Name: Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a evaluar la función renal en pez cebra mediante un ensayo de liquidación con fluoróforo. Este método cuantitativo no invasivo permite estudiar enfermedad renal crónica sin necesidad de análisis sanguíneos.

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La asistencia técnica proporcionada por Jaipreet Bharj. Este trabajo fue apoyado por becas de la UE-FP7 (SYSCILIA -241.955) y El Riñón Fundación holandesa (CP11.18).

Declaración de Ética: Animal de mantenimiento, la cría y los procedimientos están definidos y controlados por la Ley de 1986. Todos los experimentos con animales se ha llevado a cabo bajo licencias otorgadas por el Ministro del Interior (PIL Nº 70/7892) en cumplimiento con Biológica Animales (Procedimientos Científicos) Grupo de Servicios de Gestión y el Comité de Ética de Servicios Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales utilizados y para perfeccionar los procedimientos y la cría con el fin de minimizar el sufrimiento y mejorar el bienestar. 1. Elaboración de Instrumentos, Anestésico, y colorante fluorescente <ol><li> El uso de un extractor de micropipeta y los capilares de borosilicato de pared estándar (sin filamentos) Tire agujas de longitud adecuada para la microinyección (Figura 1A). </li><li> Hacer un molde de agarosa para la orientación de los embriones para inyección fácil en el pericardio (Figura 1B). Pegamento aproximadamente diez vidrio microscopio slides juntos para formar una &#39;escalera&#39; de diapositivas offset. Para obtener los mejores resultados, utilice una gota de pegamento rápido resina epoxi conjunto en el centro de cada diapositiva. </li><li> Corte un tramo de aproximadamente 78 mm de longitud a medio camino a través de dos pipetas de plástico de 10 ml utilizando un bisturí Mechero Bunsen climatizada, retire la pipeta termina en su caso. Adjuntar y secciones pegamento (resina epoxi) de pipeta a las diapositivas de cristal apilados para proporcionar estabilidad para permitir que el molde para que moje en una placa de Petri de 90 mm. Haga todo lo posible para asegurar las esquinas de diapositivas alinean perpendicular al suelo placa de Petri. Dé tiempo pegamento se seque. </li><li> Reparto de molde en una solución de agarosa al 2% en agua hecha de pescado (obtenido de la acuario). Verter de agarosa en una placa de Petri de 90 mm y colocar el molde en la parte superior de la placa de Petri abierta, permitiendo la diapositiva apilados bordes para sumergirse en un ángulo bajo la superficie de agarosa. Deja para establecer en el banco de laboratorio durante 30 minutos. </li><li> Retire el molde deslizante y cubra la agarosa deslizable impresa con peces de agua dulceque contiene tricaína anestésico (ver paso 1,9) a una proporción de 1:25. </li><li> Haga soluciones de dextrano rodamina (RD) tinte. Resuspender rodamina B 10.000 MW dextrano marcado en agua ultrapura esterilizada en autoclave para hacer una concentración de solución madre de 50 mg / ml. Para la microinyección, diluir aún más la acción a una concentración final de 5 mg / ml en agua ultrapura tratada en autoclave. NOTA: pigmentada células comienzan a diferenciarse en el pez cebra de 24 h después de la fecundación (HPF); estos pueden oscurecer marcadores fluorescentes durante la adquisición de imagen. </li><li> Inhibir la formación de melanocitos mediante el uso de N -Phenylthiourea (PTU), que bloquea la melanogénesis través de la inhibición de la tirosinasa. Hacer una solución madre de 0,003% de PTU disolviendo polvo de PTU en el agua del acuario, la solución se calienta a 60 ° C para solubilizar completamente. </li><li> Incubar embriones de pez cebra en solución de azul de metileno, un fungicida suave, para evitar las floraciones de hongos y aumentar la supervivencia. Añadir 2 ml de solución de azul de metileno, que contiene 0,1% de azul de metileno en uagua ltrapure, a 1 l de agua del acuario y su uso como medio de embrión estándar. </li><li> Invente una concentración stock de 15 mM de sal metanosulfonato / acetato de 3-aminobenzoato tricaína como se indica en &#39;El libro de pez cebra&#39; 23. Anestesiar a los embriones y por consiguiente ellos inmovilizada para realizar el procedimiento de microinyección. </li><li> Después de anestesiar a los embriones, orientarlo, para obtener imágenes mediante el uso de las propiedades no tóxicas y viscosas de metilcelulosa. Para hacer una preparación de 200 ml de 3% de metilcelulosa, chill 130 ml de agua a -20 ° C durante 30 min y el lugar en hielo. Calentar 70 ml de agua a 80 ° C en un vaso de precipitados de vidrio, añadir 6 g de metilcelulosa, y agitar con una varilla de vidrio hasta que todas las partículas se humedecen y uniformemente dispersos. Agregue el agua helada, mezcle y deje que la preparación se enfríe a 4 ° C durante 30 minutos antes de alícuotas en tubos de 50 ml. NOTA: La reducción de la temperatura permite la metilcelulosa se vuelva soluble. La solución se vuelva más gruesocomo los hidratos de polvo. 3% de metilcelulosa se puede almacenar sin crecimiento bacteriano durante cortos períodos de una semana a 4 ° C o más a -20 ° C. Asegúrese de que la metilcelulosa ha llegado a RT antes de su uso. </li><li> Para llevar a cabo inyecciones de tinte fluorescente en el pez cebra utilizar una microinyección configuración estándar (Figura 1C). Este consta de un compresor de aire conectado a un sistema regulador de presión que se alimenta en un soporte de pipetas recta para su uso con 1,0 capilares de diámetro exterior. El titular de la pipeta debe ser alojado dentro de un compacto micromanipulador de control 3-MM33 eje fijado a una placa base de acero por un soporte magnético. Los embriones pueden ser visualizados, manipulado y se inyectaron usando un microscopio de disección estéreo. </li></ol> 2. El pez cebra Cría y Tratamiento Pre-inyección <ol><li> Mantener el pez cebra como se describió anteriormente 23. Utilice un acuario configuración que proporciona agua de recirculación suministrado a una temperatura constante de 28,5 ° C, Condicionado a pH 6.8 a 7.2 y la conductividad de 450 a 550 mS con bicarbonato de sodio y la sal del mar Océano instantánea, respectivamente. Utilice tipo salvaje o líneas de pez cebra transgénico según sea apropiado para el experimento, el mantenimiento de una densidad de población de 15 machos y 15 hembras por 8 tanque L. Ajuste el fotociclo instalación pescado a 14 horas de luz del día entre las 09 a.m.-11 p.m.. </li><li> Desove pez cebra comienza a principios de la fotociclo, cuando las luces se encienden en la mañana. Para asegurar huevos máximas pueden recogerse sin molestar a los peces, sumerja los tanques de cría (que contienen inserciones de malla, disponible de especialistas de pez cebra) en los tanques de almacenamiento de tipo salvaje de la noche antes de la recolección. </li><li> En el día de la recolección, permite 30 - 40 min para los peces para desovar, después de lo cual recoger y enjuagar los huevos usando un colador de té y agua del acuario fresco. Deposita los huevos limpios en un medio que contiene el embrión de 90 mm placa de Petri y se incuba a 28,5 ° C. </li><li> Tratar a los embriones con PTU para inhibir melanogénesis. A las 8 de HPF, transferir embriones viables en el líquido mínimo en placas de Petri que contienen frescos 1: 100 PTU a medio embrión y se incuba adicionalmente a 28,5 ° C hasta 72 HPF. NOTA: PTU puede causar defectos de desarrollo si se usa en las primeras etapas de modo debe limitarse a publicar 8 etapas HPF, pero puede ser tratada tan tarde como 24 HPF. Además tardía de PTU no bloquea completamente la pigmentación del ojo, pero generalmente es exitoso y la inhibición de la formación de los melanocitos tronco. </li></ol> 3. La microinyección NOTA: El pericardio encierra al corazón, pero se separa para la protección y facilidad de movimiento cardiaco por el fluido dentro de la cavidad pericárdica. El objetivo de este procedimiento es inyectar RD en la cavidad pericárdica, esto permite la rápida captación del colorante al sistema de vasculatura. <ol><li> Agujas de carga con 6 l - diluyen RD, utilizando puntas Microloader y segura en el soporte de la aguja del micromanipulador. Romper el extremo de la aguja usando bien tippfórceps ed (Figura 1A). Mover la solución RD a la punta de la aguja mediante la maximización de la duración del pulso a la configuración minutos, volver a mseg una vez completa. </li><li> Utilice un micrómetro de platina, el regulador de presión, y refinamientos a la longitud de punta de la aguja (utilizando pinzas) para ajustar el tamaño de la gotita expulsada a 100 micras de diámetro, esto equivale a un volumen de 0,5 nl (Figura 2A). NOTA: Al romper la aguja, tenga cuidado de no romper demasiado fuera de lo contrario hará que calibrar el volumen de inyección difícil. Si es necesario, romper aún más la punta de la aguja para aumentar el tamaño de la gota sin embargo, mantener un espesor de la aguja que permite la entrada en el pericardio sin flexión excesiva o daños en el tejido. </li><li> Antes de la inyección, anestesiar a los embriones en medio de embrión que contienen tricaína. Configure 2 x 35 mm placas de Petri que contenían 5 ml de medio de embriones, una etiqueta &#39;tricaína&#39; y la otra &#39;recuperación&#39;. </li><li> Añadir 200l de stock tricaína al plato debidamente etiquetado. Una vez listo para inyectar, seleccionar un embrión individual en 72 HPF y transferir en líquido mínimo para el plato tricaína. Supervisar la actividad del embrión, pruebe el embrión se anestesia y se inmoviliza mediante agitación suave con una punta de microloader truncado. </li><li> Transferir el embrión anestesiado para el molde de inyección y orientar el embrión dentro de una cubeta de agarosa de manera que el lado izquierdo está mirando hacia arriba, el posicionamiento del corazón a la izquierda del campo de vista. </li><li> Para inyectar la RD en el corazón, el pericardio perforar con la aguja e inyectar 1 nl de RD en la cavidad pericárdica del embrión anestesiado (Figura 2B, panel derecho). Retire la aguja después de la inyección. Transferir el embrión inyectado en el líquido mínimo para el &#39;plato recuperación&#39; y vigilar durante 1 min. Transferir el embrión individual a una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de medio de embriones frescos (que contiene PTU) y la etiqueta de manera apropiada. NOTA: El pericardio es difícil, sin embargo hay un punto débil notable en la intersección donde el pericardio cumple con los arcos faríngeos ventro-caudal y saco vitelino dorso-rostral (Figura 2B punta de flecha). La aguja debe dirigirse a esta ranura. Cuando la aguja está en su lugar, un grifo firma de un dedo en la parte superior de la micromanipulador facilitará la entrada en la cavidad pericárdica. </li><li> Repita los pasos 3.2 a 3.6 por lo menos 10 embriones por grupo experimental, coloque cada pez en un pozo independiente y única labelto permiso individuales experimentales de seguimiento. Se incuba a 28,5 ° C durante 3 horas. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> A las 3 h después de la inyección (hpi) anestesiar a los embriones como se describió anteriormente y transferir a un plato de Petri de 35 mm que contiene 3% de metilcelulosa. Presione suavemente los embriones en la metilcelulosa y orientar para que el lado lateral se pueden obtener imágenes. </li><li> Adquirir una imagen del embrión bajo UV, utilizando un filtro para la visualización of emite luz a 570 nm (Figura 2C). Después de la adquisición de imágenes, permite que el embrión se recupere antes de reemplazar en el bien designado. Adquirir imágenes de todos los embriones inyectados e incubar mayor a 28,5 ° C. NOTA: En este protocolo se utilizó un microscopio estereoscópico fluorescente con un conjunto de filtros TXR, una cámara DFC300FX y software de aplicación respectiva. Tome nota de los ajustes de adquisición exactos para la adquisición de la imagen posterior. </li><li> A las 24 hpi, adquirir una segunda ronda de imágenes como se describe anteriormente. Una vez que todas las imágenes han sido adquiridas, tanto a los 3 hpi y 24 hpi, humanamente disponer de los embriones o el uso para otros medios experimentales, por ejemplo, la inmunohistoquímica. </li></ol> Procesamiento 5. Imagen <ol><li> Cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada embrión inyectado, a las 3 hpi y 24 hpi, mediante el análisis de imágenes utilizando el software ImageJ de NIH. Para medir la intensidad de fluorescencia, abrir una imagen en ImageJ y especificar una región de interés (ROI) a 100 px 2 (Editar → Selección → especificar). </li><li> Coloque el corazón en el centro de la roi (Figura 2C), establezca medidas para incluir la escala de gris medio y el área (Analizar → medidas de ajuste), lleve a cabo la medición (Analizar → medida). Completar para cada conjunto de imágenes, a las 3 hpi y 24 hpi, por embrión y transferir valores promedio en escala de grises a una hoja de cálculo para su posterior procesamiento. NOTA: Seleccionamos un tamaño roi fijo de 100 px 2 ya que esto abarca corazones individuales entre embriones. El corazón fue seleccionado para realizar mediciones debido a su gran tamaño que permite una ubicación conveniente para medir el contenido fluorescente de la sangre antes de entrar en el riñón. </li><li> Realizar análisis estadístico utilizando el software estadístico apropiado. Comparar grupos de significación estadística utilizando la prueba t de estudiante. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El pez cebra ofrece una valiosa herramienta para modelar la enfermedad genética humana, su utilización como instrumento científico para la investigación in vivo han permitido estudios detallados de la descomposición genética de muchos sistemas biológicos, incluido el riñón. Mucho ahora se entiende acerca de cómo se desarrolla y funciona el riñón pez cebra. Las similitudes con nefrogénesis humana y la homología con los genes causantes de enfermedades 21 ha ilustrado cómo el pez cebra se han c...

El riñón humano juega un papel crucial en el filtrado de los desechos metabólicos de la sangre y la recuperación de solutos necesarios para mantener la homeostasis celular. Hay un número de enfermedades genéticas humanas que causan disfunción renal. La enfermedad renal hereditaria más común es la enfermedad renal poliquística autosómica dominante (PQRAD) caracterizada por el desarrollo de los sacos llenos de líquido dentro de túbulos nefríticos; el daño causado por la quistogénesis es perjudicial para la función renal 10. PQRAD tiene una ocurrencia de 1: 800 - 1: 1000 y representa el 8 - 10% de los pacientes en insuficiencia renal terminal (IRT) 11. Varios genes han sido implicados para causar PQRAD incluyendo policistina-1 (PKD1) y -2 (PKD2), que representa aproximadamente el 85% y el 15% de los casos, respectivamente 12,13. Además, los productos génicos para PKD1 y -2 se localizan en el cilio y son fundamentales para ciliogenesis 14,15. Existe ahora una familia reconocida de trastornos genéticos humanos, conocidos comolos ciliopatías, que afectan a la función de los cilios y dan lugar a ERC 16. El creciente número de enfermedades genéticas humanas que afectan el desarrollo y la función ciliar está atrayendo el interés mundial en este orgánulo vestigial una vez considerado. El cilio, un saliente celular-cabello como, está enriquecida con los receptores y canales iónicos necesarios para la transducción de eventos de señalización celular clave. El cilio consiste en un axonema a base de microtúbulos, típicamente estructurado en nueve dobletes de microtúbulos dispuestos radialmente con o sin un par central de microtúbulos singlete. La estructura axonemal define el tipo y modo de acción ciliar. La disposición de los microtúbulos 9 + 2 confiere a la motilidad del cilio donde se utiliza en el movimiento de los fluidos a través de las superficies epiteliales. La configuración 9 + 0 es no móviles, pero se cree que es principalmente función en eventos de señalización celular 17. Aparte de ERC, las consecuencias de la disfunción ciliar son un conjunto de característicascaracterísticas ciliopatía que incluyen, la obesidad, la degeneración de la retina, polidactilia, y el deterioro cognitivo 16. Sin embargo, la ERC es una de las más perjudiciales para la calidad de vida del paciente y, por tanto, una importante fuerza impulsora detrás del desarrollo de su caso en modelos in vivo para ciliar relacionada con la ERC. El pez cebra es un excelente modelo para comprender la etiología de la enfermedad genética humana. Su desarrollo rápido, la producción de un gran número de huevos, tejido transparente, y el crecimiento ex utero permite procesos de desarrollo de pez cebra a ser visualizados y eventos biológicos manipulados con facilidad considerable. Los genes pueden ser alterados genéticamente utilizando el reciente éxito de herramientas de edición genoma (CRISPR 18 y TALENS 19), derribados usando tecnología antisentido de morfolino 20, o farmacológicamente regulados por la adición de compuestos a su medio ambiente acuático. De hecho, el pez cebra ofrece una plataforma para llevar a cabo experimentos que no son permisivos en otros modelos animales. Mientras que el pez cebra son vertebrados relativamente simples (en comparación con los seres humanos) que comparten muchos órganos funcionalmente conservados, los genes y los procesos de señalización en común con los seres humanos. Por ejemplo, el riñón pez cebra es notablemente similar en estructura y función en comparación con los seres humanos 21,22. Sin embargo, a diferencia del riñón de mamífero que se desarrolla a través de una sucesión de fases, cada una marcada por un riñón más desarrollada (pronefros, mesonefros y metanefros), el pez cebra embrionarias sólo se desarrolla una pronefros, la forma más inmadura de un riñón. Mientras millones de nefronas se encuentran formando los bloques de construcción del riñón de los mamíferos, el embrión de pez cebra sólo poseen dos. Los glomérulos, que permiten el filtrado de sangre inicial, se fusionan en la línea media ventral sólo a la aorta. Filtros de sangre a través de los glomérulos en los túbulos pronéfricos que se ejecutan en sentido caudal a lo largo del eje, la fusión antes de salir a través de la cloaca. El pronephric tubules están fuertemente ciliadas con cilios móviles que son permisivas para el flujo de filtrado hacia la salida caudal 3,4. Esta estructura pronephric sencillo mantiene la homeostasis pez cebra a través de varias semanas de crecimiento de las larvas en el que el tiempo se convierten en una estructura más compleja mesonefros 21. Sin embargo, el pez cebra nunca desarrolla un metanefros 21. A pesar de las idiosincrasias de pez cebra, la nefrona pez cebra se segmenta con perfiles de expresión génica igual a la observada en los mamíferos y por lo tanto ofrece una incomparable modelo in vivo para la nefrogénesis 3,22. Rutinariamente a los pacientes se prueban para la función renal a través de una serie de pruebas de sangre y orina. Típicamente, la sangre se analiza para disuelto sales, urea y creatinina. Los altos niveles de urea, creatinina y concentraciones anormales de sal son indicativos de problemas con la función renal. Análisis de orina utilizando una tira reactiva colorimétrica detecta niveles anormales de proteína, blood, pus, bacterias y azúcar presente en muestras de orina. Estas pruebas normalmente requieren aproximadamente 30 ml de orina o de 5-10 ml de sangre. Ha sido difícil traducir estos tipos de ensayos a pequeña en organismos modelo in vivo, tales como el pez cebra, debido principalmente a la naturaleza imposible de recogida de sangre u orina suficiente para realizar el ensayo. Aquí, nos dirigimos a la falta de pruebas de función renal pez cebra apropiadas y describimos una técnica innovadora para su estudio. Mediante la inyección de un tinte fluorescente en la corriente sanguínea que son capaces de controlar y cuantificar de forma individual en el tiempo de la filtración y la excreción de la actividad fluorescente de la sangre a través del riñón. Este método puede ser utilizado para estudiar el daño renal causada por la enfermedad, que proporcionan un ejemplo de.

<table><tbody><tr><td>P-97 SUTTER Extractor de micropipetas de tipo flameado/marrón</td><td>Intracel</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>capilares de pared estándar de borosilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio</td><td>VWR International</td><td>631-0109</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de resina epoxi</td><td>Evo-Stik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B 10,000 MW etiquetado Dextran</td><td>Life technologies&nbsp;</td><td>D-1824</td><td></td></tr><tr><td>N-feniltiourea&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Etilo 3-aminobenzoato sal de metanosulfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>metilcelulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>compresor de aire&nbsp;</td><td>Jun-Air</td><td>OF302-15</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III&nbsp;</td><td>Instrumentos Parker&nbsp;</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de control compacto de 3 ejes&nbsp;</td><td>Marzhauser</td><td>MM33&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>puntas de microcargador</td><td>Pinzas Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>Micrómetro de etapa Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Pyser- SGI</td><td>02A00404</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de liquidación fluorescente

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

El embrión de pez cebra ofrece un modelo manejable para estudiar la organogénesis y modelar enfermedades genéticas humanas. A pesar de su relativa simplicidad, el riñón pez cebra se desarrolla y funciona casi de la misma forma que los humanos. Una diferencia importante en la construcción del riñón humano es la presencia de millones de nefronas en comparación con el pez cebra que tiene sólo dos. Sin embargo, la simplificación de un sistema tan complejo en unidades funcionales básicos ha ayudado a nuestra comprensión de cómo se desarrolla el riñón y opera. En el pez cebra, la línea media situada glomérulo es el responsable de la filtración de la sangre inicial en dos túbulos pronéfricos que divergen para funcionar bilateralmente por el eje embrionario antes de fundirse entre sí en la cloaca. Los túbulos pronéfricos están densamente poblados por cilios móviles que facilitan el movimiento de filtrado a lo largo del túbulo segmentada, lo que permite el intercambio de varios solutos antes de finalmente salir a través de la cloaca 2-4. Muchos de los genes responsables de la enfermedad renal crónica, incLuding los relacionados con ciliogenesis, han sido estudiados en el pez cebra 5. Sin embargo, un gran inconveniente ha sido la dificultad para evaluar la función renal pez cebra después de la manipulación genética. Ensayos tradicionales para medir la disfunción renal en humanos han demostrado no traslacional para el pez cebra, debido principalmente a su medio acuático y pequeño tamaño. Por ejemplo, no es físicamente posible extraer la sangre de embriones en escena de pescado para el análisis de urea y creatinina contenido, ya que son demasiado pequeñas. Además, el pez cebra no producen suficiente orina para la prueba en un simple proteinuria &#39;varilla&#39;, que a menudo se lleva a cabo durante los exámenes iniciales de los pacientes. Se describe un ensayo fluorescente que utiliza la transparencia óptica del pez cebra para controlar cuantitativamente la liquidación de un colorante fluorescente, con el tiempo, a partir de la vasculatura y hacia fuera a través del riñón, para dar una lectura de la función renal 1,6-9.

Síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es una rara ciliopatía heterogénea que afecta aproximadamente a 1: 160.000 personas en todo el mundo 16. Los pacientes presentan una serie de problemas asociados incluyendo riñones poliquísticos, posteriormente los pacientes con frecuencia requieren diálisis o trasplante 24. ESRF es la causa más común de muerte en BBS, con alrededor del 30% de los pacientes que desarrollan ERC 16. En la actualidad, 20 genes no relacionados han sido implicados en BBS sin aso...

El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente 1 que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

El objetivo general de este procedimiento es generar un ensayo cuantitativo de la función renal en pez cebra. Esto se logra primero anestesiando embriones de pez cebra a las 72 HPF. A continuación, los embriones se transfieren a un molde de inyección y se orientan de modo que sus corazones queden a la izquierda del campo de visión.Luego, se inyecta un colorante fluorescente de dextrano rumínico en la cavidad pericárdica y se obtienen imágenes fluorescentes de la región cardíaca mediante un microscopio estereoscópico de fluorescencia epiescopia. Finalmente, se evalúa la eliminación del colorante fluorescente por el riñón utilizando microscopía de fluorescencia epiescopia. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una lectura cuantitativa de la función renal del pez cebra sin requerir pruebas sanguíneas ni urinarias, las cuales no son posibles en el pez cebra.Este método proporciona una herramienta poderosa para evaluar la función renal en modelos de enfermedad de pez cebra. Después de preparar las agujas y elaborar un molde según el protocolo descrito, coloque el molde vertiendo primero una solución de aro al 2 % preparada en agua para peces en una placa de Petri de 90 milímetros. Coloque el molde sobre la placa de Petri, permitiendo que los bordes de las laminillas apiladas se sumerjan en ángulo bajo la superficie de aro.Dejar reposar durante 30 minutos. Retire el molde de la laminilla y utilice agua para peces fresca que contenga anestésico trica en una proporción de uno a 25. Para cubrir la laminilla, imprima aros y realice inyecciones en pez cebra con colorante fluorescente.Utilice un sistema de microinyección estándar compuesto por un compresor de aire conectado a un sistema regulador de presión que alimenta un porta-pipetas recto para uso con capilares de 1,0 de diámetro externo. El porta-pipetas debe alojarse dentro de un manipulador microscópico compacto MN 33. Un micromanipulador de control en tres ejes fijado a una placa base de acero mediante un soporte magnético y un microscopio estereoscópico para disección, que permite visualizar, manipular e inyectar embriones, mientras se mantienen peces cebra en condiciones estándar según se describe en el protocolo escrito.Utilice líneas de pez cebra de tipo salvaje o transgénicas según corresponda al experimento. Mantenga una densidad de carga de 15 machos y 15 hembras por tanque de ocho litros para asegurar la recolección máxima de huevos sin perturbar a los peces. Sumerja los tanques de reproducción en los tanques de cría de tipo salvaje la tarde anterior a la recolección.El día de la recolección, permita de 30 a 40 minutos para que los peces se reproduzcan. Luego, utilice un colador de malla y agua de acuario fresca para recolectar y enjuagar los huevos. Deposite los huevos limpios en una placa de Petri de 90 milímetros que contenga medio para embriones e incube a 28,5 grados Celsius para inhibir la miogénesis.A las ocho horas posteriores a la fertilización o HPF, transfiera los embriones viables con el mínimo volumen de líquido a nuevas placas de Petri que contengan de uno a 100 PTU en medio para embriones e incube adicionalmente a 28,5 grados Celsius.Utilice pinzas de punta fina para romper el extremo de la aguja. Luego, mueva el RD hacia la punta de la aguja maximizando la duración del pulso hasta el ajuste de minutos. Cuando la solución alcance la punta, regrese a milisegundos.Coloque un micrómetro sobre la platina del microscopio y, mediante el regulador de presión y los ajustes en la punta de la aguja, regule el tamaño de la gota expulsada a un diámetro de 100 micrones o un volumen de 0,5 nanolitros antes de la inyección. Prepare dos placas de Petri de 35 milímetros, cada una conteniendo cinco mililitros de medio para embriones; etiquete una como trica y la otra como recuperación.Agregue 200 microlitros de trica stock al platillo etiquetado con trica. Una vez listo para inyectar, seleccione un embrión individual a las 72 HPF. Transfiera la mínima cantidad de líquido al platillo de trica y supervise la actividad del embrión.Una vez que el embrión esté anestesiado, transfiéralo al molde de inyección y oriente el embrión en la ranura de modo que el lado izquierdo quede hacia arriba, posicionando el corazón en el lado izquierdo del campo de visión. Para inyectar el RD en el corazón, utilice la aguja para atravesar el pericardio e inyecte un nanolitro de RD en la cavidad pericárdica.Después de retirar la aguja, transfiera el embrión inyectado con el mínimo volumen de líquido al recipiente de recuperación y observe durante un minuto. Luego, transfiera el embrión individual a una placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de medio fresco para embriones con PTU y rotule adecuadamente. Después de inyectar al menos 10 embriones por grupo experimental, incube a 28,5 grados Celsius durante tres horas.A las tres horas posteriores a la inyección o HPI, anestesiar los embriones como se describió anteriormente. Transferirlos a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga metilcelulosa al 3%. Empujar suavemente los embriones dentro de la metilcelulosa y orientarlos de modo que el lado lateral pueda ser observado.Utilizando un filtro de emisión de 570 nanómetros para luz UV, adquiera una imagen del embrión. Permita que el embrión se recupere antes de devolverlo al pocillo designado; adquiera imágenes para todos los embriones inyectados y luego continúe la incubación a 28,5 grados Celsius. Después de adquirir una segunda serie de imágenes a las 24 HP, utilizo el software ImageJ para cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada embrión inyectado, abriendo una imagen y especificando una región de interés o ROI.Al seleccionar editar selección, especifique y establezca el valor en 100 píxeles cuadrados. Coloque el corazón en el centro de la ROI y elija analizar, establecer mediciones y configure las mediciones para incluir la escala de grises media y el área. Luego realice la medición, cuantifique la fluorescencia para cada conjunto de imágenes a las 3 HPI y 24 HPI por embrión, y transfiera los valores promedio de escala de grises a una hoja de cálculo para su posterior procesamiento.Utilice un software adecuado para realizar el análisis estadístico y comparar los grupos en cuanto a significancia estadística mediante la prueba T de Student, como se muestra aquí. La inyección de RD en embriones de pez bbbs con morfo nueve resultó en el 40 % de los embriones desarrollando quistes fric en posición ventral a los cinco días post-fecundación. Además, los peces morfin mostraron una reducción en la capacidad de eliminar el colorante fluorescente tras 24 HPI en comparación con los controles.Una vez, un grupo de 10 peces puede ser inyectado dentro de los 15 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aprovechar la transparencia óptica del pez cebra para monitorear cuantitativamente la eliminación temporal de un colorante fluorescente microinyectado como una lectura efectiva de la función renal del pez cebra.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe una técnica de microinyección de los aminoglucósidos, la gentamicina, en 2 días después de la fetilization (DPF) de larvas de pez cebra para inducir insuficiencia renal aguda (IRA). También describe un método para montar toda la inmunohistoquímica, plástico inclusión y corte de las larvas de pez cebra para visualizar el daño mediado por IRA.

Microinyecciones intravenosa de larvas de pez cebra para el Estudio de la lesión renal aguda

El trasplante de células es una técnica fundamental para el estudio de la regeneración de tejidos y para el desarrollo de terapias basadas en células de la enfermedad. Se demuestra aquí una técnica de microcirugía que permite el trasplante de células genéticamente etiquetados directamente en el riñón de peces adultos de pez cebra.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

El riñón del pez cebra es el hogar de los renales y hematopoyéticas adultas células madre / progenitoras, y representa una oportunidad excepcional para estudiar estos tipos de células y su progenie en un organismo modelo de vertebrados. En este sentido, demostrar un procedimiento de disección detallada que permite al investigador identificar y extirpar el riñón del pez cebra adulto, que puede ser utilizado para aplicaciones tales como el aislamiento de células, los trasplantes, y los estudios...

La disección del riñón adultos de pez cebra

En este video, demostramos la despigmentación del riñón de pez cebra adulto y su posterior preparación para los procedimientos de tinción. Después de la tinción, el riñón de pez cebra adulto se puede utilizar para estudiar la regeneración renal, la caracterización fenotípica de modelos de enfermedad renal y la funcionalidad de la nefrona.

Despigmentación y pretinción del riñón de pez cebra: una técnica para preparar el riñón de pez cebra adulto para la tinción

El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal.

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

Aquí presentamos un método fiable para estudiar la regeneración renal adulta mediante la inducción de una lesión renal aguda mediante la inyección de gentamicina. Demostramos que la lesión depende de la dosis de gentamicina y de la temperatura ambiental utilizando hibridación in situ para marcar lhx1a+ desarrollando nuevas nefronas.

La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida

El pez cebra es un organismo experimental excelente para estudiar los procesos de desarrollo de vertebrados y la enfermedad humana modelo. A continuación, describimos un protocolo sobre cómo realizar una pantalla manual de alto rendimiento químico en embriones de pez cebra con todo el montaje hibridación in situ (ojalá) de lectura.

Un manual de la pantalla pequeña molécula Acercarse De Alto Rendimiento Utilizando embriones de pez cebra

El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo de órganos en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia de disección capaces de realizar seccionamiento óptico y estrategias simples de reajuste para corregir la deriva focal y plana.

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

Las lesiones renales efectuados desde nefrotóxicos, que incluyen medicamentos que van desde antibióticos a los agentes quimioterapéuticos, pueden dar lugar a trastornos complejos cuya patogénesis se conoce por completo. Este protocolo se muestra cómo el pez cebra se puede utilizar para el modelado de la enfermedad de estas condiciones, que se pueden aplicar a la identificación de medidas renoprotective.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

Este trabajo presenta un nuevo modelo in vivo de lesión renal segmentaria utilizando el pez cebra transgénico GFP de riñón. El modelo permite la inducción de la ablación específica de las células epiteliales del riñón para mostrar los mecanismos celulares de la lesión nefrona y la reparación.

Enfoque preciso de la ablación celular para modelar lesiones renales agudas en el desarrollo de pez cebra

Este protocolo describe los procedimientos para inducir lesiones renales agudas (AKI) en peces cebra adultos utilizando cisplatino como agente nefrotoxico. Detallamos los pasos para evaluar la reproducibilidad de la técnica y dos técnicas para analizar la inflamación y la muerte celular en el tejido renal, la citometría de flujo y tunel, respectivamente.

Modelo de lesión renal aguda inducida por cisplatino en pez cebra adulto

Aprende a evaluar la función renal en pez cebra mediante un ensayo de liquidación con fluoróforo. Este método cuantitativo no invasivo permite estudiar enfermedad renal crónica sin necesidad de análisis sanguíneos.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

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