Estrategia de análisis bioaformático y bioinformática basada en biosensores para la validación global de interacciones entre fármacos y proteínas

La identificación de las interacciones de proteínas de moléculas pequeñas es esencial para la investigación y el desarrollo de fármacos, así como para fomentar nuestra comprensión de los mecanismos patológicos que subyacen a los DTC del virus. Este método facilita el biopanning de alto rendimiento de péptidos de reconocimiento de fármacos y la validación global de los sitios de unión de fármacos en proteínas para fármacos de moléculas pequeñas de interés. Para preparar un chip sensor QCM, conecte un chip sensor cerámico al oscilador de un aparato QCM de 27 megahercios y registre la frecuencia intrínseca en la fase aérea antes de la inmovilización de moléculas pequeñas.

Después de la grabación, separe el chip y agregue con cuidado una gota de 20 microlitros de una solución derivada de molécula pequeña de un milimolar en etanol al 70% para crear una capa mono autoensamblada en el electrodo de oro del chip sensor. Coloque el chip en una placa de Petri forrada con tejido humedecido, protéjalo de la luz durante una hora a temperatura ambiente antes de lavar suavemente la superficie del electrodo con agua ultrapura. Seque la viruta con una aplicación suave de aire y cargue la viruta en el aparato QCM.

Después de una hora registrar la reducción de la frecuencia en la fase aérea para medir la cantidad de la pequeña molécula que se ha inmovilizado. Para el biopaneo de la biblioteca de fagos T7, coloque una cubeta con un agitador magnético dedicado en el biosensor QCM configurado a 1000 revoluciones por minuto y agregue ocho mililitros de tampón de reacción a la cubeta Mientras se agita el tampón, conecte el chip del sensor QCM al oscilador Mantenga presionado el brazo del oscilador para sumergir el chip en el tampón y comience a monitorear la frecuencia QCM. Cuando el gramo del sensor se equilibra a alrededor de tres hercios por minuto de deriva de frecuencia, inyecte ocho microlitros de una biblioteca de fagos T7 en la cubeta y marque el punto de inyección en el sensor.

Monitorice la reducción de frecuencia causada por la unión de los fagos T7 a la pequeña molécula inmovilizada en la superficie del electrodo de oro. Después de 10 minutos, detenga el monitor de frecuencia QCM y levante rápidamente el oscilador para quitar el chip sensor del lote, separe el chip sensor del oscilador y retire el búfer del chip. Coloque el chip sensor seco en una placa de Petri húmeda y agregue una gota de 20 microlitros de celdas huésped de E-coli en fase logarítmica en el electrodo de oro.

Incubar la placa en un mezclador de microplacas de 96 pocillos a 37 grados centígrados y de 1000 a 1500 revoluciones por minuto durante 30 minutos, protegido de la luz para mejorar la recuperación de los siete fagos T7 unidos. Al final de la incubación, transfiera los 20 microlitros de suspensión de E-coli a 200 microlitros de medio LB. De acuerdo con el procedimiento general, realice el aislamiento de la placa del fago en el medio y la secuenciación del ADN que codifica el fármaco, reconociendo las secuencias peptídicas que se muestran en cada cápside del fago.

Como mantenimiento posterior al chip sensor, use un hisopo de algodón empapado en una solución de dodecil sulfato de sodio al 1% para limpiar la superficie del electrodo, lavar la superficie de oro con agua ultrapura y secar el electrodo con aire. A continuación, trate la superficie del electrodo con cinco microlitros de solución de Paraná recién preparada durante cinco minutos, seguido de un lavado con agua ultrapura y un secado al aire dos veces. Para realizar análisis bioinformáticos con RELIC, descomprima el programa RELIC independiente en una PC con sistema operativo Windows y utilice las secuencias de aminoácidos de los 15 péptidos o proteínas individuales o múltiples de los fármacos seleccionados en cada archivo de texto con formato A rápido.

Coloque los archivos de texto necesarios en la carpeta de AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con o fast A scan. Haga clic en cada archivo ejecutable de la carpeta independiente para abrir la versión personal de FTN 95 e introduzca el nombre de archivo y la extensión apropiados en la línea de comandos para ejecutar cada programa y obtener el archivo de formato de texto resultante. Aquí se muestran los archivos de formato de texto resultantes obtenidos.

A continuación, exporte el archivo de texto resultante a una hoja de cálculo para generar un gráfico de contenido de información o puntuaciones de similitud acumulativas calculadas mediante un golpe de unos 62. Utilizando esta estrategia, se han identificado con éxito sitios de unión de moléculas pequeñas individuales y múltiples en las proteínas diana para seis fármacos de moléculas pequeñas. Por ejemplo, se identificaron 29 péptidos que reconocen el fármaco clínicamente aprobado irinotecán inmovilizado como una monocapa autoensamblada mediante biopaneo de un ciclo basado en un biosensor QCM. La alineación posterior por pares de los 29 péptidos y la acetilcolinesterasa produjo puntuaciones máximas para residuos de aminoácidos específicos que eran consistentes con los que componían el sitio de unión del irinotecán.

Este mismo subconjunto de péptidos también se identificó con éxito en las proximidades de la tríada catalítica en la carboxilesterasa, lo que indica que estos aminoácidos forman un andamio para el reconocimiento de irinotecán durante la desesterificación. Los 27 péptidos que reconocen el medicamento contra la gripe Oseltamivir que cubre la superficie del electrodo de oro del chip del sensor QCM detectaron con éxito el sitio de unión del oseltamivir en la neuraminidasa. Este sitio de unión consiste en bucles peptídicos no estructurados que potencialmente experimentan un movimiento dinámico mientras se acoplan con oseltamivir.

Los medicamentos, las regiones, los productos químicos, los bacteriófagos recombinantes y las bacterias son coches fúnebres biológicos y deben manipularse de acuerdo con el protocolo de ganancia de cultivo. Recuerde usar siempre guantes, gafas y una bata de laboratorio por seguridad. Siguiendo este procedimiento, las proteínas diana de diversos fármacos pueden validarse globalmente en humanos, virus patológicos e incluso plantas para comprender los mecanismos moleculares y la posible eficacia terapéutica de los fármacos de interés.