Name: Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende a determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila melanogaster mediante un ensayo de gradiente de temperatura continuo. Este método robusto permite evaluar la somatosensación y comportamiento térmico en neurociencia.

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<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para asegurar el éxito de este protocolo, es importante que tome medidas para obtener el número suficiente de larvas para realizar los experimentos. Estos incluyen la alimentación de las moscas en viales que contienen pasta de levadura para 2-3 d mejorar la puesta de huevos. Los viales necesitan ser colocados en una bandeja que contiene frascos de agua y dentro de una bolsa de plástico transparente, que mantiene la humedad de los alimentos y promueve la efectiva de alimentación por las larvas permitiendo la exposición a ...

Thermotaxis es empleado por los animales móviles para seleccionar un entorno con las condiciones más favorables1,2,3. Si el clima es excesivamente frío o caliente, este comportamiento es vital para la supervivencia. Además, muchos animales son sensibles a diferencias muy pequeñas de temperatura en la gama cómoda y buscan un entorno con una temperatura ideal. Esto es de particular importancia para los organismos poiquilotérmicas como moscas de la fruta, que equilibre su temperatura corporal con el medio ambiente. Ensayos para controlar larvas thermotaxis han sido instrumentales en identificar y clarificar las funciones de sensores moleculares tales como Drosophila potencial Receptor transitorio (TRP) canales4,5,6, rodopsinas7,8e ionotrópicos del receptor receptores (IRs)9, que dotan a estos animales con sensibilidad de temperatura sobre rangos de temperaturas diferentes.
Una prueba de selección bidireccional proporciona un método para estudiar las preferencias térmicas en larvas6,7. El ensayo consiste en establecer dos zonas de distinta temperatura y permite a los animales seleccionar un lado sobre el otro. Los resultados de pruebas de dos vías de elección pueden ser sólidos, especialmente si son grandes las diferencias de temperatura entre las dos opciones. Además, puesto que cada ensayo implica tabular sólo dos grupos, los datos pueden expresarse como un índice simple preferencia. La facilidad y sencillez de los análisis de dos vías de elección son también susceptibles a las pantallas de la genéticas. Sin embargo, una limitación importante es que muchos experimentos se necesitan para establecer la temperatura preferida de los animales de tipo silvestre o mutantes.
Un análisis de gradiente ofrece la oportunidad de establecer la temperatura preferida en un solo análisis8. Además, a diferencia de la prueba de selección bidireccional, permite la evaluación de la distribución de un grupo de animales, cuando se enfrentan a un rango continuo de temperaturas. Un análisis de gradiente utiliza una placa de Petri y solos animales y es adecuado para caracterizar el comportamiento detallado de animales individuales10. Sin embargo, desde platos de Petri son redondos, los tamaños de las zonas de temperatura varían y son progresivamente más pequeños dependiendo de la distancia desde el centro. Por lo tanto, esta configuración no es ideal para el monitoreo de las selecciones de temperatura de las poblaciones de animales.
Un aparato de gradiente térmico continuo que es adecuado para evaluar las preferencias de la temperatura de los grupos de larvas emplea una arena rectangular y se describe aquí. El aparato es fácil de construir y montar. Además, el gradiente es lineal y es flexible, ya que puede ser utilizado evaluar thermotaxis sobre grandes temperatura oscila entre 10 ° C a 42 ° C. El ensayo es rápido y sencillo de realizar y da datos reproducibles. Además de reportar la temperatura favorecida de larvas, revela las preferencias de la población de animales sobre toda una gama linear en un solo experimento. Debido a estas ventajas, es una excelente opción para la identificación de genes necesarios para thermotaxis.

<table><tbody><tr><td><Aparato > ensayo de gradiente fuerte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Baño de circulación refrigerado/calefactado de 6 L</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Este modelo está descatalogado. Los modelos de reemplazo actualizados incluyen: 1186R00 y 1197U04 para 120 V, 60 Hz, o 1184L08 y 1197U04 para 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Placa de ensayo de aluminio (para gradiente direccional simple)</td><td></td><td></td><td>Tamaño exterior: 14 x 10,1 x 0,9 cm, tamaño interior: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizado negro.</td></tr><tr><td>Placa de aluminio (para degradado bidireccional)</td><td></td><td></td> <td>25 x 22 x 0,2 cm, anodizado negro.</td></tr><tr><td>Bloque</td><td></td><td></td><td>de aluminio Tamaño exterior: 25,5 x 5 x 1,4 cm, los parámetros de los canales internos se muestran en la Figura 1D.</td></tr><tr><td>Conector para bloques y tubos de aluminio</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubo de silicona sanitaria</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16"</td></tr> <tr><td>paredName</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Artículos y reactivos para ensayo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mortle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Mortero para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td>Termopar</td><td>Fluke</td><td>K tipo</td><td></td>K</tr><tr>Tapa universal de<td>microplaca</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 35 mm</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de etiquetado (para gradiente bidireccional)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Cinta de etiquetado Fisherbrand 2 pulgadas x 14 yardas</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Prepare la solución al 1%</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389-5KG</td><td>Prepare la solución al 18% justo antes de comenzar el ensayo</td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de</td> <td>50 mLDenville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>500 mL frasco redondo de boca ancha</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células (poro de 300 mm)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Artículo opcional para el lavado de larvas</td></tr><tr><td>Caja de cartón (bandeja de viales)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Drosophila alimentos</fuerte></td>Agua destilada 22,400 mL Harina de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>maíz, amarilla (malla extrafina, flocada) 20 kg LabScientific Inc.<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>NC0535320</td><td>1,609 g</td></tr><tr><td>Levadura de cerveza 100 lbs</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; Harina de soja (10 kg/unidad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Agar, Tipo II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>Karo jarabe de maíz ligero Karo</td><td></td><td></td><td>1.700 mL</td></tr><tr><td>4-hidroxibenzoato de metilo (suspender en etanol de 200 grados)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Puris de ácido propiónico. p.a.,>99.5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Ácido fosfórico&nbsp; Reactivo ACS, &ge; 85 % en peso en H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8.5 mL</td></tr></tbody></table>

un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de drosophila

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Muchos animales, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, son capaces de discriminantes diferencias minutos en temperatura ambiente, que les permite buscar su paisaje termal preferido. Para definir las preferencias de la temperatura de las larvas sobre un rango lineal definido, hemos desarrollado un ensayo utilizando un gradiente de temperatura. Para establecer un gradiente solo bidireccional, dos bloques de aluminio están conectados con baños independientes, cada una de ellas controla la temperatura de bloques individuales. Los dos bloques establece los límites inferiores y superiores del gradiente. El gradiente de temperatura se establece mediante la colocación de una placa de aluminio recubierto de agarosa sobre los dos bloques de agua controlada para que la placa extiende la distancia entre ellos. Los extremos de la placa de aluminio que se encuentra en la parte superior de los bloques de agua define las temperaturas mínimas y máximas, y las regiones entre los dos bloques forman un gradiente lineal de la temperatura. El análisis de gradiente puede ser aplicado a las larvas de diferentes edades y puede ser usado para identificar a mutantes que exhiben fenotipos, como aquellas con mutaciones que afectan a genes que codifican los canales TRP y opsins, que se requieren para la discriminación de temperatura.

Para establecer un solo-direccionales de 18 ° C - 28 ° C gradiente, fijamos las temperaturas de los dos baños de agua a 16,8 ° C y 31 ° C. Obtenemos las temperaturas a 13 puntos por la medición de la temperatura en 26 posiciones dentro de las porciones superiores e inferiores de todas las 6 zonas, las líneas de frontera entre las zonas y en los extremos de la superficie del gel de agarosa (figura 2, 2E). La distribución de temperaturas a lo l...

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la temperatura ambiente preferida de larvas de Drosophila usando un gradiente térmico continuo.

Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Este método se puede utilizar para abordar una cuestión clave en el campo de la somatosensación, el mecanismo por el cual un animal, como Drosophila melanogaster, selecciona su temperatura ambiental preferida. La principal ventaja de esta técnica es que puede establecer la temperatura preferida del grupo de larvas en un solo ensayo cuando se enfrenta a un rango continuo de temperaturas. Además de proporcionar información sobre las preferencias de temperatura de las larvas de Drosophila, la placa de impresión también se puede adaptar para su uso con otros organismos modelo, como el gusano C. elegans.Primero, haga pasta de levadura para preparar viales para una cruz. Mezcle los gránulos de levadura en agua destilada y muélalos hasta convertirlos en una pasta con un mortero. Luego, agregue un poco de pasta de levadura cerca de las paredes internas de los viales estándar de Drosophila justo por encima de la superficie del alimento.Para producir las larvas, recoja de 12 a 35 hembras y hasta la mitad de machos, pero no más de 10 machos. Combine estos grupos en el vial que contiene pasta de levadura. Cargue los viales preparados en una bandeja de 100 viales.Incluya 20 viales abiertos carg

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este artículo, nos demuestran los ensayos para estudiar la nocicepción térmica...

Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Este video describe el ensayo de preferencia gustativa, un método conductual utilizado para medir la atracción o evitación hacia soluciones coloreadas que tienen un sabor diferente al evaluar la coloración abdominal de la mosca después de la ingestión de la sustancia preferida. El protocolo presentado demuestra el procedimiento utilizado para medir la preferencia de las moscas hacia soluciones de diferentes concentraciones de sacarosa.

Ensayo de preferencia gustativa: un método para medir el comportamiento alimentario en Drosophila

Las larvas de Drosophila tienen neuronas sensoriales dedicadas, nociceptores, cuya respuesta a estímulos térmicos potencialmente dañinos desencadena comportamientos aversivos, o los llamados "nocifensivos", en el animal. Este video describe un método para evaluar la nocicepción térmica mediante el registro del comportamiento de las larvas en respuesta a la aplicación local de una sonda de calor en la cutícula. Por lo tanto, este método se denomina ensayo de sonda de calor local.

Ensayo de sonda de calor local: un método para evaluar la nocicepción de altas temperaturas en larvas de Drosophila

Las moscas de la fruta Drosophila pueden distinguir pequeños cambios de temperatura y, por lo tanto, seleccionar ambientes con condiciones térmicas favorables. Este video describe un ensayo de comportamiento que prueba la preferencia de temperatura de las larvas de Drosophila en un gradiente térmico lineal.

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Aprende a determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila melanogaster mediante un ensayo de gradiente de temperatura continuo. Este método robusto permite evaluar la somatosensación y comportamiento térmico en neurociencia.

Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila

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