el cual un animal, como Drosophila melanogaster, selecciona su temperatura ambiental preferida. La principal ventaja de esta técnica es que puede establecer la temperatura preferida del grupo de larvas en un solo ensayo cuando se enfrenta a un rango continuo de temperaturas. Además de proporcionar información sobre las preferencias de temperatura de las larvas de Drosophila, la placa de impresión también se puede adaptar para su uso con otros organismos modelo, como el gusano C. elegans.

Primero, haga pasta de levadura para preparar viales para una cruz. Mezcle los gránulos de levadura en agua destilada y muélalos hasta convertirlos en una pasta con un mortero. Luego, agregue un poco de pasta de levadura cerca de las paredes internas de los viales estándar de Drosophila justo por encima de la superficie del alimento.

Para producir las larvas, recoja de 12 a 35 hembras y hasta la mitad de machos, pero no más de 10 machos. Combine estos grupos en el vial que contiene pasta de levadura. Cargue los viales preparados en una bandeja de 100 viales.

Incluya 20 viales abiertos cargados de agua en la bandeja para proporcionar humedad. Luego, selle la bandeja en una bolsa de plástico transparente e incube a 25 grados centígrados durante 48 horas. Después de 48 horas de alimentación y apareamiento, transfiera las moscas a nuevos viales de comida para recolectar los huevos.

Tócalos. No utilice dióxido de carbono. Luego, deje que las moscas pongan huevos durante tres horas a 25 grados centígrados.

Más tarde, retire los adultos y vuelva a colocar los viales que contienen los huevos en la bandeja con viales de agua y cierre la bolsa. Luego, desarrolle los huevos a 25 grados centígrados hasta la etapa larvaria deseada. Para preparar un solo gradiente direccional, primero cree un entorno ambiental humano para el ensayo.

Coloque dos bloques de aluminio conectados a baños de agua separados sobre toallas de papel húmedas, a 10 centímetros de distancia. Los baños de agua deben calentarse con anticipación. A continuación, prepare 100 mililitros de agarosa al 1% y agregue 25 mililitros a cada placa de ensayo sobre una superficie nivelada.

Una vez que la agarosa se haya solidificado, frote suavemente la superficie con una esponja de melamina para que la superficie quede ligeramente áspera. Luego, para promover una transferencia de temperatura eficiente, llene los espacios entre los bloques de aluminio en las placas de ensayo con agua suministrada de una botella rociadora. Ahora, coloque las placas de ensayo en los bloques de aluminio y asegúrese de que las demarcaciones estén a dos centímetros de cada borde para que coincidan exactamente con los bordes de los bloques de aluminio.

A continuación, rocíe una película de agua sobre la superficie de las placas para que los geles no se sequen. A continuación, cubra el sistema con una caja de cartón para reducir la evaporación y ayudar a estabilizar la temperatura de la superficie del gel. Espere de cinco a 10 minutos para permitir que la temperatura se equilibre.

Luego, verifique la temperatura de la superficie de la placa en al menos 12 lugares para asegurarse de que haya una temperatura uniforme en todo momento, más o menos dos grados centígrados. A continuación, vuelva a colocar la tapa de la caja hasta que se realice el ensayo. Para aislar las larvas limpias, primero agregue unos 40 mililitros de solución de sacarosa al 18% a un tubo de ensayo de 50 mililitros.

Luego, transfiera las larvas de las pilas de comida a la solución, usando una cucharada. A continuación, mezcle bien las larvas en la solución, utilizando la cuchara. Ahora, espere de 30 a 60 segundos para que las larvas floten hasta la capa superior del tubo.

A continuación, vierta la solución con las larvas en otro tubo de 50 mililitros y cúbralo con sacarosa fresca al 18%. Nuevamente, espere a que las larvas floten. La presencia de alimentos puede influir en los resultados.

Por lo tanto, para obtener resultados reproducibles, es importante limpiar las larvas a fondo para minimizar la contaminación con alimentos. Hazlo con cuidado, para evitar daños a las larvas. A continuación, coloque un colador de células de 300 micras encima de un tubo de 50 mililitros, luego retire los cuerpos adultos muertos y los desechos flotantes de la superficie de la solución de sacarosa.

Ahora, vierta las larvas a través del colador para recogerlas en la pantalla de malla. Luego, deje correr unos 50 mililitros de agua a través del colador dos veces para limpiar aún más las larvas. Luego, en un plato vacío de 35 milímetros, enjuague la mayoría de las larvas del colador con agua.

Use un pincel para transferir las larvas restantes en la malla. A continuación, extrae la mayor parte del agua del plato con una micropipeta. A continuación, coloque la tapa del plato al revés para que las larvas no puedan escapar.

Ahora, deje que las larvas se recuperen durante 10 a 20 minutos antes de iniciar el ensayo. Primero, retire la caja de cartón sobre el gel y verifique rápidamente la temperatura de la superficie del gel. Si la superficie está seca, rocíe una pequeña cantidad de agua sobre la superficie.

Si el gel es bueno, cargue de 100 a 200 larvas en el centro de cada plato, usando un pincel pequeño. A continuación, coloque una tapa sobre cada placa de ensayo para atrapar las larvas y cubra la instalación con una caja de cartón para evitar la exposición a la luz. El ensayo está ahora en curso.

Después de 10 a 30 minutos, retire la caja de cartón y la tapa de la microplaca. Luego, fotografíe las placas desde arriba para registrar la posición de las larvas. Coloque la caja encima de la cámara para evitar reflejos en la superficie del gel.

Para limpiar el plato, aspire todas las larvas donde sea que se hayan dispersado. Ahora, calcule la distribución porcentual de las larvas en cada zona, utilizando un software de análisis de imágenes. Haga líneas cada dos centímetros, según las demarcaciones en la placa de ensayo y cuente el número de larvas en cada zona.

Al contar, ignore las larvas distribuidas en crestas a 0,5 centímetros de cada borde, ya que el espesor del gel y las condiciones de temperatura no son uniformes cerca del borde. En 18 grados Celsius a 28 grados Celsius, se realizó un gradiente unidireccional utilizando baños de agua ajustados a 16,8 grados Celsius y 31 grados Celsius. Se encontró que la distribución de la temperatura a lo largo del gradiente era casi lineal.

Las larvas de control se ensayaron a varias edades. Las larvas de primer, segundo y tercer estadio mostraron preferencias máximas para la zona de 24 grados centígrados. Durante el tercer estadio, la mayoría de las larvas se acumularon en la zona de 18 grados centígrados.

Las larvas del tercer estadio tardío que no deambulaban estaban agrupadas en la zona de 18 grados centígrados. La proclividad a acumularse en la zona de 18 grados centígrados en la cepa control, que fue White 1118, no se debió a un efecto de borde, ya que las larvas del tercer estadio tardío aún se acumularon en la zona de 18 grados centígrados, utilizando un gradiente bidireccional. Cuando analizamos las mutaciones necesarias para discriminar la temperatura de las larvas en el tercer estadio, los resultados cambiaron.

Las larvas con una mutación nula en trpA1 se distribuyeron uniformemente en todo el gradiente de 18 grados Celsius a 28 grados Celsius. Las larvas a las que les faltaban solo las isoformas A y B o las isoformas C y D de trpA1 también mostraron alteraciones graves. Las larvas con una mutación en uno de los dos genes que codifican la fosfolipasa c beta, norpA, también fueron alteradas.

Sin embargo, las larvas con una mutación en un gen que codifica la otra fosfolipasa c beta, plc21c, se comportaron normalmente. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara sobre cómo obtener resultados reproducibles utilizando un gradiente térmico continuo, lo que le permitirá comparar las preferencias de temperatura de las larvas de Drosophila de tipo salvaje y mutantes. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos para un solo ensayo.

Al intentar este procedimiento, es importante prestar atención a la condición de los viales de mosca y no usar las larvas si están secas. Esta técnica simplifica el descubrimiento de nuevos genes requeridos por las larvas de Drosophila para seleccionar su temperatura favorita en el rango cómodo.