El descubrimiento de las interacciones de proteínas y caracterización de la función de proteínas utilizando HaloTag Tecnología

El objetivo general de este procedimiento es aislar eficientemente los complejos de proteínas de las células de mamíferos. Esto se logra seccionando primero las células con una construcción de fusión de etiqueta de halo para expresar la proteína de interés. El segundo paso es cortar las células y capturar covalentemente los complejos de proteínas en la resina a través de una etiqueta halo.

A continuación, los complejos proteicos de la resina se lavan suavemente para eliminar cualquier interacción inespecífica. El paso final es eluir los complejos proteicos de la resina. En última instancia, los tirones de etiquetas de halo se utilizan para aislar y descubrir nuevas interacciones de proteínas de los sistemas de mamíferos.

Los métodos que demostraremos hoy aquí pueden permitir descubrimientos clave en el área de la proteómica funcional, incluida la identificación de nuevas interacciones de proteínas y la determinación de la localización de proteínas dentro de las células. Realizando estos procedimientos hoy en día están dos de nuestros científicos senior, Jackie Mendez y Alen Beek. Primero, para cada fusión o control, prepare un plato de 15 centímetros con 30 mililitros de células a tres o cuatro veces 10 por la quinta célula por mililitro, o una a 1,2 por 10 por el total de siete células por construcción.

Incubar las células durante 18 a 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Después de la incubación, transfecte el constructo con el reactivo de transfección deseado. Después de 24 a 48 horas, después de la transfección, retire el medio y lave suavemente la capa celular con 20 a 25 mililitros de PBS helado, retire el lavado de PBS y agregue de 25 a 30 mililitros de PBS frío de cuatro grados centígrados.

Después de esto, raspe suavemente las células del plato con un raspador de celdas. Una vez que las células se hayan recogido en tubos cónicos, centrifugar las muestras durante cinco a 10 minutos a 2000 veces G y cuatro grados Celsius. Después de desechar el sobrenadante, coloque los gránulos de celda a menos 80 grados centígrados durante un mínimo de 30 minutos o un máximo de seis meses.

Para cada muestra de fusión o control, prepare 18 mililitros de tampón de lavado de equilibrio de resina. Mezcle suavemente la resina invirtiendo el vial para obtener una suspensión uniforme. Para cada experimento de pull-down, dispense 200 microlitros de resina en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Centrifugar la muestra durante un minuto a 800 veces G. Después de la centrifugación. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la resina en el fondo del tubo. Una vez descartado el sobrenadante, añadir 800 microlitros de tampón de lavado de equilibrio de resina a la muestra y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Después.

Centrifugar la muestra durante dos minutos a 800 veces. G.Retire y deseche con cuidado el sobrenadante. Repite los pasos anteriores dos veces más para un total de tres lavados.

Después de descongelar los pellets de celda resus, suspenderlos en 300 microlitros de lisis de mamíferos previamente preparados. Tampón pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego transfiera a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue seis microlitros de 50 x cóctel de inhibidores de proteasa.

A continuación, añade tres microlitros de ADN RQ one e invierte la muestra durante 10 minutos. A temperatura ambiente, las células pasan la muestra de cinco a 10 veces a través de una aguja de jeringa de calibre 25 o 27. Una vez que la muestra se ha centrifugado a 14.000 veces, G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, transfiera el lisado transparente a un nuevo tubo y colóquelo en hielo.

A continuación, añada 700 microlitros adicionales de un tampón XTBS previamente preparado al lisado transparente y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Retire los lavados finales de los tubos de resina equilibrados previamente preparados sin alterar la resina en el fondo de cada tubo. A continuación, añada un mililitro del lisado diluido a cada tubo.

Incubar las muestras mezclándolas en un tubo rotador durante 15 minutos a 22 grados centígrados. Después de esta centrífuga, los tubos de resina se frotan durante dos minutos a 800 veces G. Después de desechar el sobrenadante, agregue un mililitro de tampón de lavado de equilibrio de resina y mezcle bien invirtiendo cada tubo de resina a mano varias veces después de la centrifugación de los tubos de resina durante dos minutos a 800 veces. G.Deseche los lavados una vez que se hayan repetido los pasos de lavado anteriores y tres veces.

Agregue un mililitro de tampón de lavado de equilibrio de resina a los tubos después de incubar las muestras a 22 grados centígrados durante cinco minutos con rotación constante, centrifugue los tubos de resina durante dos minutos a 800 veces G y deseche los lavados. En este punto, suspende la resina de cada muestra en 50 microlitros de tampón de elución SDS. Agite los tubos a temperatura ambiente con un agitador automático de tubos de microcentrífuga durante 30 minutos.

Después de la centrifugación durante dos minutos a 800 veces G.Transfiera los EIT a tubos nuevos para su análisis Para el Western blot o el gel de tinción de plata, cargue de cinco a 10 microlitros de las muestras en un gel desnaturalizante SDS para espectrometría de masas. Almacene 40 microlitros de cada muestra a menos 20 grados centígrados para futuros análisis. En un cubreobjetos de ocho pozos para cada proteína de fusión o placa de control, 400 microlitros de células HELOC en su medio apropiado en cada pocillo a una densidad de una a dos veces 10 a la quinta célula por mililitro.

Después de incubar las células durante 18 a 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de CO2, transfectarlas con el reactivo de transfección deseado después de 18 a 24 horas, después de la transfección diluir el ligando TMR de uno a 200 en los medios celulares apropiados. Luego agregue 100 microlitros de esta solución a cada pocillo y mezcle suavemente. A continuación, incube las células transfectadas que contienen el ligando durante 15 minutos a 37 grados centígrados y 5% de CO2.

Cuando termine, aspire el medio que contiene el ligando y reemplácelo con 500 microlitros del medio apropiado que carezca de ligando de etiqueta de fusión de proteínas, que se haya advertido previamente a 37 grados Celsius. Una vez que se ha repetido el paso anterior dos veces para un total de tres lavados. Vuelva a colocar las células en la incubadora durante 30 minutos.

Después de la incubación de 30 minutos, aspire el medio y reemplácelo con 500 microlitros de medio apropiado, que se haya precalentado a 37 grados centígrados. A continuación de esta imagen, se observan las células en un microscopio utilizando los parámetros de adquisición apropiados utilizando el protocolo halo, BRD cuatro y la expresión de control de etiqueta halo. La expresión de la proteína de fusión también puede detectarse mediante Western blots con anticuerpos anti etiqueta halo o anticuerpos contra la proteína cebo.

Los geles de tinción de plata de réplicas biológicas de Halo BRD cuatro y pulldowns de control demuestran una alta reproducibilidad y muestran proteínas que interactúan con la proteína BRD cuatro. La gran abundancia de componentes de PTF B, CDK nine y Cyclin T, así como de la proteína BRD nine, confirma la captura específica de los complejos BRD four. Los geles mostraron otras proteínas identificadas como potenciales interactores de BRD 4.

Como ejemplo adicional, se realizaron aislamientos complejos con la proteína Halo HD one. En este caso, se utilizó la proteasa TEV para escindir en una región enlazadora entre la etiqueta Halo y la H DAC uno, liberando cantidades significativas de la proteína de cebo HD one. Como se observa.

Las muestras pulldown de HD one mostraron altos niveles de actividad de HD one, que fue inhibida por el inhibidor de HDA saha. Para demostrar aún más la especificidad, no se observó inhibición de la HDA con el inhibidor de la familia de las sirtuinas EX 5 27 y no se detectó ninguna señal con el tampón solo. Las células He A transfectadas con Halo BRD cuatro y Halo HDAC uno se marcaron con fluorescencia con TMR.

Las imágenes de ligandos mostraron que ambos se localizaban en el núcleo y demuestran que la etiqueta no alteraba la localización celular fisiológica de sus socios de fusión. Por lo tanto, siguiendo este procedimiento, las proteínas aisladas y sus socios interactuantes pueden identificarse y analizarse más a fondo utilizando una variedad de métodos analíticos, como la espectrometría de masas y la transferencia occidental.