Name: Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprende a generar ARN genómico del virus de la hepatitis C y transfectar células para establecer un sistema de cultivo infeccioso. Este protocolo permite estudiar el ciclo de replicación viral mediante PCR, Western blot e inmunofluorescencia.

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Agradecemos a F. Chisari por proporcionar la línea celular Huh-7.5.1. Nos gustaría agradecer a Justine Ho por editar el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Premio de Investigación Programática Institucional del Centro Médico Cedars-Sinai y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, Subvención UL1TR000124 a V.A.

Un esquema general del protocolo se ilustra en la Figura 1. 1. Las células <ol><li> Preparar medio de crecimiento completo que contiene suero de 10-15% de bovino fetal (FBS), 10 mM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), y 2 mM de L-glutamina. </li><li> Mantener Huh-7.5.1 células 13 en medio de crecimiento completo que contienen los suplementos anteriores para el análisis in vitro de la hepatitis C ciclo de replicación viral. </li><li> Cepas virales Cultura en Huh-7.5.1 células con el medio de cultivo complementado especificada a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol> 2. Virus y Construcciones de plásmidos <ol><li> Generar la forma complementaria de ADN (ADNc) del ARN del VHC y clonar en un vector plásmido para la facilidad de manipulación genética. Nota: El descubrimiento de los japoneses hepatitis fulminante 1, JFH-1 (genotipo 2a HCV), aísle ha sido fundamental para la investigación y el VHC esutilizado principalmente para estudiar el ciclo de 11-13 replicación del VHC. Virus quiméricos inter e intragenotypic basados ​​en JFH-1 del VHC se utilizan comúnmente en la investigación 14-18. Construcción de intragenotype 2a sintética virus quimérico, FNX-VHC, y una cepa reportera quimérico monocistronic fue descrito previamente 19 y los detalles de construcción están más allá del alcance de este protocolo. </li><li> Utilice el virus intragenotype 2a pFNX-VHC, ya que contiene una NTR 5 &#39;, regiones y P7 estructurales, y parte de las regiones no estructurales NS2 (nucleótidos 1 hasta 2878) de la cepa parental J6CF (NCBI n º de acceso. AF177036), como así como los componentes no estructurales de la JFH-1 cepa viral (NCBI n º de acceso. AB047639). Nota: FNX-VHC se sintetizó basándose en la secuencia de Jc1 intragenotype 2a VHC quimérico se informó anteriormente 15. </li><li> Generar un constructo monocistrónico quimérico reportero viral, el pFNX-Rluc, basado en la cepa pFNX-VHC (antes en la etapa 2.2) mediante la inserción de un Rgen de la luciferasa enilla entre el 5 &#39;NTR y el gen del núcleo (entre nt 388 y 389). Posteriormente, conecte el gen de la luciferasa y el gen del núcleo de esta construcción usando un 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A) secuencia del péptido, que funcionaría como una señal de la escisión. </li><li> Ingeniero de la ARN polimerasa nulo (Pol-) construcción viral utilizando el pFNX-VHC o el fondo viral pFNX-Rluc. Reemplazar los residuos catalíticos de la polimerasa NS5B, GDD (aa 2759-2761; nt 8615 a 8.623), de cualquiera de estas cadenas principales virales con residuos de aminoácidos de la AAG. </li></ol> 3. In vitro el ARN del VHC Transcripción <ol><li> Utilice un intragenotype 2a quimérico virus FNX-HCV y nulo Pol FNX-HCV (Pol-) HCV para la evaluación de la replicación viral (Figura 2A). </li><li> Linealice los plásmidos virales con la enzima de restricción XbaI y después tratar con nucleasa de judía mung para generar extremos romos. Purifica los plásmidos digeridos por cromatografía de intercambio de aniones. Verificar la integridad of el plásmido linealizado de ADN sometiendo a electroforesis en gel de agarosa (Figura 2B). </li><li> Transcribir los plásmidos virales linealizadas utilizando la T7 ARN polimerasa. </li><li> Se purifica el ARN tratado con DNasa recién sintetizado usando un kit de purificación de ARN. </li><li> Verifique la producción de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2C). </li><li> Cuantificar el RNA por espectrofotometría. </li><li> Almacenar el ARN generados en -80 ° C en 10 g alícuotas de trabajo. Nota: Para minimizar la variación de la calidad del ARN dentro de cada diseño experimental por la transcripción de todos los ARN para cada muestra viral y de control al mismo tiempo. </li></ol> 4. VHC ARN transfección y toma de muestras <ol><li> Recoger las células Huh-7.5.1 usando tripsina. </li><li> Para enjuagar las células, centrifugar y resuspender la suspensión dos veces con los medios de comunicación en frío bajo suero. Resuspender las células en medios de baja de suero con 1 x 10 7 células por ml. </li><li> Mezclar con un total de 10 &amp; #956; g de ARN viral transcrito con 400 l de células resuspendidas (4 x 10 6 células) en una cubeta de electroporación de 0,4-cm. Transfectar las células mediante electroporación a 270 V, 100 Ω y 950 mF. </li><li> Resuspender las células a electroporación en 10 ml de medio de crecimiento completo con 15% de FBS. Nota: El aumento de la supervivencia de las células sometidas a electroporación se observa cuando las células Huh-7.5.1 se cultivaron en 15% suero bovino fetal. </li><li> Placa de las células en los dos matraces T-25 (~ 1,2 x 10 6 células por matraz) y las placas de 48 pocillos (1 x 10 4 células por pocillo) para cada uno de los siguientes puntos de tiempo: 4, 48 y 96 h. </li><li> Reemplazar los medios de comunicación a 4-8 h después de la transfección con medio de crecimiento suplementado fresco con 10% de FBS para eliminar los residuos de células muertas de los matraces y placas de cultivo. </li><li> Sobrenadantes de cultivo celular de cosecha en los 48, 96 puntos de tiempo hr y eliminar los desechos celulares de las muestras recogidas por centrifugación de las células a 1.500 rpm durante 10 min a 4 º C. </li><li> Almacene los sobrenadantes libres de células a -80 º C. Lisar las células para la proteína y el análisis por Western blot de ARN y la transcripción inversa-PCR cuantitativa en los puntos de tiempo indicados. </li></ol> 5. Transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR) para la evaluación de las copias del VHC Genoma <ol><li> Realice una de dos etapa de RT-qPCR para determinar el número de copias de ARN genómico del VHC. </li><li> Transcribir inversamente 1 g de ARN celular total utilizando la transcriptasa inversa y un cebador específico para el VHC cadena con sentido que se une a NTR 5 &#39;(JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;) o un cebador específico para el gen de mantenimiento peptidilprolil isomerasa G (R ppig : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). También transcribir inversamente FNX-HCV RNA (generado en el paso 3) de copias del genoma conocidos (enero 10-09 10 estándar), utilizando el sentido del VHC primer capítulo. </li><li> Llevar a cabo qPCR utilizando 50 ng del ADNc transcrito resultante utilizando cebadores específicos de HCV (JFH RTQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) y el ADN vinculante tinte verde que contiene qPCR súper mezcla. Realice qPCR para la limpieza gen ppig también (cebadores ppig F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; ppig R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) Nota: Para calcular el nivel de ARN del VHC intracelular exacta a través de muestras, utilice gen de mantenimiento celular, ppig , el nivel de expresión (ciclo Ct) para la normalización. Utilice el número de copias del genoma FNX-VHC como el estándar para la determinación del número de copias. </li><li> Utilice las siguientes condiciones cuando se ejecuta qPCR para determinar el número de copias de ARN del VHC: 95 º C durante 15 segundos y 60 &#160; º C durante 30 segundos (40 ciclos) usando el sistema de PCR en tiempo real. </li><li> Véanse las Figuras 3A y 3B para resultados replicación del genoma. </li></ol> 6. Análisis Western Blot para detectar la expresión de proteínas del VHC (Figura 3C) <ol><li> Utilice lisados ​​de células FRARN viral om transfectadas a 96 h después de la transfección de proteínas análisis Western Blot. </li><li> Resolver el lisado celular utilizando SDS-PAGE y transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF). </li><li> Bloquear la membrana utilizando una solución de bloqueo que contiene leche desnatada 5%, 0,2% de Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo primario monoclonal de ratón NS3 (1 en 1000 de dilución) y beta-actina (1 en 5000 de dilución). </li><li> Añadir IgG de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (1 en 5000 de dilución) y detectar por quimioluminiscencia. </li></ol> 7. Ensayo de inmunofluorescencia (IFA) <ol><li> Fijar las células infectadas con el VHC y se transfectaron usando metanol durante 30 min a -20 º C para el ensayo de inmunofluorescencia. </li><li> Lavar la célula con PBS tres veces y bloquear con tampón de bloqueo IFA. </li><li> Utilice conejo policlonal anti-NS5A principalmente anticuerpo (amablemente proporcionados por el doctor Dasgupta, UCLA) o monoclonales de ratón anti-DSRNA J2 anticuerpo a una dilución de 1:200 (1 mg / ml) y se incuba durante 5 horas a la noche a 4 º C. </li><li> Lavar las células con PBS tres veces después de que el anticuerpo primario. </li><li> Añadir cabra anti-IgG de conejo-488 anticuerpo secundario policlonal o anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-594 anticuerpo secundario policlonal a una dilución 1:1.000 (1 g / ml) e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células con PBS tres veces y núcleos de tinción utilizando colorante Hoechst y vista con microscopio de fluorescencia (Figura 3D). </li></ol> 8. Titulación de medición Virus <ol><li> Ingenuos células Plate Huh-7.5.1 en aproximadamente 3 x 10 3 células / pocillo utilizando una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, realizar diluciones seriadas de 10 veces de sobrenadante de cultivo libre de células recolectadas a partir de células transfectadas de ARN del VHC utilizando medio de cultivo e inocular por triplicado en Huh-7.5.1 células. </li><li> Fijar las células a las 72 horas después de la infección usando metanol (durante 30 min a -20 </sup&gt; º C) y la inmunotinción de la proteína NS5A del VHC como se indica en la sección 7. </li><li> Utilice la dilución más alta que contar para los focos NS5A positivo y calcular el número medio de foco unidad de formación (UFF) por mililitro. Consulte la Figura 4 para el título del VHC. </li></ol> 9. Renilla Luciferase reportero de ensayo para el genoma viral de replicación e infectividad <ol><li> Para la evaluación de la replicación del genoma viral, Huh-7.5.1 células de ARN-VHC a electroporación placa por triplicado en placas de 48 pocillos (1 x 10 4 células / pocillo). </li><li> Lyse las células con 75 l de tampón de lisis pasiva al 6 horas, 48 ​​horas y 96 horas después de la transfección. </li><li> Rock the placas suavemente durante 15 minutos a temperatura ambiente y se almacena a -80 º C. </li><li> Para medir la actividad enzimática de luciferasa de Renilla, descongelar el lisado de proteínas y la luciferasa de Renilla reactivos de ensayo a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 20 l de lisado de proteína por pocillo de una 96-WEL<html> l placa luminiscencia blanca y coloque la placa en un luminómetro. </li><li> Vierta 100 l de Renilla luciferasa reactivo de ensayo (sustrato coelenterazina + buffer) por pozo y después de un retraso de 2 segundos antes de la lectura; integrar la luz emitida por 10 seg. </li><li> Calcular la media y la desviación estándar para cada muestra a partir de los valores de luciferasa de triplicados biológicos y someter los datos a análisis estadístico (Figura 5). </li><li> Para evaluar la infectividad, inocular 500 l de sobrenadante libre de células obtenidas a partir de células de ARN-VHC transfectadas para el tiempo indicado puntos (48 hy 96 h), por triplicado, en células de los animales Huh-7.5.1 en placas de 48 pocillos. </li><li> Vuelva a colocar el inóculo viral con 500 l de medio fresco por pocillo después de las 6 horas después de la infección. </li><li> Lisar las células en 48 horas después de la infección y sujetos a ensayo de luciferasa de Renilla tal como se describe en los pasos 8.2 a 8.7 (figura 5). </li></ol>í tulo &quot;&gt; 10. Análisis estadístico <ol><li> Las barras de error en los gráficos indican las desviaciones estándar (DE). Los valores de p se calcularon por el test t no apareado. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta ilustración describe un método para analizar el ciclo de replicación de la hepatitis C virus. HCV es un patógeno humano y el protocolo de bioseguridad prescritas tendrá que ser seguido estrictamente. Sistemas de cultivo celular de VHC infecciosas se han descrito anteriormente 11-13,16,17. Hay algunos puntos cruciales que implementamos cuando se sigue el protocolo ilustrado. En primer lugar, es de gran importancia para tener una buena calidad de intacta longitud viral ARN genómico completo para estudios p...

Virus de Hepatitis C (VHC) causa la cirrosis y cáncer de hígado. Afecta a 170 millones de personas en todo el mundo, con 350.000 personas que mueren cada año 1-3. El VHC es un virus ARN de cadena positiva con un tamaño de genoma de 9,6 kb. El genoma del HCV se traduce como una sola poliproteína de ~ 3.000 residuos de aminoácidos que se escinde proteolíticamente por diversas proteasas celulares y virales en 10 polipéptidos. VHC es el virus prototipo del género Hepacivirus y pertenece a la familia Flaviviridae 4. Tras la exposición, el VHC establece la infección crónica en el 80% de los individuos. La infección generalmente es asintomática y oportuno diagnóstico puede permitir la intervención terapéutica para evitar el deterioro del hígado. El tratamiento actual es subóptimo y no se dispone de vacuna 5,6. La etiología de la hepatitis C fue descrita por primera vez en 1989 7. Estudiar la replicación del VHC es importante para la vacuna contra la hepatitis C y la investigación del tratamiento, pero había sidolargo obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo viral eficiente. Un clon molecular del VHC ha demostrado ser infecciosa en los chimpancés a la inoculación intrahepática 8. Posteriormente, replicones del VHC sub-genómicas se describen, lo que permitió a diseccionar la etapa de la replicación del genoma viral en un 9,10 sistema de cultivo celular. El descubrimiento de un VHC genotipo 2 bis aislar JFH-1 (hepatitis fulminante-1 japonés), capaz de infectar un cultivo celular abierto nuevas vías para la investigación la replicación del VHC 11-13. Cepa del genotipo 2 bis JFH-1 basada virus quiméricos inter e intra-genotípica y el genotipo 1 del VHC sistemas de cultivo basados ​​infecciosas son disponibles también 14-18. Hemos utilizado con éxito JFH-1 cepa y VHC intragenotype 2a virus quimérico obtener el mapa de alta resolución del perfil funcional de los dominios de la proteína y cis-elementos que actúan de ARN 19,20. De acuerdo con esto, aquí se describe un sistema de cultivo eficaz utilizado rutinariamente que permiteel estudio de las diversas etapas del ciclo de replicación del VHC y la interacción huésped-patógeno. Presentamos los ensayos virológicos para evaluar la replicación del genoma viral y la infectividad de novo de intragenotype VHC 2a y un reportero de VHC basado en la luciferasa de Renilla.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácido no esencial</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medio de suero reducido, sin fenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td>El Instituto <td></td><td>de Investigación Scripps</td><td>La línea celular fue amablemente proporcionada por el Dr. Francis Chisari al Dr. Arumugaswami en virtud de la MTA ejecutada entre el Instituto de Investigación Scripps y el Centro Médico Cedars-Sinai</td></tr><tr><td>Plásmidos (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc y pFNX-Rluc Pol null)&nbsp;</td>Centro <td></td><td>Médico Cedars-Sinai</td><td>Los plásmidos del VHC fueron sintetizados por el Dr. Arumugaswami utilizando oligonucleótidos superpuestos.</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasa de frijol mungo</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express Sistema de producción de ARN a gran escala</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total</td><td>System Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal anti-dsRNA de ratón J2&nbsp;</td><td>Inglés & Consultoría Científica Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Paquete de membrana PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de grado secante Leche en polvo descremada</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo NS3 contra el virus de la hepatitis C [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo NS3 contra el virus de la hepatitis C [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP)&nbsp;</td><td>Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Prime Western Blotting Reactivos de detección&nbsp;</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td>Sistema de PCR en tiempo real <td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX con ROX</td><td>Sistema</td><td></td> de PCR en tiempo real Life Technologies 11744500 <td></td></tr><tr><td>ViiA 7</td><td>Kit</td><td></td> de sistema de ensayo de luciferasa Life Technologies NA <td></td></tr><tr><td>Renilla</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>DNasa libre de ARNasa</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de detección múltiple GloMax-(luminómetro)</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo para el análisis de la hepatitis c de replicación del virus

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Virus de Hepatitis C (VHC) afecta a 3% de la población mundial y causa graves enfermedades del hígado incluyendo hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular. El VHC es un virus de ARN con envoltura que pertenece a la familia Flaviviridae. El tratamiento actual no es totalmente eficaz y causa efectos secundarios adversos. No existe una vacuna contra el VHC disponible. Por lo tanto, se requiere un esfuerzo continuado para el desarrollo de una vacuna y mejor terapia. Un sistema de cultivo celular VHC es crítica para el estudio de varias etapas de crecimiento del VHC incluyendo la entrada del virus, la replicación del genoma, el envasado, y la salida. En el procedimiento actual presentado, se utilizó un virus de tipo salvaje intragenotype 2a quimérico, FNX-VHC, y un virus FNX-Rluc recombinante que lleva un gen indicador de luciferasa de Renilla para estudiar la replicación del virus. Una línea celular de hepatoma humano se utilizó (basa Huh-7) para la transfección de transcritos in vitro de VHC ARN genómicos. Sobrenadantes de cultivo libres de células, lisados ​​de proteínas y tARN otal se recogieron en varios puntos de tiempo después de la transfección para evaluar el crecimiento del VHC. VHC estado de la replicación del genoma se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa y la visualización de la presencia de VHC ARN de doble cadena. La expresión de la proteína del VHC se verificó por transferencia de Western y ensayos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para las proteínas del VHC NS3 y NS5A. Células transfectadas de ARN del VHC liberadas partículas infecciosas en sobrenadante de cultivo y el título viral se midió. Se utilizaron ensayos de luciferasa para evaluar el nivel de replicación y la infectividad del VHC reportero. En conclusión, se presentan varios ensayos virológicos para la caracterización de las diferentes etapas del ciclo de replicación del VHC.

Virus de la hepatitis C es un virus de ARN. Por lo tanto para el propósito de la manipulación genética, el ADNc genómico del VHC ha sido clonado en un plásmido vector bacteriano. Una secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 se introdujo inmediatamente antes del extremo 5 &#39;del genoma del VHC. Un esquema general de flujo de trabajo de análisis de VHC se presenta en la Figura 1. Para generar ARN genómico del VHC con el extremo precisa 3 &#39;, del genoma del VHC que contiene el plásmido se cortó con...

El virus de la hepatitis C (VHC) es un importante patógeno humano que causa trastornos hepáticos, como cirrosis y cáncer. Un sistema de cultivo de células infecciosas del VHC es esencial para comprender el mecanismo molecular de la replicación del VHC y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Aquí describimos un protocolo para investigar varias etapas del ciclo de replicación del VHC.

Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar diversas etapas del ciclo de replicación del virus de la hepatitis C. Esto se logra primero generando transcritos de ARN genómico del VHC a partir de constructos de plásmidos linealizados del VHC. El segundo paso consiste en transfectar las células con ARN del VHC. A continuación, las células se siembran para diferentes puntos temporales y ensayos. El paso final es recoger el sobrenadante del cultivo celular para medir el título viral y cosechar las células transfectadas para obtener proteínas y ARN. Finalmente, se realizan la transcripción inversa-PCR, el inmunoblot Western, el ensayo de inmunofluorescencia y la determinación del título del VHC, lo que demuestra un sistema robusto de cultivo celular infeccioso por VHC.La principal ventaja de este sistema de cultivo celular de virus de hepatitis C infeccioso frente al sistema de replicón del VHC es que permite investigar los pasos de entrada viral, ensamblaje de viriones y salida. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología de la hepatitis C, como la morfogénesis de viriones y la interacción entre el patógeno y el huésped. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de vacunas, ya que permite la caracterización de cepas virales atenuadas que pueden evaluarse como candidatas potenciales a vacuna.Aunque este método puede proporcionar información sobre el virus de la hepatitis C, también puede aplicarse a otros virus de ARN de la familia Flaviviridae. En general, las personas nuevas en este método se enfrentarán al reto de generar ARN genómico de alta calidad del VHC. El estudio del ciclo de replicación completo del VHC se volvió factible en cultivo celular tras el descubrimiento de un aislado japonés del VHC de hepatitis fulminante genotipo-2A. La demostración visual del ensayo virológico es fundamental porque el ensayo requerirá experiencia tanto en técnicas moleculares como celulares.Utilizando un virus quimérico intra-genotipo 2A, F-N-X-H-C-V y F-N-X-H-C-V con polimerasa nula para la evaluación de la replicación viral, linearice los plásmidos virales generados previamente mediante digestión con la enzima de restricción XBA-uno en un tubo de dos mililitros. Luego, trate los plásmidos con nucleasa de mung bean para generar extremos romos.Purifique los plásmidos digeridos mediante cromatografía de intercambio aniónico. Verifique la integridad del plásmido linealizado sometiendo el ADN a electroforesis en gel de agarosa. A continuación, agregue la plantilla de ADN del plásmido linealizado a un tubo de 0,2 mililitros que contenga los componentes de la reacción de la ARN polimerasa T-siete para sintetizar transcritos de ARN genómico del VHC.Purifique el ARN recién sintetizado tratado con DNasa utilizando un kit de purificación de ARN. Luego, verifique la producción de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa. A continuación, cuantifique el ARN mediante espectrofotometría.Desprenda las células adherentes basadas en Huh-7 mediante tratamiento con enzima tripsina y recolecte las células en un tubo cónico de 50 mililitros. Tras dos centrifugaciones posteriores, re suspenda el sedimento celular con medio frío de bajo suero. Después de repetir la centrifugación, re suspenda las células en medio de bajo suero a una concentración de un por diez elevado a siete células por mililitro.A continuación, mezcle un total de 10 microgramos de ARN viral transcrito con 400 microlitros de células resuspendidas en una cubeta de electroforesis preenfriada de 0,4 centímetros. Introduzca el ARN viral en las células mediante una electroforesis a 270 voltios, 100 ohmios y 950 microfaradios. Una vez finalizado, resuspenda las células electroporadas en 10 mililitros de medio de crecimiento completo con 15 %FBS. En este momento, siembre las células en matraces T25 a aproximadamente 1,2 × 10⁶ células por matraz y en placas de 48 pozos a 1 × 10⁴ células por pozo para puntos temporales de 4, 48 y 96 horas. Reemplace el medio entre cuatro y ocho horas posteriores a la transfección con medio de crecimiento fresco suplementado con 10 %FBS para eliminar los restos de células muertas de los matraces y placas cultivados.Mediante una pipeta serológica, recolecte los sobrenadantes del cultivo celular en los momentos de 48 y 96 horas en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, elimine los restos celulares de las muestras recolectadas mediante centrifugación a 15.000 rpm durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, almacene los sobrenadantes libres de células a 80 grados Celsius negativos.Lise las células para análisis de proteínas y ARN mediante blot de Western y PCR cuantitativa de transcripción reversa o RT-qPCR en los puntos de tiempo indicados. Transcriba a ADN complementario un microgramo de ARN celular total utilizando la enzima transcriptasa reversa y un cebador específico para la hebra sentido del VHC que se une a la región no traducida cinco prima en un tubo de 0,2 mililitros. Asimismo, transcriba a ADN complementario F-N-X-H-C-V-R-N-A con copias genómicas conocidas utilizando un cebador de la hebra sentido del VHC. Mediante un sistema de PCR en tiempo real, realice la qPCR utilizando 50 nanogramos del ADNc transcrito resultante, cebadores específicos para el VHC y una mezcla sobrante para qPCR que contenga un colorante verde de unión al ADN. Utilice las siguientes condiciones al realizar la qPCR para determinar el número de copias de R-N-A del V-H-C. Tras la qPCR, resuelva el lisado celular proveniente del ARN viral transfectado a 96 horas posteriores a la transfección mediante electroforesis SDS-PAGE. Luego, transfiera las proteínas resueltas en el gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno mediante el método trans-blot turbo. Bloquee la membrana utilizando una solución bloqueadora que contenga leche descremada al 5 % y tween-20 al 0,2 % en PBS y colóquela en un recipiente.Incube la membrana con el anticuerpo primario monoclonal de ratón NS3 a una dilución de uno a 1000 y con beta-actina a una dilución de uno a 5,000 en una cámara fría a cuatro grados Celsius. Después de la incubación, agregue inmunoglobulina G de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante a una dilución de uno a 5,000 y detecte mediante quimioluminiscencia.En este punto, fije las células transfectadas con H-C-V-R-N-A utilizando metanol durante 30 minutos a veinte grados Celsius bajo cero para el ensayo de inmunofluorescencia. Una vez finalizado, lave las células tres veces con PBS. Después de bloquear con tampón de bloqueo para el ensayo de inmunofluorescencia, use el anticuerpo primario anti-NS5A policlonal de conejo y el anticuerpo primario anti-DSRNA monoclonal de ratón J2 en una dilución de uno a 200 e incube durante cinco horas hasta toda la noche en una cámara fría a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, lave las células tres veces con PBS después del anticuerpo primario. Luego agregue el anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-inmunoglobulina G 488 de conejo y el anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-inmunoglobulina 594 de ratón en una dilución de uno a 1000 e incube durante una hora a temperatura ambiente en un agitador rotatorio de mesa. Después de lavar las células tres veces con PBS, tiña los núcleos utilizando el colorante Hoechst y observe mediante un microscopio de fluorescencia. A continuación, siembre células Huh7.5.1 naïve a aproximadamente tres veces 10 a la tercera células por pocillo utilizando una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, realice una dilución seriada decimal del sobrenadante de cultivo libre de células obtenido de células transfectadas con ARN de H-C-V, utilizando medio de crecimiento, e inocule en triplicado sobre células Huh7.5.1. Fije las células a las 72 horas post-infección usando metanol durante 30 minutos a 20 grados Celsius negativos. Después de retirar las células del congelador, realice tinción inmunofluorescente para la proteína NS5A del H-C-V en condiciones previamente descritas. Utilizando un microscopio de fluorescencia, cuente los focos celulares positivos para NS5A en el pocillo con la mayor dilución viral y calcule el número promedio de unidades formadoras de focos por mililitro.La calidad del plásmido linealizado del VHC se evaluó mediante electroforesis en gel. El ADN del VHC se sometió a transcripción in vitro mediada por la ARN polimerasa T7, lo que produjo un único producto de ARN de 9,6 kilobases. Los resultados de RT-qPCR indicaron que el virus silvestre replicó el genoma de manera eficiente. El tipo silvestre mostró un nivel de replicación del genoma de uno a tres órdenes de magnitud superior en comparación con el virus pol-nulo.El virus de tipo salvaje produjo la proteína NS3 implicada en la escisión de proteínas virales y en la replicación del genoma. El virus de tipo salvaje también expresó la proteína NS5A, y la proteína NS5A y el ARN de doble cadena se co-localizaron en el citoplasma celular de las células transfectadas con el tipo salvaje, lo que sugiere una replicación viral activa. Las mediciones del título viral indicaron que el virus de tipo salvaje es infeccioso y produce más de 10.000 unidades formadoras de focos por mililitro de partículas infecciosas. A las seis horas posteriores a la transfección, tanto el virus de tipo salvaje como el virus pol-nulo presentaron actividades de luciferasa similares, lo que indica que se había traducido un nivel similar de ARN transfectado. Sin embargo, a las 48 y 96 horas posteriores a la transfección, el virus de tipo salvaje mostró niveles aumentados de replicación del genoma en comparación con el virus pol-nulo. El virus de tipo salvaje también produjo la proteína viral NS3. El virus pol-nulo presentó una actividad de luciferasa basal, mientras que el virus de tipo salvaje mostró un nivel de replicación dos a tres órdenes de magnitud mayor en comparación con el virus reportero pol-nulo. Una vez dominadas, las pruebas virológicas del virus de la hepatitis C pueden realizarse en dos semanas si se llevan a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante contar con células robustas y transcritos de ARN genómico de VHC de alta calidad. Tras seguir este procedimiento, se pueden probar cepas de VHC caracterizadas en sistemas de modelos animales para investigar la aptitud in vivo y las interacciones huésped-patógeno.El desarrollo de un sistema de cultivo celular infeccioso para el VHC allanó el camino para que los investigadores exploraran los pasos de morfogénesis del virión y salida viral en el ciclo de replicación del VHC. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar diversos ensayos virológicos para caracterizar las diferentes etapas del ciclo de replicación del virus de la hepatitis C. No olvide que trabajar con el virus de la hepatitis C puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones de seguridad, como el uso de equipo de protección personal adecuado, durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Dos Métodos de Formación heterocarión para descubrir los factores de restricción del VHC

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Este video muestra un ensayo de fijación viral para la detección de compuestos antivirales. Utilizando el virus de la hepatitis C modificado genéticamente y la luciferasa, evalúa los efectos inhibitorios sobre la adhesión viral, como lo indica la menor intensidad de luz en los pocillos tratados conjuntamente en comparación con los pocillos tratados con el virus solo.

Un ensayo de unión viral para la detección de compuestos antivirales

Este video muestra un ensayo para evaluar agentes antivirales que se dirigen a pasos específicos de la entrada viral en las células huésped y la fusión con el endosoma. Las células se incuban a baja temperatura y luego se infectan con el VHC. La baja temperatura permite la unión viral a las células huésped, pero inhibe la internalización a través de la endocitosis. Se añade el compuesto antiviral de prueba y las células se incuban a temperatura fisiológica. Este cambio a una temperatura más...

Un ensayo para evaluar el efecto de los compuestos de prueba en la entrada y fusión viral en las células huésped

Aquí se describe un virus de la hepatitis B de nuevo desarrollo sistema indicador (HBV) para supervisar las primeras etapas del ciclo de vida de HBV. Esta simplificado sistema in vitro ayudará en la selección de agentes anti-HBV utilizando una estrategia de alto rendimiento.

Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Aquí describimos la generación en vitro de ADN del VHB a través de un sistema de infección de virus de Hepatitis B y la detección altamente sensible de su integración de (1 – 2 copias) con inversa nested PCR.

Detección de copia baja número DNA Viral integradora formada por In Vitro la infección Hepatitis B

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para realizar experimentos 3D "hígado-en-un-chip" infección con el virus de la hepatitis B.

"Hígado-en-un-Chip" cultivos de hepatocitos primarios y células de Kupffer para infección del Virus de la Hepatitis B

El protocolo describe un método para introducir una diversidad genética controlable en el genoma del virus de la hepatitis C mediante la combinación de la síntesis de ARN mutante de longitud completa mediante PCR propensa a errores y genética inversa. El método proporciona un modelo para la selección del fenotipo y se puede utilizar para genomas de virus de ARN de sentido positivo de 10 kb de largo.

Genética inversa para diseñar variantes de virus de ARN de sentido positivo

Aprende a generar ARN genómico del virus de la hepatitis C y transfectar células para establecer un sistema de cultivo infeccioso. Este protocolo permite estudiar el ciclo de replicación viral mediante PCR, Western blot e inmunofluorescencia.

Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

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