Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la composición y funcionalidad del segmento de nefrona en el riñón de pez cebra adulto. Esto se logra inyectando primero dextrina marcada con fluorescencia en un nido que ata peces cebra. El segundo paso es extraer y fijar el riñón para preparar el tejido para los métodos de etiquetado posteriores.

A continuación, el riñón se blanquea para eliminar la pigmentación y luego se tiñe para marcar con fluorescencia los segmentos de nefrona deseados. Los resultados se obtienen mediante inmunofluorescencia, microscopía y/o imágenes de campo claro que permiten la visualización de la anatomía del riñón en función de la tinción o tinciones seleccionadas. Los siguientes métodos de etiquetado pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo del riñón con respecto a la anatomía de los órganos y se pueden utilizar para estudiar la composición de las nefronas y evaluar la funcionalidad renal tanto antes como después de un evento de lesión.

Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia el estudio de las anomalías genéticas en la formación del riñón adulto y también podrían aplicarse para evaluar el estado renal durante el modelado de enfermedades crónicas. Para comenzar, decantar la solución de un pez anestesiado y colocar cuidadosamente al animal en un lado ventral del molde de esponja húmedo. A continuación, llene una jeringa de insulina con 20 microlitros de solución madre de dextrina descongelada.

Coloque la aguja de modo que la inserción se produzca en un ángulo poco profundo en la línea media ventral del abdomen. Para evitar inyectar ligeramente los órganos, levante la aguja justo después de inyectar para levantar la pared del cuerpo y crear un espacio en el que inyectar la solución. Después de la inyección, regrese suavemente el pez al tanque para recuperarse de la anestesia.

Para empezar, decanta cualquier solución extra de un pez anestesiado y colócala sobre un pañuelo de papel o una toalla de papel. Después de extirpar la cabeza y los órganos internos, use agujas de disección súper finas para abrir las paredes del cuerpo. Localiza el órgano renal que está adherido a la pared dorsal del animal.

Use pinzas finas para separar el riñón de la pared dorsal. Coloque suavemente el riñón en un frasco de vidrio de cinco mililitros que contenga un XPBS y lávese tres veces durante cinco minutos cada una. Extraiga el riñón con una pipeta de transferencia y colóquelo en un vaso limpio Deslice con una o dos gotas de un XPBS.

Use pinzas finas para aplanar el riñón en el portaobjetos, asegurándose de que ningún tejido se haya curvado o volcado sobre sí mismo. Se puede utilizar una herramienta de alambre de tungsteno para hacer pequeñas incisiones en el tejido conectivo para facilitar la posición plana del riñón. A continuación, coloque pequeños trozos de arcilla para modelar en cada esquina de un cubreobjetos de vidrio de 18 por 18 milímetros.

Coloque lentamente el cubreobjetos en el riñón, manteniendo un ligero ángulo. Para minimizar las burbujas de aire atrapadas, agregue una gota adicional de un XPBS para llenar el espacio entre el cubreobjetos y la corredera si es necesario. Un grupo separado de peces cebra son sacrificados y remojados en fijador durante la noche.

Cuando esté listo, use pinzas finas para separar cuidadosamente el riñón de la pared dorsal del cuerpo y coloque el órgano en un frasco de vidrio. Lave el riñón disecado tres veces con tres a cinco mililitros de un XPBS con 0.05%tween durante cinco minutos cada uno. A continuación, retire la solución de PBS y enjuague el riñón con tres mililitros de una solución de sacarosa al 5% durante 30 minutos.

Pasado este tiempo, sustituya la solución por tres mililitros de sacarosa al 30% y almacene durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Retire la solución y lave el riñón dos veces antes de agregar de tres a cinco mililitros de solución blanqueadora. Para eliminar la pigmentación de los melanocitos presente en el órgano renal, coloque el vial de vidrio en un rotador y observe atentamente cómo desaparece la pigmentación.

La despigmentación suele durar aproximadamente 20 minutos, pero en ocasiones puede tardar hasta 60 minutos. Si la solución blanqueadora se deja actuar durante demasiado tiempo, puede producirse una desintegración y, por lo tanto, se recomienda controlar la muestra cada 10 a 15 minutos para comprobar la integridad cuando la pigmentación se haya eliminado del lavado renal dos veces e incubar con una solución de PFA al 4% durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire la solución de PFA al 4% y lave el riñón tres veces después del último lavado a tres a cinco mililitros de solución bloqueante e incube el riñón a temperatura ambiente durante dos horas.

Una vez finalizado el bloqueo, proceda directamente al protocolo de tinción seleccionado. Retire la solución bloqueante y lave el riñón tres veces antes de dejar que el riñón se remoje en un XPBS durante al menos 10 minutos. Durante este tiempo, transfiera el riñón a una placa de cultivo de 12 o 24 pocillos.

Reemplace el XPBS con suficiente solución de sustrato de fosfatasa alcalina de trabajo para cubrir la muestra y coloque la muestra en un rotador durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de este tiempo, detenga la reacción lavando el riñón en una solución tampón de lavado de fosfatasa alcalina. Enjuague el riñón con tres cambios de solución tampón de lavado durante 10 a 15 minutos.

A continuación, retire la solución tampón de lavado y coloque el riñón en un vaso limpio. Deslice el medio de montaje de fosfatasa incluido en el kit de etiquetado. Visualice el riñón teñido con fosfatasa alcalina utilizando un microscopio estereoscópico o un microscopio compuesto con un juego de filtros Debbie enganchado.

Primero, prepare una solución de DBA de trabajo de 200 microlitros diluyendo DBA en un XPBS. Reemplace la solución de PBS con 200 microlitros de solución de DBA y coloque la muestra en un rotador durante una hora a temperatura ambiente. Después de este tiempo, retire la solución de DBA y lave el riñón tres veces con tres a cinco mililitros de un XPBS durante cinco minutos cada uno.

Retire el XPBS y monte el riñón en un portaobjetos de vidrio limpio. Como se demostró anteriormente, visualice los segmentos distales del riñón teñidos con DBA utilizando un filtro Trixie estándar o rojo de Texas establecido en un microscopio estereoscópico fluorescente o un microscopio compuesto. En esta imagen de campo claro de un riñón sin blanquear, la pigmentación negra corresponde a la población dispersa de melanocitos.

Aquí se visualizan los segmentos de PCT de nefrona tres días después de la inyección de dextrina. El recuadro contiene una imagen de una sola nefrona con melanocitos. Esta imagen muestra un riñón adulto después de la eliminación de la pigmentación de los melanocitos.

Estas imágenes representativas muestran ligeras variaciones morfológicas entre los segmentos de PCT, mientras que muchos PCT de nefrona están fuertemente enrollados. Otras nefronas contienen regiones PCT que tienen un enrollamiento mínimo: dextrina azul en cascada de dextrina, amarillo de Lucifer y rubí fluorado de dextrina etiquetan preferentemente los segmentos de PCT en las nefronas renales, tanto el azul en cascada de dextrina como el amarillo de Lucifer muestran un marcaje inespecífico con un fondo mucho más alto observado en los riñones tratados con amarillo de Lucifer. Por el contrario, la dextrina fluoro rubí mostró un fondo drásticamente reducido con un intenso etiquetado PCT.

Un riñón adulto teñido por el deseo de detectar un marcador específico del tipo de célula transportadora de PCT muestra un patrón de expresión característico de la captación de dextrina con una distribución de varios dominios de PCT en bucle muy enrollados, así como tramos de PCT más alargados que muestran un diámetro amplio y constante. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo etiquetar con éxito segmentos de nefrona dentro del riñón de pez cebra adulto, como el túbulo proximal con fosfatasa alcalina y el túbulo distal médico con DBA. No olvide que trabajar con 4% de paraldehído puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar un abrigo, guantes y anteojos mientras se realiza este procedimiento.