Name: Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la fagocitosis de entradas presinápticas por microglía mediante trazadores fluorescentes y microscopía confocal. Este ensayo permite estudiar la poda sináptica en neurociencia.

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El trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Smith Family (BS), la Fundación Dana (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (SR1-NS-07100801; BS), NRSA (F32-NS-066698; DPS), Nancy Fundación Lurie Marks (DPS), el NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

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No hay conflictos de interés declarado.

Con el fin de medir con precisión la fagocitosis, el material engullido debe etiquetarse de tal manera que el investigador puede visualizar una vez se ha producido la degradación lisosomal. Además, se requiere formación de imágenes de alta resolución, seguido por el uso de software que permita el investigador para visualizar el volumen de toda la célula y cuantificar su contenido. En este protocolo, se describe un método altamente fiable y cuantitativa para medir la inmersión de los fagocitos mediada por el uso de CTB c...

<html> Circuitos sinápticos remodelar largo de la vida de un animal. En el cerebro en desarrollo, las sinapsis se forman en exceso y deben someterse a la poda sináptica que consiste en la eliminación selectiva de un subconjunto de las sinapsis y el mantenimiento y fortalecimiento de esas sinapsis que permanecen 8-10. Este proceso es necesario para lograr la conectividad característica precisa del sistema nervioso adulto. En el adulto, las sinapsis también pueden ser de plástico, en particular en el contexto del aprendizaje y la memoria. Las correlaciones estructurales de esta plasticidad se cree que incluyen la adición y / o eliminación de las espinas dendríticas y presináptica boutons 11-13. Además de estas funciones en el sistema nervioso saludable, remodelación sináptica también está implicada en la enfermedad del sistema nervioso 12,14,15 / lesión. Por ejemplo, después de una lesión de la médula espinal, los axones cortados deben posteriormente remodelar y formar nuevas sinapsis para lograr la recuperación funcional 16-19. nt &quot;&gt; Emergiendo como un aspecto importante de la plasticidad sináptica es el proceso de la fagocitosis o la inmersión de las sinapsis con destino a la eliminación 3,5,20. Recientemente, hemos mostrado este fenómeno en el contexto de la poda sináptica en el sano, el cerebro postnatal ratón 7. Específicamente , microglía, las células inmunes residentes del SNC y los fagocitos, se muestra para engullir entradas presinápticas durante un período de pico y en una región de la poda sináptica de desarrollo, el dorsal posnatal núcleo geniculado lateral (dLGN) del tálamo. bloqueo genética o farmacológica de esta inmersión traducido en déficits sostenidos en la conectividad sináptica. En este protocolo, se describe un ensayo fiable y altamente cuantitativo para medir la inmersión fagocítica mediada de insumos presináptica. A los efectos de este artículo, este ensayo se presentará en el marco del sistema de desarrollo de retinogeniculadas, que incluye las células ganglionares de la retina (CGR) que reside en la retina queproyectar entradas presináptica a la dLGN (Figura 1A). Para empezar, una estrategia de marcaje anterógrado resistente a la degradación lisosomal se describirá, que se utiliza para visualizar entradas presinápticas RGC-específicos en la dLGN (Figura 1) 7,21. Después de esta descripción, una metodología detallada para la imagen y la medición cuantitativa de inmersión utilizando microscopía confocal combinadas con 3 dimensiones (3D) de superficie representación de volumen se le dará. Esta metodología se basa en la preparación del tejido fija, pero también puede ser adaptado para su uso en estudios de formación de imágenes en vivo. Es importante destacar que, mientras que el ensayo ha sido validado en el contexto del sistema de retinogeniculadas saludable, posnatal, se podría aplicar las mismas técnicas para evaluar otras interacciones fagocito-neuronas en todo el cerebro y durante la enfermedad, así como la función fagocítica en otros sistemas de órganos.

<table><tbody><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Vet Equip, Inc.</td><td>965500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de agua caliente para almohadilla térmica</td><td>Kent Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>DSC Microscopio</td><td></td><td>quirúrgico óptico Zeiss Opmi -6</td></tr><tr><td>Microtomo deslizante con etapa de congelación</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de micrótomo</td><td>Leica</td><td>14021607100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección fluorescente</td><td>Nikon</td><td>SMZ800 con Accesorio</td><td></td>de epifluorescencia</tr><tr><td>Microscopio confocal de disco giratorio</td><td>Perkin Elmer</td><td>UltraView Vox Disco giratorio Confocal</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; l Jeringas herméticas al gas Hamilton</td><td></td><td>Hamilton 80030</td><td>Utilice una jeringa diferente para cada colorante / trazador</td></tr><tr><td>Agujas Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7803-05, especificaciones: romo, 1.5 "</td><td></td></tr><tr><td>Toxina del cólera conjugada con Alexa y beta; subunidad (CTB)</td><td>Invitrogen</td><td>488: C22841</td><td>Reconstituir en solución salina estéril, 80 y micro; l (488), 100 y micro; l (594), 20 y micro; l (647)</td></tr><tr><td>594: C22842</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>647: C34778</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;( PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina y Polimixina B Sulfatos y Bacitracina Zinc Pomada Oftálmica USP (ungüento antibiótico)</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208-780-55</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 30,5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeyde (PFA)</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>15710</td><td>Diluir del 16% al 4% en PBS. El paraformaldehído es tóxico, úselo en una campana extractora y use equipo de protección personal.</td></tr><tr><td>Herramientas de disección &ndash; tijeras, fórceps, espátula</td><td>Tijeras pequeñas: Fine Science Tools</td><td>Tijeras pequeñas:14370-22</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras grandes: Roboz</td><td>Tijeras grandes: RS-6820</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#55 pinzas: Fine Science Tools</td><td>#55 pinzas: 11255-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espátula: Ted Pella, Inc.</td><td>Espátula: 13504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S8501-5KG</td><td>Producir un 30% de sacarosa en PBS (peso/vol)</td></tr><tr><td>OCT Compuesto</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Barco de pesaje</td><td>USA Scientific</td><td>2347-1426</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S6566-500G</td><td>Producir 0,2 M de fosfato sódico monobásico (PB-A) en ddH2O y 0,2 M de fosfato sódico dibásico (PB-B) en ddH2O. Para hacer 0,1 M de PB, combine 19 ml de PB-A y 81 ml de PB-B, llene hasta 200 ml con ddH2O</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 22 x 50 mm, n.º 1,5</td><td>VWR</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio cargado</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Vectasheild</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de inmersión en: un protocolo para evaluar interacciones entre cns fagocitos y neuronas

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

La fagocitosis es un proceso en el que una célula envuelve el material (célula entera, partes de una célula, escombros, etc) en su entorno extracelular que rodea y posteriormente se digiere este material, comúnmente a través de la degradación lisosomal. La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) cuya función fagocítica se ha descrito en una amplia gama de condiciones de enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, aclaramiento de beta-amiloide en la enfermedad de Alzheimer) para el desarrollo del cerebro sano (por ejemplo, sináptica poda) 1-6. El siguiente protocolo es un ensayo de inmersión desarrollado para visualizar y cuantificar inmersión microglia mediada de insumos presinápticas del sistema retinogeniculadas ratón en desarrollo 7. Mientras que se utilizó este ensayo para evaluar la función microglia en este contexto particular, un enfoque similar se puede utilizar para evaluar otros fagocitos en todo el cerebro (por ejemplo, astrocitos) y el resto del cuerpo(por ejemplo, macrófagos periféricos), así como otros contextos en los que ocurre la remodelación sináptica (por ejemplo, lesión cerebral / enfermedad).

Recientemente, se utilizó este ensayo de inmersión para visualizar y cuantificar inmersión microglia mediada de entradas presinápticas en el sistema retinogeniculadas en desarrollo (Figura 1) 7. CGR de ratones heterocigotos CX3CR1-EGFP fueron anterogradely remontar con CTB-594 y CTB-647 en los ojos izquierdo y derecho, respectivamente. A raíz de esta localización, se obtuvieron imágenes de microglia EGFP-positivas dentro de la dLGN. Estas imágenes fueron posteriormente superficie prestados po...

La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la fagocitosis de entradas presinápticas por parte de la microglía. Esto se logra primero mediante la inyección de trazadores fluorescentes anterógrados en los ojos para marcar las entradas presinápticas de las células ganglionares de la retina en el núcleo geniculado lateral. El segundo paso consiste en diseccionar, fijar y equilibrar el cerebro.A continuación, se secciona el cerebro. El paso final consiste en montar los cortes cerebrales sobre un cubreobjetos para su análisis e imagen. Finalmente, se utiliza microscopía confocal para evaluar la fagocitosis de las entradas presinápticas por parte de la microglía.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la forma en que los microglías fagocíticos contribuyen a la plasticidad y remodelación de los circuitos sinápticos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la remodelación de circuitos sinápticos en el cerebro sano, también puede aplicarse a otros sistemas, como la remodelación de circuitos sinápticos durante enfermedades del sistema nervioso. El procedimiento será demostrado por Chris Heller, un téc

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Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.

Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

En este video, realizamos el ensayo de fagocitosis microglial para el neuroblastoma utilizando células madre pluripotentes inducidas. El ensayo ayuda a evaluar el deterioro de la función microglial en enfermedades neurodegenerativas.

Ensayo de fagocitosis microglial: un ensayo in vitro para establecer un modelo de fagocitosis microglial para células de neuroblastoma utilizando macrófagos iPSC

En este video, evaluamos la capacidad fagocítica de los astrocitos purificados in vitro mediante un ensayo de imagen en vivo. El ensayo sirve como una plataforma de cribado eficaz para identificar compuestos químicos que pueden mejorar o inhibir la capacidad fagocítica de los astrocitos.

Ensayo de fagocitosis in vitro: un método basado en imágenes en vivo para estudiar la fagocitosis sinaptosómica mediada por astrocitos en tiempo real

Fuente: Funes, S., et. al., Células similares a la microglía humana: diferenciación de células madre pluripotentes inducidas y ensayo de fagocitosis de células vivas in vitro utilizando sinaptosomas humanos. J. Vis. Exp. (2022)Este video muestra un ensayo para estudiar la capacidad fagocítica de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas marcados con colorantes fluorescentes sensibles al pH.

Ensayo de fagocitosis de células vivas de células similares a la microglía utilizando sinaptosomas humanos

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Este protocolo describe el co-cultivo de neuronas-astrocito indirecta para el análisis de las interacciones neurona compartimentada-glia.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Este protocolo presenta un en vitro en vivo-proyección de imagen de fagocitosis ensayo para medir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Microglia y astrocitos de rata purificados se utilizan junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Este método puede detectar cinética en tiempo real de la inmersión y la degradación y proporciona una plataforma de proyección adecuado para identificar factores de modulación de fagocitosis de los astrositos.

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

Las enfermedades neurodegenerativas se asocian con funciones de microglía desreguladas. Este artículo describe un ensayo in vitro de fagocitosis de células de neuroblastoma por macrófagos iPSC. Las lecturas de microscopía cuantitativa se describen tanto para imágenes de lapso de tiempo de células vivas como para imágenes de alto contenido de células fijas.

Ensayo de imagen cuantitativa in vitro para la fagocitosis de células muertas de neuroblastoma por iPSC-Macrófagos

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

Aprende a visualizar y cuantificar la fagocitosis de entradas presinápticas por microglía mediante trazadores fluorescentes y microscopía confocal. Este ensayo permite estudiar la poda sináptica en neurociencia.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

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