Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

El objetivo general de este procedimiento es generar un ensayo cuantitativo de la función renal en pez cebra. Esto se logra primero anestesiando embriones de pez cebra a las 72 HPF. A continuación, los embriones se transfieren a un molde de inyección y se orientan de modo que sus corazones queden a la izquierda del campo de visión.

Luego, se inyecta un colorante fluorescente de dextrano rumínico en la cavidad pericárdica y se obtienen imágenes fluorescentes de la región cardíaca mediante un microscopio estereoscópico de fluorescencia epiescopia. Finalmente, se evalúa la eliminación del colorante fluorescente por el riñón utilizando microscopía de fluorescencia epiescopia. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una lectura cuantitativa de la función renal del pez cebra sin requerir pruebas sanguíneas ni urinarias, las cuales no son posibles en el pez cebra.

Este método proporciona una herramienta poderosa para evaluar la función renal en modelos de enfermedad de pez cebra. Después de preparar las agujas y elaborar un molde según el protocolo descrito, coloque el molde vertiendo primero una solución de aro al 2 % preparada en agua para peces en una placa de Petri de 90 milímetros. Coloque el molde sobre la placa de Petri, permitiendo que los bordes de las laminillas apiladas se sumerjan en ángulo bajo la superficie de aro.

Dejar reposar durante 30 minutos. Retire el molde de la laminilla y utilice agua para peces fresca que contenga anestésico trica en una proporción de uno a 25. Para cubrir la laminilla, imprima aros y realice inyecciones en pez cebra con colorante fluorescente.

Utilice un sistema de microinyección estándar compuesto por un compresor de aire conectado a un sistema regulador de presión que alimenta un porta-pipetas recto para uso con capilares de 1,0 de diámetro externo. El porta-pipetas debe alojarse dentro de un manipulador microscópico compacto MN 33. Un micromanipulador de control en tres ejes fijado a una placa base de acero mediante un soporte magnético y un microscopio estereoscópico para disección, que permite visualizar, manipular e inyectar embriones, mientras se mantienen peces cebra en condiciones estándar según se describe en el protocolo escrito.

Utilice líneas de pez cebra de tipo salvaje o transgénicas según corresponda al experimento. Mantenga una densidad de carga de 15 machos y 15 hembras por tanque de ocho litros para asegurar la recolección máxima de huevos sin perturbar a los peces. Sumerja los tanques de reproducción en los tanques de cría de tipo salvaje la tarde anterior a la recolección.

El día de la recolección, permita de 30 a 40 minutos para que los peces se reproduzcan. Luego, utilice un colador de malla y agua de acuario fresca para recolectar y enjuagar los huevos. Deposite los huevos limpios en una placa de Petri de 90 milímetros que contenga medio para embriones e incube a 28,5 grados Celsius para inhibir la miogénesis.

A las ocho horas posteriores a la fertilización o HPF, transfiera los embriones viables con el mínimo volumen de líquido a nuevas placas de Petri que contengan de uno a 100 PTU en medio para embriones e incube adicionalmente a 28,5 grados Celsius.

Utilice pinzas de punta fina para romper el extremo de la aguja. Luego, mueva el RD hacia la punta de la aguja maximizando la duración del pulso hasta el ajuste de minutos. Cuando la solución alcance la punta, regrese a milisegundos.

Coloque un micrómetro sobre la platina del microscopio y, mediante el regulador de presión y los ajustes en la punta de la aguja, regule el tamaño de la gota expulsada a un diámetro de 100 micrones o un volumen de 0,5 nanolitros antes de la inyección. Prepare dos placas de Petri de 35 milímetros, cada una conteniendo cinco mililitros de medio para embriones; etiquete una como trica y la otra como recuperación.

Agregue 200 microlitros de trica stock al platillo etiquetado con trica. Una vez listo para inyectar, seleccione un embrión individual a las 72 HPF. Transfiera la mínima cantidad de líquido al platillo de trica y supervise la actividad del embrión.

Una vez que el embrión esté anestesiado, transfiéralo al molde de inyección y oriente el embrión en la ranura de modo que el lado izquierdo quede hacia arriba, posicionando el corazón en el lado izquierdo del campo de visión. Para inyectar el RD en el corazón, utilice la aguja para atravesar el pericardio e inyecte un nanolitro de RD en la cavidad pericárdica.

Después de retirar la aguja, transfiera el embrión inyectado con el mínimo volumen de líquido al recipiente de recuperación y observe durante un minuto. Luego, transfiera el embrión individual a una placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de medio fresco para embriones con PTU y rotule adecuadamente. Después de inyectar al menos 10 embriones por grupo experimental, incube a 28,5 grados Celsius durante tres horas.

A las tres horas posteriores a la inyección o HPI, anestesiar los embriones como se describió anteriormente. Transferirlos a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga metilcelulosa al 3%. Empujar suavemente los embriones dentro de la metilcelulosa y orientarlos de modo que el lado lateral pueda ser observado.

Utilizando un filtro de emisión de 570 nanómetros para luz UV, adquiera una imagen del embrión. Permita que el embrión se recupere antes de devolverlo al pocillo designado; adquiera imágenes para todos los embriones inyectados y luego continúe la incubación a 28,5 grados Celsius. Después de adquirir una segunda serie de imágenes a las 24 HP, utilizo el software ImageJ para cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada embrión inyectado, abriendo una imagen y especificando una región de interés o ROI.

Al seleccionar editar selección, especifique y establezca el valor en 100 píxeles cuadrados. Coloque el corazón en el centro de la ROI y elija analizar, establecer mediciones y configure las mediciones para incluir la escala de grises media y el área. Luego realice la medición, cuantifique la fluorescencia para cada conjunto de imágenes a las 3 HPI y 24 HPI por embrión, y transfiera los valores promedio de escala de grises a una hoja de cálculo para su posterior procesamiento.

Utilice un software adecuado para realizar el análisis estadístico y comparar los grupos en cuanto a significancia estadística mediante la prueba T de Student, como se muestra aquí. La inyección de RD en embriones de pez bbbs con morfo nueve resultó en el 40 % de los embriones desarrollando quistes fric en posición ventral a los cinco días post-fecundación. Además, los peces morfin mostraron una reducción en la capacidad de eliminar el colorante fluorescente tras 24 HPI en comparación con los controles.

Una vez, un grupo de 10 peces puede ser inyectado dentro de los 15 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aprovechar la transparencia óptica del pez cebra para monitorear cuantitativamente la eliminación temporal de un colorante fluorescente microinyectado como una lectura efectiva de la función renal del pez cebra.