Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la absorción de entradas presinápticas por parte de la microglía. Esto se logra inyectando primero los trazadores fluorescentes de grado anterior en los ojos para etiquetar las entradas presinápticas de las células ganglionares de la retina en el núcleo genante lateral. El segundo paso es diseccionar, arreglar y equilibrar el cerebro.

A continuación, se secciona el cerebro. El paso final es montar las secciones del cerebro en un labio de cubierta para obtener imágenes y análisis. En última instancia, la microscopía confocal se utiliza para evaluar la absorción de entradas presinápticas por parte de la microglía.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo los suelos fagocíticos contribuyen a la plasticidad y remodelación de los circuitos sinápticos. Aunque este método puede proporcionar información sobre la remodelación del circuito sináptico en el cerebro sano, también se puede aplicar a otros sistemas, como la remodelación del circuito sináptico durante la enfermedad del sistema nervioso. Chris Heller, un técnico, y Emily Laman, una estudiante graduada del Laboratorio Stevens, demostrarán el procedimiento.

Comience este procedimiento anestesiando un ratón con 4% de flúor ISO en una cámara de inducción de plexiglás. Después de uno a tres minutos, asegúrese de lograr un nivel adecuado de anestesia pellizcando la cola. A continuación, coloque el ratón de lado bajo el microscopio estereoscópico y coloque el cono de la nariz, que suministra entre un 3 y un 4% de flúor ISO sobre el hocico.

Para exponer la esclerótica, use un par de tijeras de resorte pequeñas para abrir el párpado y retirar la piel. En el caso de los recién nacidos, a veces es necesario otro corte perpendicular en el rabillo del ojo. Tenga cuidado al cortar la esquina del párpado, ya que hay un vaso sanguíneo.

Use una aguja estéril de calibre 30.5 para perforar un pequeño orificio en el costado del ojo donde comienza la esclerótica. Tenga cuidado de evitar dañar la lente insertando la aguja lo suficientemente lejos como para que el bisel entre en el ojo. Deje que el vítreo fluya fuera del orificio y use un aplicador estéril cortado y con punta para absorber el líquido.

Una vez que el vítreo haya dejado de fluir fuera del orificio, inserte lentamente una aguja de punta roma unida a una jeringa Hamilton que haya sido precargada con trazado de grado anterior. Tiñe en el agujero, inyecta lentamente el tinte en el ojo. Por lo general, la subunidad beta de la toxina del cólera conjugada con Alexa 5 94, 6 47 o 4 88 se utiliza para el grado anterior.

Entradas de R GC de rastreo tardío Deje la aguja en el orificio durante unos segundos y luego retírela lentamente. Usa un aplicador con punta de algodón para absorber el exceso de líquido y evitar que el tinte se escape. A continuación, aplique una pequeña cantidad de ungüento antibiótico en el ojo.

Si el ojo fue abierto quirúrgicamente. Vuelva a colocar suavemente los párpados juntos después de la inyección. Deje el mouse debajo de una lámpara de calor o sobre una almohadilla térmica hasta que comience a recuperarse de la anestesia.

Regrese el ratón a una jaula casera limpia y vigílelo para asegurarse de que esté completamente despierto antes de devolverlo a la colonia. Aproximadamente 24 horas después de la inyección, sacrifique el ratón y diseccione el cerebro. Fije el cerebro en un tubo Falcon lleno de PFA al 4% durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente.

Enjuague el cerebro tres veces en PBS vertiendo primero el cerebro y el PFA en un bote de suero vacío, luego use una espátula para transferir el cerebro a otro bote de suero lleno de PBS. Lave el cerebro dos veces más en PBS antes de transferirlo a un tubo Falcon lleno de solución de sacarosa al 30%. Déjalo en sacarosa a cuatro grados centígrados hasta que se hunda hasta el fondo del tubo.

Después, extirpa cualquier parte del cerebro que no sea necesaria con una cuchilla de afeitar. Congela el cerebro en un trozo de papel de aluminio sobre hielo seco. Mientras tanto, congele la etapa de micrótomo y llene cada pocillo de una placa de 24 pocillos con medio mililitro de PP 0,1 molar para montar el cerebro congelado en la etapa de congelación.

Aplique una pequeña cantidad de OCT en el escenario. Una vez que la OCT comience a congelarse, coloque el cerebro en ella. El lado del cerebro que se cortará debe estar hacia arriba.

A continuación, cubra el cerebro y la OCT con hielo seco picado muy finamente. Deja el hielo seco en el cerebro durante unos 30 segundos. Luego, usa un pincel grande para quitar el hielo seco.

Comience a seccionar las rodajas con un grosor de 40 micras. A continuación, utilice un pincel pequeño y húmedo para eliminar las secciones que contienen la región de interés de la cuchilla y transfiéralas a la placa de 24 pocillos que contiene 0,1 molar pb. Una vez que se hayan recolectado las secciones, visualice el etiquetado de grado anterior bajo un microscopio de disección fluorescente y elija secciones que contengan la región de interés para montar las secciones en un portaobjetos.

En primer lugar, aplique una pequeña piscina de PB de 0,1 molar a un microscopio cargado. A continuación, transfiera las secciones de tejido a la piscina de pb. A continuación, utiliza el pincel para orientar y extender los tejidos.

Use una toallita Kim para absorber XSPB y tenga cuidado de evitar que la sección se desmeche. Deja que se sequen completamente al aire. A continuación, aplique una pequeña gota de medio de montaje a cada sección y monte un cubreobjetos en la parte superior del extremo.

Sella los bordes del portaobjetos con esmalte de uñas. Guarde el portaobjetos a menos 20 grados centígrados hasta que se muestre la sesión de imágenes. A continuación se presenta un esquema de la estrategia de trazado de grado anterior.

Las entradas RGC del ojo izquierdo y derecho se trazan con CTB 6 47 y CTB 5 94 respectivamente. Posteriormente se evalúa la absorción de insumos mediada por la microglía. Aquí hay una imagen representativa de bajo aumento del DLGN de ratón postnatal del quinto día después del trazado intergrado de las entradas del ojo izquierdo y derecho.

Se trata de una microglía muestreada de la región fronteriza de las entradas del ojo izquierdo y derecho. Se ha restado toda la fluorescencia de CTB fuera del volumen microglial, revelando las entradas de RGC que han sido engullidas y la representación superficial de la microglía y engullida. Aquí se muestran las entradas RGC.

Aquí está la superficie representativa de la microglía renderizada del ratón P 5, P 9 y P 30. DLGN La absorción de aportes de RGC aumenta significativamente durante el pico de poda en el DLGN en comparación con las edades más avanzadas. La microglía de los ratones deficientes en el receptor del complemento tres engulle significativamente menos entradas de RGC en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje una vez dominados.

Esta técnica se puede realizar en 72 horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo intercalar neuronas de etiqueta y evaluar las interacciones de la sinapsis de la microglía.