Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un método conocido como purificación de afinidad en tándem para aislar a los socios de unión a proteínas. Hola, soy dLAN Bailey de la sección de Virología del Imperial College de Londres. En nuestro laboratorio, trabajamos en las interacciones entre el huésped y el virus para diferentes miembros de la familia de virus.

La identificación de proteínas que interactúan con otras proteínas celulares o virales es un excelente punto de partida para investigar la interacción entre el virus y su huésped durante la infección. En este video, explicaré un enfoque que usamos en nuestro laboratorio, la purificación en tándem y electrónica o el etiquetado de grifos. La etiqueta Tap utilizada en este estudio es una etiqueta N terminal que consta de dos unidades de proteína G y un péptido de unión a estreptococo adina.

Estos están separados por una secuencia de escisión de la proteasa TEV que permite la elución específica de la proteína cebo. En este ejemplo, murino, EIF cuatro E está en el extremo C de esta construcción de fusión. El protocolo de etiquetado de grifos es un procedimiento de seis pasos.

Después de la transfección y la generación de líneas celulares, las células son inducidas a expresar la proteína de la etiqueta abate antes de ser colocadas en un tampón de lisis suave. Se utilizan dos pasos de purificación por afinidad y dos soluciones específicas para purificar el cebo y cualquier socio potencial que interactúe para generar líneas celulares. Las células HEC 2 93 deben transfectarse con la codificación del vector de expresión P met four.

A continuación, se seleccionan las células de proteína de cebo marcadas con grifo con cien microgramos por milésima de hygromicina B. Dado que el plásmido se mantiene episo, no es necesario aislar clones específicos. Se inducen 10 flacos confluentes de células mediante tratamiento con cloruro de cadio 10 micromolares durante 16 horas antes de ser raspados en el medio. A continuación, las células suspendidas se transfieren a tubos de 15 M y las células se peletizan por centrifugación.

A continuación, estas células se lavan tres veces con PBS helado antes de ser finalmente granuladas. El segundo paso de las células de lisis celular se coloca en cinco milésimas de pulgada de tampón de lisis en frío mediante pipeteo repetido antes de dejarlas en hielo durante cinco minutos. Para garantizar una lisis eficiente, las células se inyectan a través de una aguja roma de calibre estrecho y se congelan.

El estado resultante se asigna en tubos de 1,5 milésimas de pulgada y celdas unli y los desechos se eliminan por centrifugación. Cabe destacar que el tamaño de los gránulos se reduce notablemente después de este paso de centrifugación. Luego, los sobrenadantes lisados se combinan en un tubo Falcon de 15 milésimas de pulgada y se pasan a través de un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar cualquier residuo adicional.

Se debe tomar una alícuota de 50 microlitros de este lisado para su posterior análisis. Esta muestra se denomina muestra uno. Paso tres, unión a IgG Aeros de conejo.

En esta etapa del protocolo, las etiquetas de proteína G son inmunoprecipitadas por IgG aros de conejo. Para asignar cuentas de aros, retire el extremo de la punta del simio. Esto ayuda a evitar dañar las cuentas.

Vuelva a suspender suavemente la solución de IgG aro de conejo girando la botella antes de quitar los aros a un tubo de 15 milésimas de pulgada. Lave los aros tres veces en tampón de lisis enfriado utilizando centrifugación a baja velocidad para clarificar las perlas en cada paso. Las perlas de IgG de conejo granuladas deben ser visibles después de la centrifugación.

Después de cada paso, retire con cuidado el tampón sin alterar las cuentas. Una vez completado el lavado final, agregue el lisado filtrado y clarificado a las perlas empaquetadas e incube durante tres horas o toda la noche. Prefería a cuatro grados C usando un mezclador giratorio.

Después de la inmunoprecipitación, centrifugar las perlas de agros y retirar el sobrenadante para su posterior análisis. Si es necesario, puede usar una punta de construcción fina para eliminar cualquier líquido restante de este tubo. Este sobrenadante es la muestra de dos pasos cuatro de escisión de la proteasa TEV.

En este paso, el cebo se separa de las etiquetas de proteína G. Este paso permite la escisión específica de la proteína del cebo de manera efectiva, una etapa de elución de los conejos IgG aros inmunoprecipitación. Prepare la mezcla de escisión de TEV y agréguela a las cuentas de aros usando la punta de simio sin su extremo, transfiera esta mezcla a un tubo de microcentrífuga siliconado e invierta para mezclar los aros en suspensión antes de la incubación nocturna a cuatro grados C, retire un alió de esta reacción de escisión de TEV para su análisis.

Esta es la muestra tres. La incubación nocturna en el mezclador giratorio debe permitir que la reacción TEV progrese hasta casi completarse. Paso cinco, unión para inmovilizar las cuentas de adin estrepto.

En este paso, el cebo Cleve y cualquier posible socio vinculante se purifican por afinidad a partir de la solución. En primer lugar, centrifugar la reacción de escisión de TEV que contiene las perlas de IgG aros de conejo. Para pellet los aros, retire un OTT del sobrenadante clarificado para su análisis.

Esta es la muestra cuatro. Retire con cuidado todo el sobrenadante restante, que contiene la proteína del cebo, y colóquelo en un tubo nuevo. De nuevo, usa bien.

Construya puntas de peppe para eliminar todo el sobrenadante posible. Conserve las perlas de IgG aros de conejo para su posterior análisis. Esta es la muestra cinco.

Para evitar daños a las perlas de adain estreptococo, retire el extremo de la punta de una mascota. Vuelva a suspender suavemente las cuentas y retire un alicó a un tubo siliconado. Lavar el estreptococo teniendo en perlas con tampón S, clarificando por centrifugación a baja velocidad.

Después de cada lavado. Después de cada lavado, retire con cuidado el tampón. Las cuentas de Strept adin son muy pequeñas y se pueden desplazar fácilmente incluso cuando se usan finas.

Elabora consejos para mascotas. Después de que se hayan lavado las cuentas de adin estreptadas. Agregue el sobrenadante de la reacción de escisión de TEV a estas perlas e incube la reacción durante tres horas o toda la noche a cuatro grados C, usando un mezclador giratorio.

Después de la incubación, la centrífuga ha estreptado las perlas y ha eliminado la suspensión. Esta es la muestra seis. De nota.

La proteína Beit ahora está asociada con las cuentas restantes en el tubo. Lave las perlas de estreptavidina que contienen su proteína de cebo con tampón de lisis. Para eliminar cualquier proteína contaminante adicional, retire la solución de lavado restante de las perlas y déjelas en hielo.

Paso seis, elución de biotina. En este paso, se agrega biotina a las perlas de estreptavidina. La interacción entre la biotina y las perlas de estreptavidina desplaza el cebo, que vuelve a la solución.

Agregue la solución de biotina directamente a las perlas e inviértala para mezclar. Incubar la reacción a cuatro grados C durante tres horas o toda la noche utilizando una centrífuga mezcladora rotativa, la mezcla aeros de biotina y recoger cuidadosamente la mezcla en un tubo nuevo. Este es su EIT final conocido como muestra siete.

El resto de las cuentas de estrepto son la muestra ocho. Debido a su baja concentración de proteína, este eluido final debe concentrarse antes del análisis. Esto se logra utilizando pesos moleculares bajos, columnas de centrifugación cortadas, reducción del volumen mediante el monitoreo regular del proceso por centrifugación.

Esta muestra concentrada se puede dividir y analizar en geles de página SDS mediante kumasi y tinción de plata. Si las muestras se van a analizar por espectrometría de masas, aconsejamos utilizar geles comerciales prefabricados. A continuación, se pueden extraer bandas individuales y identificar las proteínas mediante espectrometría de masas.

En este caso, el cebo era murino, EIF para la proteína E. La ventaja del sistema tap es que tiene la capacidad de expresar su proteína de interés en una línea celular en particular y, dependiendo de la línea celular que le interese, también le brinda la capacidad de expresar la proteína a niveles relativamente bajos. Usted decide hacerlo, y todas las modificaciones postraduccionales y la localización se conservan, por lo que a menudo puede purificar el complejo nativo.