Name: Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a evaluar la composición y función de nefronas en riñones adultos de pez cebra mediante inyección de dextrano fluorescente, tinción específica e inmunofluorescencia. Estas técnicas permiten estudiar la anatomía renal y regeneración.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de RAW de las siguientes opciones: Institutos Nacionales de Salud subvenciones K01 DK083512, DP2 OD008470, y R01 DK100237; March of Dimes Basilio O&#39;Connor arranque Académico concesión de una subvención # 5 FY12-75; poner en marcha los fondos de la Universidad de Notre Dame College de Ciencia y el Departamento de Ciencias Biológicas; y un regalo generoso de la Universidad de Notre Dame de Elizabeth y Michael Gallagher, en nombre de la familia Gallagher para fomentar investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a los funcionarios del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su dedicación excepcional en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia pez cebra. Por último, agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio de investigación para sus comentarios, discusiones y puntos de vista sobre este trabajo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito los métodos que permiten la visualización de los componentes del segmento de nefronas en el pez cebra adulto. La inyección de conjugados de dextrano fluorescentes permite etiquetado PCT preferencial debido a las propiedades endocíticas de estas células del túbulo proximal 30,38. Este método se puede realizar con gran flexibilidad debido a la existencia de dextranos que se puede obtener con un grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Además, el uso de dextranos-lisina fijable es una forma especialmente conveniente para etiquetar PCT segmentos, ya que no se requieren procedimientos de etiquetado secundarias. Esto permite la detección de señal relativamente sencillo y es compatible con muchos otros marcadores fluorescentes, immunolabeling, y el uso de líneas transgénicas reportero. Etiquetado de fosfatasa alcalina también marca el túbulo proximal, con una fuerte reactividad en el PCT y reactividad ligeramente más débil en el PST. Finalmente, la tinción DBA permite el etiquetado de los segmentos tubulares distales, que muestran un characteristic ramificado morfología. Varias moléculas de lectina, que son proteínas de unión a azúcar de origen no inmune, se han utilizado ampliamente para distinguir segmentos de nefrones de mamíferos 47. Es interesante que DBA en el pez cebra se correlaciona con segmentos del túbulo distal, ya que se utiliza para marcar los conductos colectores en los riñones de mamíferos 47. Tomados en conjunto, estos métodos pueden ser utilizados en diversas combinaciones para documentar la composición y la función renal. Puesto que todos estos métodos se pueden utilizar en las preparaciones de riñón enteros, proporcionan herramientas para evaluar la estructura y la función de nefronas en todo el órgano, sin depender enteramente en el uso de más tiempo, los métodos tediosos, por ejemplo, el trabajo cryosection y immunolabeling. Sin embargo, las manchas descritas en este artículo son métodos viables en sección criogénica. Análisis criosección genera muestras (en comparación con todo el montaje) que son más adecuados para la inmunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, aunque, por supuesto, este tipo de análisis requiere la disponibilidad de anticuerpos primarios adecuados. Lamentablemente, uno de las principales limitaciones en el trabajo con el modelo animal pez cebra sigue siendo la escasa disponibilidad de anticuerpos. Así DESEO sigue siendo el más utilizado, es decir, &#39;go-to &quot;, procedimiento para el análisis de la expresión génica. DESEO utilizando reacciones de sustrato BCIP, NBT, y / o INT para producir precipitados morados o rojos no es compatible con la tinción fluorescente en cryosections. Una opción sería para invocar el uso de la detección de WISH fluorescente, un procedimiento que ha sido optimizado para muestras de embriones de pez cebra y podría ser adaptado para su uso con el riñón adulto. La descripción de los métodos en este artículo de vídeo debería permitir una mayor experimentación con técnicas como DESEOS fluorescente en combinación con las líneas de pez cebra transgénico en el que los segmentos individuales están etiquetados con un reportero como eGFP o mCherry. Alternativamente, los métodos descritos aquí COULd ser probado en combinación con otros colorantes vitales, por ejemplo, otras lectinas. De esta manera, una mayor adaptación y ampliación de los métodos descritos aquí se pueden invocar para satisfacer las necesidades del investigador para preparaciones enteras renales montaje y análisis. Como tales, estos métodos tienen un amplio potencial para la aplicación con el modelo de pez cebra para los estudios de regeneración en curso y también en el modelado de la enfermedad genética. Hay una necesidad apremiante para la investigación y los tratamientos innovadores para las aflicciones renales. Millones de personas sufren de algún tipo de enfermedad renal cada año que resulta de causas congénitas, agudos y / o crónicos. Además, la prevalencia de la enfermedad renal sigue aumentando en todo el mundo, por lo que estas enfermedades un problema de salud pública mundial 14,15. Tratamientos como la hemodiálisis están disponibles mediante el cual una máquina de diálisis externa sirve para extraer la sangre de los desechos metabólicos del paciente si sus riñones no son capaces de realizar este papel. Desafortunadamente, Esta intervención tiene limitaciones, como el tratamiento continuo es necesario para la supervivencia. Por otra parte, los pacientes necesitaran un trasplante de riñón, que puede tomar años para recibir una vez que un paciente se coloca en una lista de espera. Incluso después de la obtención de un trasplante de riñón, muchos pacientes sufren efectos adversos como resultado del procedimiento y deben luchar contra estos efectos para el resto de sus vidas. Estas dificultades ponen de manifiesto la necesidad seria para el desarrollo de nuevos tratamientos para ayudar a prevenir ya sea enfermedad del riñón o tal vez para aumentar la regeneración de tejidos 8,16,52,53. Dadas las limitaciones éticas evidentes del uso de sujetos de prueba humanos en laboratorios biomédicos, los modelos animales son esenciales para el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana y para la prueba de nuevos tratamientos. Como resultado de su similitud y proximidad anatómica evolutiva, el ratón se ha convertido en el modelo más ampliamente utilizado de la enfermedad humana 45. Sin embargo, hay ciertas limitaciones con este animal, incluído,ing incapacidad para visualizar el desarrollo de órganos in vivo y la practicidad de completar pantallas genéticos a gran escala. El pez cebra es un organismo relevante y útil modelo para el estudio del desarrollo de órganos y el modelado de la enfermedad humana 45,46. En lo que respecta a las enfermedades humanas, existen homólogos funcionales en el pez cebra para casi el 70% de todos los genes humanos 54,55. Trabajos recientes han puesto de manifiesto la utilidad de pez cebra para muchas áreas de la investigación renal 31,37,56. Los estudios de regeneración y reparación en el pez cebra después de AKI sugieren que la regeneración del epitelio del túbulo y neonephrogenesis son dos procesos que se producen y se superponen a lo largo de la regeneración timecourse 30,37. El uso de un llamado gentamicina antibiótico aminoglucósido se ha utilizado como un paradigma de lesión a través del cual para estudiar los resultados de AKI en 29,30,37 adultos de pez cebra. Durante un período de dos semanas después de una lesión de aproximadamente de gentamicina, el Tubul proximales regeneran, y mientras tanto nuevas nefronas se forman a lo largo del órgano 29,30,37. En general, los mecanismos que regulan la regeneración epitelial siguen siendo muy controvertidos. En un mecanismo propuesto del proceso de reparación, no es el evento inicial de lesión aguda seguida de un desprendimiento de las células muertas en el lumen. A continuación, hay una serie de de-diferenciación, proliferación, y eventos de migración, después de lo cual las nuevas células se diferencian, repoblación de la membrana basal heridos y restaurar la función a la zona lesionada. Por otra parte, otros estudios han sugerido que las células de reemplazo se derivan de células madre / progenitoras que residen dentro de los túbulos nefrona. En cuanto al proceso de neonephrogenesis en el pez cebra, los agregados celulares se han observado siguiente AKI por inyección de gentamicina 29,30. Estos agregados posteriormente maduran hasta convertirse en nuevas nefronas que sondean en los túbulos ya existentes 29,30. El hilo común que une nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis es su factor de misterio enorme: en la actualidad no son exponencialmente más preguntas acerca de cómo se producen estas hazañas regenerativas que existen puntos de vista disponibles. Hasta la fecha, sin embargo, varias líneas interesantes de evidencia apoyan la noción de que la investigación de regeneración renal utilizando el pez cebra puede de hecho brindar conocimientos comparativos pertinentes en AKI humano que también puede tener directa traslacional potencial 56-58. Química de detección para identificar pequeñas moléculas que aumentan la proliferación de células progenitoras renales en el embrión de pez cebra recientemente llevado a la identificación de la -butanoato inhibidor de histona desacetilasa metil-4-(feniltio) (m4PTB) 56,57. La administración de este compuesto para las larvas de pez cebra con inducida por gentamicina-AKI reveló que la supervivencia larval aumenta y que la proliferación tubular renal se mejoró 56,58. Cuando los ratones con lesión renal aguda inducida por isquemia moderada fueron tratados con m4PTB, su recuperación se aceleró en asociation con una reducción tanto en la atrofia y el ciclo celular tubular detención de la proliferación de las células tubulares renales 58. Estos hallazgos sugieren que las vías responsables para el desarrollo normal del pez cebra renal y / o la respuesta regenerativa a AKI se conservarán con los mamíferos 56. Así, mientras que se necesitan más estudios para desmenuzar los mecanismos de regeneración-es decir, para identificar las vías de señalización que intervienen y comprender su interacción-el pez cebra proporciona una vía prometedora para perseguir esta meta importante en el campo de la nefrología. Herramientas tales como las etiquetas de células nefrona descritos en este protocolo representan un grupo de ensayos que pueden ser utilizados para evaluar la composición y la funcionalidad renal en modelos AKI. Además, se pueden aplicar para caracterizar modelos transgénicos de la enfermedad renal y pueden proporcionar maneras de identificar agentes terapéuticos químicos capaces de promover la restauración de la estructura después de la presa nefrona renalla edad.

El riñón es un órgano complejo que cumple con una multitud de funciones fisiológicas en el cuerpo. La función principal del riñón es la excreción de desechos metabólicos, y esta tarea está estrechamente entrelazada con el mantenimiento de la homeostasis de fluidos. El riñón realiza estos trabajos mediante el filtrado de la sangre y la formación de la orina, mientras que concomitantemente regulación de la presión arterial, los niveles de electrolitos y el equilibrio ácido-base. Túbulos epiteliales altamente especializadas, llamadas nefronas sirven como unidad funcional básica del riñón 1,2. En los vertebrados adultos, nefronas se organizan típicamente en una disposición en espiral que rodea herméticamente un sistema de drenaje centralizada, permitiendo así que para muchos túbulos tapen la bastante pequeño órgano. Por ejemplo, cada riñón humano puede contener más de 1 millón de nefronas 3. Otros mamíferos como el ratón son en el orden de 8 a 10.000 nefronas por riñón 4. El grado de complejidad renal difiere entre estos mamíferos y otros vertbrados debido a las variaciones en el número total de nefronas y su diseño arquitectónico dentro del riñón. Especies de vertebrados forman hasta tres estructuras renales sucesivas durante el desarrollo, y cada formulario muestra el aumento de la complejidad en lo que respecta a la dotación de nefronas y disposición: los pronefros, mesonefros y metanefros. La última estructura renal que deben conservarse sirve como el riñón adulto órgano-típicamente un mesonefros o un metanefros 2. Cada forma de riñón, sin embargo, tiene una composición basada en nefrona 2. La nefrona es el caballo de batalla de los riñones y es responsable de la filtración de la sangre junto con la secreción y reabsorción de metabolitos. Las nefronas son estructuras tubulares simples compuestas de células epiteliales y tienen una organización segmentaria, en el que los dominios discretos, altamente especializadas de los epitelios diferenciados realizar tareas específicas. En el orden del flujo de filtrado a través de las nefronas, normalmente hay tres partes principales que comprise cada unidad: (1) el corpúsculo renal, (2) un túbulo con proximal, intermedio y segmentos distales, y (3) un conducto colector 1. El túbulo proximal es responsable de la reabsorción de solutos orgánicos, principalmente glucosa y los aminoácidos 1. El túbulo intermedio (o asa de Henle) es un importante sitio de la sal y el agua la regla 1. Finalmente, ajuste fino de la sal y otros iones produce en el túbulo distal y el conducto colector y está muy regulada por el sistema endocrino 1. A partir de ahí, el filtrado viaja a través del uréter y de la vejiga, en última instancia, saliendo el cuerpo como un producto de desecho 1. La pérdida de la función renal puede deberse a multitud de causas que impiden la actividad normal de nefronas. Estas causas pueden ocurrir durante el desarrollo del riñón, por ejemplo, defectos congénitos que llevan a la malformación de nefronas 5 o causas de los diferentes tipos de lesiones (derivada de tanto genéticos como environmeorígenes NTAL). Lesiones adquiridas son una categoría como la lesión renal aguda (IRA) o insuficiencia renal crónica (ERC). AKI implica una pérdida abrupta de la función renal, a menudo como resultado de la isquemia o la toxina de exposición 6,7. En los mamíferos, la reparación del epitelio nefrona es posible después de este tipo de lesiones 8, y muchas personas presentan la restauración completa de la función renal después de AKI. Sin embargo, AKI también se asocia con una alta morbilidad y mortalidad que se han reportado en un amplio 30 - rango de incidencia del 70% 6,7. ERC, en cambio, está asociada con la pérdida progresiva de la función renal que resulta de años de daño prolongado, típicamente asociado con la fibrosis 8,9. Además, existe una interacción entre la IRA y ERC, como cualquiera puede predisponer a un individuo a otro 10-12. Por ejemplo, aquellos que han sufrido de AKI son más susceptibles a la enfermedad renal crónica e incluso la muerte 13. La incidencia de la enfermedad renal, tanto en los EE.UU. y en todo el mundo, ha alcanzado epideproporciones de micrófono y se prevé que aumentará a medida que la población de edad se amplía-por lo tanto hay una necesidad creciente de identificar intervenciones de medicina regenerativa para el riñón 14,15. A pesar del conocimiento de que los pacientes con LRA pueden recuperar, por mucho tiempo se ha pensado que el riñón es un órgano sin poderes regenerativos innatas. Esta visión tradicional ha sido revisado de manera espectacular en los últimos años 16. Los estudios que investigan el daño renal en ratones y ratas después de la IRA han demostrado que las células epiteliales de los túbulos nefrona pueden proliferar y reconstruir nefronas funcionales 17-20. Aunque los mamíferos poseen esta capacidad de adaptación para regenerar nefronas, existen limitaciones notables y las respuestas de mala adaptación puede ser desencadenados que conducen a la fibrosis renal y ERC 21. Por ejemplo, un estudio reciente demostró que la ablación repetida de células epiteliales en nefronas murinos se asoció con la regeneración disminuida y fibrosis nefronas renales HAV-sugiriendoea limita umbral de regeneración 22. No hay evidencia de que el riñón de mamíferos adultos forma nuevas nefronas para reemplazar los perdidos o dañados, por lo tanto su destrucción conduce a un déficit de 8,9 nefrona permanente. Curiosamente, algunos vertebrados responden a AKI por la regeneración de los epitelios de nefronas y también la producción de nuevas nefronas, un proceso conocido como neonephrogenesis o nefrona neogénesis 23. Neonephrogenesis ocurre en los peces después de la exposición a tóxicos o resección parcial y modelos de lesión históricamente han incluido los peces de colores 24,25, tilapia 26, patín 27, medaka 28, y más recientemente, el pez cebra 29,30. De éstos, el pez cebra proporcionar un modelo de investigación genética viable para descubrir las vías celulares y moleculares responsables de la regeneración renal. En este artículo de vídeo, nos demuestran cómo etiquetar los segmentos de la nefrona en el pez cebra adulto. El conocimiento de la anatomía de nefronas, las características moleculares,y las características funcionales son esenciales para los estudios renales futuros exitosos utilizando el pez cebra. El riñón adultos de pez cebra es una estructura mesonefros y es inherentemente menos complejo en cuanto a número de nefronas y organización de la estructura metanefros se encuentra en los mamíferos adultos, aves y reptiles 31. Sin embargo, la organización del segmento de nefronas pez cebra es análogo a los mamíferos, y se documentó por primera vez en el riñón de embriones en base a estudios de expresión génica 31-35. Nefronas embrión de pez cebra contienen segmentos lineales tubulares que incluyen el túbulo contorneado proximal (PCT), túbulo proximal recto (PST), distal temprana (DE), y distal tardía (DL) 31-35 (Figura 1). Nefronas adultos de pez cebra poseen segmentos tubulares similares 30,31,36,37 (Figura 1). El PCT también se puede identificar por un fenotipo funcional: las células epiteliales en la PCT incorporarán compuestos de dextrano marcados con fluorescencia (10-70 kDa en tamaño) presentes en elcirculación, que se ha utilizado tanto en el pez cebra riñón embrionarias y adultas para evaluar la captación endocítica por estas células del túbulo proximal 38-41 (Figura 1). Una de las diferencias en los segmentos de la nefrona entre el pez cebra y mamíferos es que el pez cebra carecen de un túbulo intermedio o asa de Henle 30-37; ya que este segmento funciones en los mamíferos para conservar el agua, y el pez cebra son una especie de agua dulce, sin la urgencia de concentrar la orina, no es de extrañar que el pez cebra carecen de este segmento de 32,33. Así, la composición global nefrona se conserva en gran medida entre el pez cebra y el riñón de los mamíferos 32,33. Estas similitudes han permitido pez cebra a ser una herramienta de investigación eficaz para investigar las funciones de los genes renales-expresado durante nefrogénesis desarrollo 32-35,42 y modelar numerosas enfermedades renales 43,44, lo que añade a la lista sustancial de las condiciones humanas que pueden ser investigado utilizandopez cebra 45,46. Hoy en día, el riñón adultos de pez cebra es un modelo atractivo para los estudios comparativos de la regeneración renal debido a su maleabilidad genética y el paladar expansión de los recursos tecnológicos disponibles para interrogar a la función de genes y vías de señalización en esta especie. Varios estudios han utilizado el mesonefros pez cebra para investigar los mecanismos de regeneración después de AKI 29,30,37. Para continuar la investigación AKI usando el riñón adultos de pez cebra, es esencial disponer de métodos exquisitos para etiquetar las diferentes regiones y métodos nefrona para estudiar la funcionalidad de nefronas. Existen varios métodos para el análisis de riñón adulto han sido adaptados de los protocolos de riñón embrionario. La inyección intraperitoneal de dextrano marcado con fluorescencia en el pez cebra adultos etiqueta el epitelio PCT en mesonefros nefronas a través de endocitosis 30, como en embriones de pez cebra 38-41 (Figura 1). Este método ha sido utilizado para visualize cuando los túbulos proximales a recuperar su propiedad reabsorbiendo siguiente AKI, que permite una evaluación de la función fisiológica restaurado 30 (Figura 1). Otra característica de la nefrona túbulo proximal es que las células epiteliales en este segmento poseen un borde en cepillo 37 que muestra altos niveles de actividad de la fosfatasa alcalina endógena. Por lo tanto, el epitelio proximal puede ser localizada visualmente en el riñón pez cebra adultos usando una técnica basada en la fluorescencia conocido como elfo (marcado con enzima-Fluorescencia) -97 47. Aquí se describe cómo llevar a cabo ensayos de absorción de dextrano fluorescentes 30,48 en el riñón adultos de pez cebra, a fin de obtener una evaluación funcional del túbulo proximal y mapear el tamaño y los contornos de este segmento tubular. A continuación, se describen las técnicas para etiquetar las regiones del túbulo proximal de la nefrona adulto con la etiqueta fluorescente fosfatasa alcalina. En tercer lugar, se muestra por primera vez que el rodioamina marcada con lectina aglutinina Dolichos biflorus (DBA), que se ha utilizado como un marcador general de los conductos colectores en el riñón de los mamíferos 49, marca los túbulos distales del riñón adultos de pez cebra. Como DBA es mutuamente exclusivo a la tinción de fosfatasa alcalina, estas etiquetas proporcionan una manera de distinguir ampliamente pan-proximal frente tramos pan-distales de la nefrona adultos de pez cebra. A lo largo de la ejecución de estas manchas fluorescentes en toda ambas montura y secciones histológicas de criostato, relacionamos estas etiquetas con dominios de expresión de genes transportadores de soluto que identifican de forma única cada segmento de la nefrona. Por lo tanto, este protocolo también contiene una guía de los procedimientos de procesamiento de tejidos modificados para tejido adulto todo el montaje hibridación in situ (DESEO) el análisis basado en el protocolo DESEO embrión 50. Estos procedimientos se pueden utilizar en diversas combinaciones (Figura 2) para documentar atributos morfológicos y funcionales of adultos nefronas renales pez cebra. Por lo tanto, estos protocolos se pueden aplicar a estudios de regeneración, la caracterización fenotípica de otros modelos de enfermedades renales, e incluso utilizarse para estudiar la formación del riñón adulto.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Elaborado diluyendo 10 X PBS en agua destilada.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Detergente Tween-20 en 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS con detergente 0.05 % Tween</td><td></td><td></td><td>0.05% Tween-20 en 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Disuelva 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) en 1 X PBS, deje hervir en una placa caliente en una campana extractora. Enfríe y congele las alícuotas para almacenarlas en el congelador a -20 °C. Descongele justo antes de usar y no vuelva a congelar las existencias.</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinzas Patrón #55&nbsp;</td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>de vidrio Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Plastilina</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Otras arcillas para modelar pueden ser sustituidas y funcionan de manera similar</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Opcional: bandeja de cartón para almacenar portaobjetos planos</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> <td>blanqueadoraFórmula de la mezcla de lejía (para una solución de 20 ml): 1,6 ml de solución de hidróxido de potasio al 10% 0,6 ml de solución de peróxido de hidrógeno al 30% 100 &mu; l de 20% Tween Llene hasta 20 ml con agua destilada</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de bloqueo <td>Solución de bloqueo (para una solución de 10 ml): 8 ml de 1X PBS con 0.05% Tween 2 ml de suero de becerro fetal 150 &mu; l de DMSO Detección de</td></tr><tr><td>actividad de fosfatasa alcalina</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>Utilizamos el kit de detección de fosfatasa endógena ELF 97. Para preparar la solución de sustrato de trabajo, diluya el sustrato 20 veces en el tampón de detección, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> de <td>lavado de fosfatasa alcalina</td><td>Receta de solución tampón de lavado (para una solución de 100 ml): 5 ml de 0,5 M de EDTA 120 mg de Levamisol 95 ml de 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextrano, fluoresceína, 40.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Diluir con agua destilada para hacer una solución madre de 50 mg/ml, y almacene las alícuotas en el congelador a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Dextrano, azul cascada, 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Diluir con agua destilada para hacer una solución madre de 50 mg/ml, y almacenar las alícuotas en el congelador a -20ºC.</td></tr><tr><td>Dextrano, amarillo de lucifer, 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Diluir con agua destilada para hacer una solución madre de 50 mg/ml, y almacenar las alícuotas en el congelador a -20ºC.</td></tr><tr><td>Dextrano, tetrametilrodamina (fluoro-rubí), 10.000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Diluir con agua destilada para hacer una solución madre de 50 mg/ml, y almacenar las alícuotas en el congelador a -20ºC.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus aglutinina (DBA)-rodamina</td><td>Laboratorios</td> vectoriales <td>RL-10-32</td><td>DBA Solución de tinción (para un 100 &mu; l solución): 1 &mu; l de DBA 99 &mu; l de 1X PBS</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield medio de montaje duro</td><td>Laboratorios</td> vectoriales <td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, solución de 0,5 M, pH 8,0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Medio de congelación de tejidos</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsia, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 portaobjetos de microscopio adhesivos</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de líquidos &ndash; bolígrafo super PAP</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de humedad para inmunotinción</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&comercio; HM 525 Microscopio estereoscópico criostato</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Azul GFP/DAPI; 83457 P-Dotación GFP/FITC; 83457 El conjunto de filtros P-TRITC</td><td>utilizado fue el siguiente: Se utilizó filtro Hoechst/DAPI para la detección de DAPI, yoduro de propidio, azul de cascada de dextra y fosfatasa alcalina. Se utilizó filtro GFP/FITC para la detección de dextrano-FITC, amarillo de lucifer dextrano y anti-GFP. El filtro TRITC se utilizó para la detección de dextrano-fluoro-rubí, PI y DBA.</td></tr><tr><td>Microscopio compuesto</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>El conjunto de filtros utilizado fue el siguiente: El filtro Hoechst/DAPI se utilizó para la detección de DAPI, yoduro de propidio, azul de dextran-cascada y fosfatasa alcalina. Se utilizó filtro GFP/FITC para la detección de dextrano-FITC, amarillo de lucifer dextrano y anti-GFP. El filtro Texas Red se utilizó para la detección de dextrano-fluoro-rubí, PI y DBA. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

análisis de composición nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

El modelo de pez cebra se ha convertido en un sistema relevante para estudiar el desarrollo del riñón, la regeneración y la enfermedad. Tanto los riñones de pez cebra embrionarias y adultas se componen de unidades funcionales conocidas como nefronas, que son altamente conservadas con otros vertebrados, incluyendo mamíferos. Investigación en el pez cebra se ha demostrado recientemente que los dos fenómenos distintivos transpiran después de nefronas adultos incurren en daños: en primer lugar, hay una regeneración robusta dentro de las nefronas existentes que reemplaza las células epiteliales del túbulo destruidas; segundo, totalmente nuevas nefronas se producen a partir de progenitores renales en un proceso conocido como neonephrogenesis. En contraste, los seres humanos y otros mamíferos parecen tener sólo una capacidad limitada para la regeneración epitelial nefrona. Hasta la fecha, los mecanismos responsables de estos fenómenos de regeneración renal siguen siendo poco conocidos. Desde riñones pez cebra adultos sufren tanto nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis, proporcionan un párrafo experimental excepcionalparadigma para estudiar estos eventos. Además, existe una amplia gama de herramientas genéticas y farmacológicas disponibles en el modelo de pez cebra que se pueden utilizar para delinear los mecanismos celulares y moleculares que regulan la regeneración renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe un conjunto de técnicas de etiquetado que se pueden utilizar para medir la composición y la funcionalidad renal nefrona prueba en el riñón adultos de pez cebra. Por lo tanto, estos métodos son ampliamente aplicables para el futuro caracterización fenotípica de los paradigmas de pez cebra adultos lesión renal, que incluyen pero no se limitan a, los regímenes de exposición nephrotoxicant o métodos genéticos de la muerte celular específica, tales como la técnica de ablación celular mediada por nitrorreductasa. Además, estos métodos pueden ser utilizados para estudiar la formación de perturbaciones genéticas en riñón adulto y también podrían aplicarse para evaluar el estado renal durante el modelado de la enfermedad crónica.

El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la composición y funcionalidad del segmento de nefrona en el riñón de pez cebra adulto. Esto se logra inyectando primero dextrina marcada con fluorescencia en un nido que ata peces cebra. El segundo paso es extraer y fijar el riñón para preparar el tejido para los métodos de etiquetado posteriores.A continuación, el riñón se blanquea para eliminar la pigmentación y luego se tiñe para marcar con fluorescencia los segmentos de nefrona deseados. Los resultados se obtienen mediante inmunofluorescencia, microscopía y/o imágenes de campo claro que permiten la visualización de la anatomía del riñón en función de la tinción o tinciones seleccionadas. Los siguientes métodos de etiquetado pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo del riñón con respecto a la anatomía de los órganos y se pueden utilizar para estudiar la composición de las nefronas y evaluar la funcionalidad renal tanto antes como después de un evento de lesión.Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia el estudio de las anomalías genéticas en la formación del riñón adulto y también podrían aplicarse para evaluar el estado renal durante el modelado de enfermedades crónicas. Para comenzar, decantar la solución de un pez anestesiado y colocar cuidadosamente al animal en un lado ventral del molde de esponja húmedo. A continuación, llene una jeringa de insulina con 20 microlitros de solución madre de dextrina descongelada.Coloque la aguja de modo que la inserción se produzca en un ángulo poco profundo en la línea media ventral del abdomen. Para evitar inyectar ligeramente los órganos, levante la aguja justo después de inyectar para levantar la pared del cuerpo y crear un espacio en el que inyectar la solución. Después de la inyección, regrese suavemente el pez al tanque para recuperarse de la anestesia.Para empezar, decanta cualquier solución extra de un pez anestesiado y colócala sobre un pañuelo de papel o una toalla de papel. Después de extirpar la cabeza y los órganos internos, use agujas de disección súper finas para abrir las paredes del cuerpo. Localiza el órgano renal que está adherido a la pared dorsal del animal.Use pinzas finas para separar el riñón de la pared dorsal. Coloque suavemente el riñón en un frasco de vidrio de cinco mililitros que contenga un XPBS y lávese tres veces durante cinco minutos cada una. Extraiga el riñón con una pipeta de transferencia y colóquelo en un vaso limpio Deslice con una o dos gotas de un XPBS.Use pinzas finas para aplanar el riñón en el portaobjetos, asegurándose de que ningún tejido se haya curvado o volcado sobre sí mismo. Se puede utilizar una herramienta de alambre de tungsteno para hacer pequeñas incisiones en el tejido conectivo para facilitar la posición plana del riñón. A continuación, coloque pequeños trozos de arcilla para modelar en cada esquina de un cubreobjetos de vidrio de 18 por 18 milímetros.Coloque lentamente el cubreobjetos en el riñón, manteniendo un ligero ángulo. Para minimizar las burbujas de aire atrapadas, agregue una gota adicional de un XPBS para llenar el espacio entre el cubreobjetos y la corredera si es necesario. Un grupo separado de peces cebra son sacrificados y remojados en fijador durante la noche.Cuando esté listo, use pinzas finas para separar cuidadosamente el riñón de la pared dorsal del cuerpo y coloque el órgano en un frasco de vidrio. Lave el riñón disecado tres veces con tres a cinco mililitros de un XPBS con 0.05%tween durante cinco minutos cada uno. A continuación, retire la solución de PBS y enjuague el riñón con tres mililitros de una solución de sacarosa al 5% durante 30 minutos.Pasado este tiempo, sustituya la solución por tres mililitros de sacarosa al 30% y almacene durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Retire la solución y lave el riñón dos veces antes de agregar de tres a cinco mililitros de solución blanqueadora. Para eliminar la pigmentación de los melanocitos presente en el órgano renal, coloque el vial de vidrio en un rotador y observe atentamente cómo desaparece la pigmentación.La despigmentación suele durar aproximadamente 20 minutos, pero en ocasiones puede tardar hasta 60 minutos. Si la solución blanqueadora se deja actuar durante demasiado tiempo, puede producirse una desintegración y, por lo tanto, se recomienda controlar la muestra cada 10 a 15 minutos para comprobar la integridad cuando la pigmentación se haya eliminado del lavado renal dos veces e incubar con una solución de PFA al 4% durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, retire la solución de PFA al 4% y lave el riñón tres veces después del último lavado a tres a cinco mililitros de solución bloqueante e incube el riñón a temperatura ambiente durante dos horas.Una vez finalizado el bloqueo, proceda directamente al protocolo de tinción seleccionado. Retire la solución bloqueante y lave el riñón tres veces antes de dejar que el riñón se remoje en un XPBS durante al menos 10 minutos. Durante este tiempo, transfiera el riñón a una placa de cultivo de 12 o 24 pocillos.Reemplace el XPBS con suficiente solución de sustrato de fosfatasa alcalina de trabajo para cubrir la muestra y coloque la muestra en un rotador durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de este tiempo, detenga la reacción lavando el riñón en una solución tampón de lavado de fosfatasa alcalina. Enjuague el riñón con tres cambios de solución tampón de lavado durante 10 a 15 minutos.A continuación, retire la solución tampón de lavado y coloque el riñón en un vaso limpio. Deslice el medio de montaje de fosfatasa incluido en el kit de etiquetado. Visualice el riñón teñido con fosfatasa alcalina utilizando un microscopio estereoscópico o un microscopio compuesto con un juego de filtros Debbie enganchado.Primero, prepare una solución de DBA de trabajo de 200 microlitros diluyendo DBA en un XPBS. Reemplace la solución de PBS con 200 microlitros de solución de DBA y coloque la muestra en un rotador durante una hora a temperatura ambiente. Después de este tiempo, retire la solución de DBA y lave el riñón tres veces con tres a cinco mililitros de un XPBS durante cinco minutos cada uno.Retire el XPBS y monte el riñón en un portaobjetos de vidrio limpio. Como se demostró anteriormente, visualice los segmentos distales del riñón teñidos con DBA utilizando un filtro Trixie estándar o rojo de Texas establecido en un microscopio estereoscópico fluorescente o un microscopio compuesto. En esta imagen de campo claro de un riñón sin blanquear, la pigmentación negra corresponde a la población dispersa de melanocitos.Aquí se visualizan los segmentos de PCT de nefrona tres días después de la inyección de dextrina. El recuadro contiene una imagen de una sola nefrona con melanocitos. Esta imagen muestra un riñón adulto después de la eliminación de la pigmentación de los melanocitos.Estas imágenes representativas muestran ligeras variaciones morfológicas entre los segmentos de PCT, mientras que muchos PCT de nefrona están fuertemente enrollados. Otras nefronas contienen regiones PCT que tienen un enrollamiento mínimo: dextrina azul en cascada de dextrina, amarillo de Lucifer y rubí fluorado de dextrina etiquetan preferentemente los segmentos de PCT en las nefronas renales, tanto el azul en cascada de dextrina como el amarillo de Lucifer muestran un marcaje inespecífico con un fondo mucho más alto observado en los riñones tratados con amarillo de Lucifer. Por el contrario, la dextrina fluoro rubí mostró un fondo drásticamente reducido con un intenso etiquetado PCT.Un riñón adulto teñido por el deseo de detectar un marcador específico del tipo de célula transportadora de PCT muestra un patrón de expresión característico de la captación de dextrina con una distribución de varios dominios de PCT en bucle muy enrollados, así como tramos de PCT más alargados que muestran un diámetro amplio y constante. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo etiquetar con éxito segmentos de nefrona dentro del riñón de pez cebra adulto, como el túbulo proximal con fosfatasa alcalina y el túbulo distal médico con DBA. No olvide que trabajar con 4% de paraldehído puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar un abrigo, guantes y anteojos mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

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La disección de los órganos del pez cebra adultos

El riñón del pez cebra es el hogar de los renales y hematopoyéticas adultas células madre / progenitoras, y representa una oportunidad excepcional para estudiar estos tipos de células y su progenie en un organismo modelo de vertebrados. En este sentido, demostrar un procedimiento de disección detallada que permite al investigador identificar y extirpar el riñón del pez cebra adulto, que puede ser utilizado para aplicaciones tales como el aislamiento de células, los trasplantes, y los estudios...

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Preparación de un riñón de montaje plano: un procedimiento para diseccionar y preparar un montaje plano para el análisis microscópico del riñón de pez cebra adulto

En este video, demostramos la despigmentación del riñón de pez cebra adulto y su posterior preparación para los procedimientos de tinción. Después de la tinción, el riñón de pez cebra adulto se puede utilizar para estudiar la regeneración renal, la caracterización fenotípica de modelos de enfermedad renal y la funcionalidad de la nefrona.

Despigmentación y pretinción del riñón de pez cebra: una técnica para preparar el riñón de pez cebra adulto para la tinción

Aquí presentamos un método fiable para estudiar la regeneración renal adulta mediante la inducción de una lesión renal aguda mediante la inyección de gentamicina. Demostramos que la lesión depende de la dosis de gentamicina y de la temperatura ambiental utilizando hibridación in situ para marcar lhx1a+ desarrollando nuevas nefronas.

La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida

El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente 1 que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo de órganos en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia de disección capaces de realizar seccionamiento óptico y estrategias simples de reajuste para corregir la deriva focal y plana.

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Las lesiones renales efectuados desde nefrotóxicos, que incluyen medicamentos que van desde antibióticos a los agentes quimioterapéuticos, pueden dar lugar a trastornos complejos cuya patogénesis se conoce por completo. Este protocolo se muestra cómo el pez cebra se puede utilizar para el modelado de la enfermedad de estas condiciones, que se pueden aplicar a la identificación de medidas renoprotective.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

Este protocolo describe los procedimientos para inducir lesiones renales agudas (AKI) en peces cebra adultos utilizando cisplatino como agente nefrotoxico. Detallamos los pasos para evaluar la reproducibilidad de la técnica y dos técnicas para analizar la inflamación y la muerte celular en el tejido renal, la citometría de flujo y tunel, respectivamente.

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El pez cebra es un modelo importante para comprender el desarrollo renal. Aquí, se optimiza un protocolo de hibridación in situ para detectar la expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra durante el desarrollo de mesonephros.

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Aprenda a evaluar la composición y función de nefronas en riñones adultos de pez cebra mediante inyección de dextrano fluorescente, tinción específica e inmunofluorescencia. Estas técnicas permiten estudiar la anatomía renal y regeneración.

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