El descubrimiento de las interacciones de proteínas y caracterización de la función de proteínas utilizando HaloTag Tecnología

El objetivo general de este procedimiento es aislar de manera eficiente complejos proteicos a partir de células de mamífero. Esto se logra primero transfectando las células con un vector de fusión que contiene la etiqueta halo para expresar la proteína de interés. El segundo paso consiste en lisar las células y capturar covalentemente los complejos proteicos sobre una resina mediante la etiqueta halo.

A continuación, se lavan suavemente los complejos proteicos en la resina para eliminar cualquier interacción no específica. El paso final consiste en eluir los complejos proteicos de la resina. En última instancia, los ensayos de precipitación con etiqueta halo se utilizan para aislar y descubrir nuevas interacciones proteicas en sistemas de mamíferos.

Los métodos que demostraremos aquí hoy pueden permitir descubrimientos clave en el área de la proteómica funcional, incluyendo la identificación de nuevas interacciones proteicas y la determinación de la localización de proteínas dentro de las células. Realizando estos procedimientos hoy están dos de nuestros científicos principales, Jackie Mendez y Alen Beek. Primero, para cada fusión o control, prepare un platillo de 15 centímetros con 30 mililitros de células a tres o cuatro veces 10 a la quinta células por mililitro, o entre uno y 1,2 veces 10 a la séptima células en total por construcción.

Incubar las células durante 18 a 24 horas a 37 grados Celsius y 5%CO2. Tras la incubación, transfectar el constructo con el reactivo de transfección deseado. Después de 24 a 48 horas, posteriores a la transfección, retirar el medio y lavar suavemente la capa celular con 20 a 25 mililitros de PBS frío con hielo, eliminar el lavado de PBS y añadir 25 a 30 mililitros de PBS enfriado a cuatro grados Celsius.

A continuación, desprenda suavemente las células del recipiente con un raspador celular. Una vez que las células hayan sido recogidas en tubos cónicos, centrifugue las muestras durante cinco a 10 minutos a 2000 veces G y cuatro grados Celsius. Después de desechar el sobrenadante, coloque los pellet celulares a menos 80 grados Celsius durante un mínimo de 30 minutos o un máximo de seis meses.

Para cada muestra de fusión o control, prepare 18 mililitros de tampón de equilibrio y lavado de resina. Mezcle suavemente la resina invirtiendo el vial para obtener una suspensión uniforme. Para cada experimento de inmunoprecipitación, agregue 200 microlitros de resina en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

Centrifugar la muestra durante un minuto a 800 veces G. Tras la centrifugación, eliminar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar la resina en el fondo del tubo. Una vez descartado el sobrenadante, añadir 800 microlitros de tampón de lavado y equilibrio de la resina a la muestra y mezclar completamente invirtiendo el tubo varias veces. Después.

Centrifugar la muestra durante dos minutos a 800 veces. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Repita los pasos anteriores dos veces más para un total de tres lavados.

Después de descongelar los pellet celulares, suspéndalos en 300 microlitros del tampón de lisis para mamíferos previamente preparado, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, transfiera a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue seis microlitros del cóctel de inhibidores de proteasas 50 x.

A continuación, agregue tres microlitros de ADN de RQ1 e invierta la muestra durante 10 minutos. Lise las células a temperatura ambiente pasando la muestra de cinco a 10 veces a través de una aguja de jeringa de 25 o 27 gauge. Una vez que la muestra se haya centrifugado a 14.000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, transfiera el lisado claro a un tubo nuevo y colóquelo en hielo.

A continuación, agregue otros 700 microlitros del tampón 1X TBS previamente preparado al lisado claro y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Retire los lavados finales de los tubos de resina equilibrada previamente preparados sin perturbar la resina en el fondo de cada tubo. Luego, agregue un mililitro del lisado diluido a cada tubo.

Incube las muestras con agitación en un rotador de tubos durante 15 minutos a 22 grados Celsius. A continuación, centrifugue los tubos de resina durante dos minutos a 800 veces G. Después de desechar el sobrenadante, agregue un mililitro de tampón de lavado de equilibrio de resina y mezcle bien invirtiendo manualmente cada tubo de resina varias veces, tras centrifugar los tubos de resina durante dos minutos a 800 veces G. Deseche los lavados una vez que los pasos anteriores y de lavado se hayan repetido tres veces.

Añada un mililitro de tampón de equilibrio del resina a los tubos tras incubar las muestras a 22 grados Celsius durante cinco minutos con rotación constante, centrifugue los tubos del resina durante dos minutos a 800 veces G y deseche los lavados. En este punto, resuspenda el resina de cada muestra en 50 microlitros de tampón de elución SDS. Agite los tubos a temperatura ambiente con un agitador automático de tubos de microcentrífuga durante 30 minutos.

Tras la centrifugación durante dos minutos a 800 × g, transfiera los EITs a tubos nuevos para su análisis. Para la transferencia Western o la tinción con plata, cargue de 5 a 10 microlitros de las muestras en un gel desnaturalizante SDS para espectrometría de masas. Almacene 40 microlitros de cada muestra a menos 20 grados Celsius para análisis posteriores. En una placa de cultivo con ocho pocillos para cada proteína de fusión o control, agregue 400 microlitros de células HELOC en su medio adecuado en cada pocillo, a una densidad de uno a dos por 10⁵ células por mililitro.

Después de incubar las células durante 18 a 24 horas a 37 grados Celsius y 5 %CO2, transfecte las células con el reactivo de transfección deseado tras 18 a 24 horas; posteriormente a la transfección, diluya el ligando TMR uno a 200 en el medio celular apropiado. A continuación, agregue 100 microlitros de esta solución a cada pocillo y mezcle suavemente. Luego, incube las células transfectadas que contienen el ligando durante 15 minutos a 37 grados Celsius y 5 %CO2.

Una vez finalizado, aspire el medio que contiene el ligando y sustitúyalo con 500 microlitros del medio apropiado sin ligando de etiqueta de fusión proteica, que se ha precalentado a 37 grados Celsius. Después de repetir el paso anterior dos veces, para un total de tres lavados, coloque las células nuevamente en el incubador durante 30 minutos.

Tras la incubación de 30 minutos, aspire el medio y reemplácelo con 500 microlitros de medio adecuado, previamente calentado a 37 grados Celsius. A continuación, observe las células en un microscopio utilizando los parámetros de adquisición apropiados según el protocolo halo, BRD cuatro y la expresión del control de la etiqueta halo. La expresión de la proteína de fusión también se puede detectar mediante ensayos Western blot con anticuerpos anti-etiqueta halo o con anticuerpos contra la proteína cebo.

Las geles teñidas con plata de réplicas biológicas de Halo BRD cuatro y controles de inmunoprecipitación demuestran una alta reproducibilidad y muestran las proteínas que interactúan con la proteína BRD cuatro. La alta abundancia de componentes del complejo PTF B CDK nueve y Ciclina T, así como de la proteína BRD nueve, confirma la captura específica de los complejos BRD cuatro. Las geles mostraron otras proteínas identificadas como posibles interaccionadoras de BRD cuatro.

Como ejemplo adicional, se realizaron aislamientos complejos con la proteína Halo HD uno. En este caso, se utilizó la proteasa TEV para escindir una región de enlazador entre la etiqueta Halo y la HDAC uno, liberando cantidades significativas de la proteína objetivo HD uno. Como se observó.

Las muestras de retiro de HD uno mostraron altos niveles de actividad de HD uno, que fue inhibida por el inhibidor de HDA saha. Para demostrar aún más la especificidad, no se observó inhibición de HDA con el inhibidor de la familia sirtuina EX 5 27 y no se detectó señal alguna usando solo tampón. Las células He A transfectadas con Halo BRD cuatro y Halo HDAC uno se marcaron fluorescentemente con TMR.

La imagen de ligandos mostró que ambos se localizaron en el núcleo y demostró que la etiqueta no alteró la localización celular fisiológica de sus proteínas de fusión. Así, tras seguir este procedimiento, las proteínas aisladas y sus proteínas interactivas pueden identificarse y analizarse más a fondo mediante diversos métodos analíticos, como la espectrometría de masas y el inmunotransferencia (western blotting).