Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

El objetivo general de este procedimiento es investigar varias etapas del ciclo de replicación del virus de la hepatitis C. Esto se logra generando primero ARN genómico del VHC, transcripciones de construcciones de plásmidos del VHC linealizados. El segundo paso es transfectar las células con H-C-V-R-N-A.

A continuación, las celdas se platean para varios puntos de tiempo y ensayos. El paso final es recolectar el sobrenadante del cultivo celular para medir el título viral y recolectar las células transfectadas para proteínas y ARN. En última instancia, se realiza la transcripción inversa, la PCR, el ensayo de inmunofluorescencia Western blot y el título del VHC, que demuestran un sólido sistema de cultivo de células infecciosas del VHC.

La principal ventaja de este sistema de cultivo celular del virus de la hepatitis C infecciosa sobre el sistema replicante del VHC es que se pueden investigar los pasos de entrada, ensamblaje y salida de la víbora viral. Este protocolo puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de la virología de la hepatitis C, como la Vion, la morfogénesis y la interacción entre el huésped y el patógeno. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de vacunas, ya que permite la caracterización de cepas virales atenuadas que pueden evaluarse como posibles candidatos a vacunas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el virus de la hepatitis C, también se puede aplicar a otros virus de ARN de la familia de los virus de la hepatitis C. En general, las personas nuevas en este método se enfrentarán al desafío de generar un estudio de ARN genómico del VHC de alta calidad. El ciclo completo de replicación del VHC se hizo factible en cultivos celulares tras el descubrimiento de un aislado de hepatitis fulminante japonesa uno del VHC A genotipo dos.

La demostración visual del ensayo virológico es fundamental porque el ensayo requerirá experiencia en técnicas moleculares y celulares. Uso de un virus quimérico intragenotipo dos A, F-N-X-H-C-V y F-N-X-H-C-V poll null HCV para la evaluación de la replicación viral. Linealice plásmidos virales generados previamente por digestión con la enzima de restricción XBA one en un tubo de dos mililitros. Luego trate los plásmidos con nucleasa de frijol mungo para generar extremos romos.

Purificar los plásmidos digeridos por cromatografía de intercambio aniónico. Verifique la integridad del plásmido linealizado sometiendo el ADN a electroforesis en gel AROS. A continuación, agregue la plantilla de ADN plasmídico linealizado en un tubo de 0,2 mililitros que contenga componentes de la reacción de la ARN polimerasa T seven para sintetizar las transcripciones de ARN genómico del VHC.

Purifique el ARN tratado con el ADN recién sintetizado utilizando un kit de purificación de ARN. A continuación, verifique la producción de ARN mediante electroforesis en gel Agros. A continuación, cuantifique el ARN mediante fotometría espectral.

Separe las células adherentes basadas en HU siete utilizando el tratamiento con enzimas de tripsina y recoja las células en un cónico de 50 mililitros. Dos resus. Suspenda el pellet celular con medios fríos de suero bajo Después de repetir la centrifugación, vuelva a suspender las células en medios de suero bajo a una vez 10 a las siete celdas por mililitro.

A continuación, mezcle un total de 10 microgramos de ARN viral transcrito con 400 microlitros de células resuspendidas en una electroporación preenfriada de 0,4 centímetros para entregar el ARN viral en las células mediante una electroporación a 270 voltios, 100 ohmios y 950 microferros. Cuando termine, vuelva a suspender las celdas electroporadas en 10 mililitros de medio de crecimiento completo con 15% de FBS en este punto, coloque las celdas en ambos matraces T 25 a aproximadamente 1,2 veces 10 por las seis celdas por matraz y placas de 48 pocillos a una vez 10 por la cuarta celda por pocillo durante 4, 48 y 96 horas. Reemplace el medio a las cuatro a ocho horas después de la transfección con un medio de crecimiento fresco suplementado con 10% de FBS para eliminar los restos de células muertas de los matraces y placas cultivados.

Con una pipeta serológica, recoja los sobrenadantes del cultivo celular a 48 N y 96 horas en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, retire los restos celulares de las muestras recogidas por centrifugación a 15.000 rpm durante 10 minutos a cuatro grados centígrados después de la centrifugación. Almacene los sobrenadantes libres de células a menos 80 grados centígrados.

Lice las células para el análisis de proteínas y ARN mediante Western blot y PCR cuantitativa con transcripción inversa o R-T-Q-P-C-R en los puntos de tiempo indicados. Transcriba inversamente un microgramo de ARN celular total utilizando la enzima transcriptasa inversa y un cebador específico para la cadena sensorial del VHC que se une a las cinco regiones principales no traducidas en un tubo de 0,2 mililitros. Además, transcriba inversa F-N-X-H-C-V-R-N-A de copias genómicas conocidas utilizando un cebador de hebra de detección de VHC utilizando un sistema de PCR en tiempo real.

Lleve a cabo la QPCR utilizando 50 nanogramos del CD NA transcrito resultante utilizando cebadores específicos para el VHC y un colorante verde de unión al ADN que contenga una supermezcla de QPCR. Utilice las siguientes condiciones al ejecutar QPCR para determinar el número de copia H-C-V-R-N-A después de QPCR. Resuelva el lisado celular del ARN viral transfectado a las 96 horas.

Página posterior a la transfección mediante SDS. A continuación, transfiera las proteínas resueltas en el gel a una membrana de difluoruro de polivid mediante el método turbo transparcela. Bloquee la membrana con una solución de bloqueo que contenga 5% de leche desnatada y 0,2% entre 20 en PBS y colóquela en un recipiente.

Incubar la membrana con anticuerpo monoclonal primario de ratón y S3 en una dilución de uno en 1000 y beta actina en una dilución de uno en 5.000 en una cámara frigorífica de cuatro grados centígrados. Después de la incubación, agregue inmunoglobulina G anti ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante en una dilución de uno en 5, 000 y detecte por quimioluminiscencia. En este punto, fije las células transfectadas H-C-V-R-N-A utilizando metanol durante 30 minutos a 20 grados centígrados negativos para el ensayo de inmunofluorescencia.

Cuando termine, lave las células con PB S3 varias veces después de bloquearlas con tampón de bloqueo de ensayo de inmunofluorescencia, use un anticuerpo primario anti NS 5 policlonal de conejo y un anticuerpo monoclonal de ARN anti DS J 2 de ratón a una dilución de uno a 200 e incube durante cinco horas o toda la noche en una cámara fría de cuatro grados centígrados. Después de la incubación, lavar las células con PB S3 varias veces después del anticuerpo primario. A continuación, añada el anticuerpo secundario policlonal de inmunoglobulina G 4 8 8 de inmunoglobulina G 4 8 8 de cabra y el anticuerpo secundario policlonal de inmunoglobulina 5 9 4 de cabra en una dilución de uno en 1000 e incube durante una hora a temperatura ambiente en una mecedora de mesa.

Después de lavar las células con PB S3 veces, tiñir los núcleos con un troquel herx y ver con un microscopio fluorescente. Siguiente placa de tono ingenuo, 7.5 0.1 celdas a aproximadamente tres veces 10 a la tercera celda por pocillo. Usando una placa de 96 pocillos al día siguiente, realice una dilución en serie diez veces mayor del sobrenadante de cultivo libre de células recolectado de células transfectadas H-C-V-R-N-A utilizando medios de crecimiento e inocule por triplicado en el tono.

7.5 0.1 células Fije las células a las 72 horas después de la infección utilizando metanol durante 30 minutos a 20 grados centígrados negativos después de retirar las células del congelador tinción de aminoácidos para la proteína H-C-V-N-S cinco A utilizando las condiciones descritas anteriormente utilizando un microscopio fluorescente. Cuente los focos de células NS cinco, A positivos en el pocillo con la dilución viral más alta y calcule el número promedio de unidades formadoras de foco por mililitro. La calidad linealizada del plásmido del VHC se evaluó mediante electroforesis en gel.

El H-C-V-D-N-A se sometió a transcripción in vitro mediada por T seven ARN polimerasa, lo que produjo un único producto de ARN a 9,6 Kilobases. Los resultados de R-T-Q-P-C-R indicaron que el virus de tipo salvaje replicó el genoma de manera eficiente. El tipo salvaje exhibió un nivel de replicación del genoma de uno a tres logaritmos más alto en comparación con el virus nulo.

El virus de tipo salvaje produjo la proteína NS tres involucrada en la escisión de proteínas virales y la replicación del genoma. El virus de tipo salvaje también expresó la proteína NS cinco a y la proteína NS cinco a y ARN bicatenario colocalizado en el citoplasma celular de las células transfectadas de tipo salvaje, lo que sugiere que las mediciones de títulos del virus de replicación viral activa indicaron que el virus de tipo salvaje es infeccioso y produce más de 10.000 unidades formadoras de focos por mililitro de partícula infecciosa a las seis horas después de la transfección. Tanto los virus de tipo salvaje como los virus de polo nulo tuvieron actividades de luciferasa similares, lo que indica un nivel de entrada similar de transfectado.

Sin embargo, el ARN se tradujo a las 48 horas y 96 horas después de la transfección. El virus de tipo salvaje mostró un aumento en los niveles de replicación del genoma en comparación con el virus nulo. El virus de tipo salvaje también produjo la proteína viral NS tres.

El virus de la encuesta nula tuvo actividad de luciferasa de nivel base, mientras que el virus de tipo salvaje tuvo un nivel de replicación de dos a tres registros más alto en comparación con el virus reportero de la encuesta nula. Una vez dominado el Hepatitis TC, los ensayos virológicos se pueden realizar en dos semanas si se realizan correctamente Al intentar este procedimiento, es importante tener células robustas y transcripciones de ARN genómico del VHC de alta calidad. Siguiendo este procedimiento, las cepas caracterizadas del VHC pueden probarse en sistemas de modelos animales para investigar la aptitud in vivo y las interacciones entre el huésped y el patógeno.

El desarrollo de un sistema de cultivo de células infecciosas del VHC allanó el camino para que los investigadores exploraran los pasos de virión, morfogénesis y salida viral del ciclo de replicación del VHC. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar varios ensayos virológicos para caracterizar las diferentes etapas del ciclo de replicación del virus de la hepatitis C. No olvide que trabajar con el virus de la hepatitis C puede ser extremadamente peligroso y, por favor, siempre se deben tomar precauciones de seguridad, como el uso de equipo de protección personal adecuado, mientras se realiza este procedimiento.