Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

El objetivo general de este procedimiento es generar un ensayo cuantitativo de la función renal en peces cebra. Esto se logra anestesiando primero embriones de pez cebra a 72 HPF. A continuación, los embriones se transfieren a un molde de inyección y se orientan de modo que sus corazones queden a la izquierda del campo de visión.

A continuación, se inyecta en la cavidad pericárdica un tinte fluorescente dextra para el rumine y se requieren imágenes fluorescentes de la región cardíaca mediante un microscopio de disección de epifluorescencia. En última instancia, el aclaramiento renal de un tinte fluorescente se evalúa mediante microscopía de epifluorescencia. La principal ventaja de esta técnica es que produce una lectura cuantitativa de la función renal del pez cebra sin necesidad de análisis de sangre o orina, que no son posibles en el pez cebra.

Este método proporciona una poderosa herramienta para evaluar la función renal en modelos de enfermedad del pez cebra. Después de tirar de las agujas y preparar un molde de acuerdo con el protocolo de texto, mezcle el molde vertiendo primero una solución de aro al 2% hecha en agua de pescado en una placa de Petri de 90 milímetros. Coloque el molde en la placa de Petri, permitiendo que los bordes deslizantes apilados se sumerjan en ángulo debajo de la superficie agrícola.

Deje que se asiente durante 30 minutos. Retire el yeso de deslizamiento y use agua de pescado fresca que contenga anestésico trica en una proporción de uno a 25. Para cubrir el portaobjetos se imprime aros para realizar inyecciones de tinte fluorescente en peces cebra

Utilice una configuración de microinyección estándar que consta de un compresor de aire conectado a un sistema regulador de presión que alimenta a un soporte de pipeta recto para su uso con capilares de 1,0 de diámetro exterior. El soporte de pipeta debe estar alojado dentro de un MN 33 compact. Micro manipulador de control de tres ejes asegurado a una placa base de acero por un microscopio de disección de usuario de soporte magnético para visualizar, manipular e inyectar embriones mientras se mantiene el pez cebra utilizando las condiciones estándar como se describe en el protocolo de texto.

Utilice líneas de peces cebra de tipo silvestre o transgénicos, según corresponda para el experimento. Mantener una densidad de población de 15 machos a 15 hembras por tanque de ocho litros para garantizar que se recoja el máximo de huevos sin molestar a los peces. Sumerja los tanques de cría en tanques de almacenamiento de tipo salvaje la noche antes de la recolección.

El día de la recolección, espere de 30 a 40 minutos para que los peces desoven. Luego use un colador de malla y agua fresca del acuario para recolectar y enjuagar los huevos. Deposite los huevos limpios en una placa de Petri de 90 milímetros que contenga embrión, medio, e incube a 28,5 grados centígrados para inhibir la miogénesis.

A las ocho horas. Post fertilización o HPF. Transfiera los embriones viables en un líquido mínimo a placas de Petri frescas que contengan de uno a 100 PTU en el medio embrionario y luego incube a 28,5 grados Celsius.

Use pinzas de punta fina para romper el extremo de la aguja. A continuación, mueva el RD a la punta de la aguja maximizando la duración del pulso hasta el ajuste de minutos. Cuando la solución llegue a la punta, vuelva a cambiar a milisegundos.

Coloque un micrómetro en la platina del microscopio y, con el regulador de presión y los ajustes en la punta de la aguja, ajuste el tamaño de la gota de expulsión a 100 micras de diámetro o un volumen de 0,5 nanolitros antes de la inyección. Configura 2 placas de Petri de 35 milímetros. Cada uno de los cuales contiene cinco mililitros de medio embrionario etiqueta una trica y la otra recuperación.

Agregue 200 microlitros de caldo de trica al plato etiquetado con trica. Una vez que esté listo para inyectar, seleccione un embrión individual a 72 HPF. Transfiera el mínimo de líquido a la placa trica y controle la actividad del embrión.

Una vez anestesiado el embrión, transfiérelo al molde de inyección y oriéntalo en el canal de forma que el lado izquierdo quede hacia arriba. Colocar el corazón en el lado izquierdo del campo de visión. Para inyectar la RD en el corazón, use la aguja para perforar el pericardio e inyectar un nanolitro de RD en la cavidad pericárdica.

Después de retirar la aguja, transfiera el embrión inyectado en un líquido mínimo a la placa de recuperación y controle durante un minuto. A continuación, transfiera el embrión individual a una placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de medio para embriones frescos que contenga PTU y etiquételo adecuadamente. Después de inyectar al menos 10 embriones por grupo experimental, incubar a 28,5 grados centígrados durante tres horas.

A las tres horas después de la inyección o HPI embriones anestesiados como se describió anteriormente. Y transfiera a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga 3% de metilcelulosa. Empuje suavemente los embriones hacia la metilcelulosa y oriéntelos de manera que se puedan obtener imágenes del lado lateral.

Utilizando un filtro de emisión de 570 nanómetros para luz ultravioleta, adquiera una imagen del embrión. Permita que el embrión se recupere antes de reemplazarlo en el pozo designado, adquiera imágenes de todos los embriones inyectados, luego continúe incubando a 28.5 grados Celsius. Después de adquirir una segunda ronda de imágenes a 24 HP, utilizo el software image J para cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada embrión inyectado abriendo una imagen y especificando una región de interés o ROI.

Al elegir editar selección, especifique y establezca el valor en 100 píxeles cuadrados. Coloque el corazón en el centro del ROI y elija analizar, establecer mediciones y configurar las mediciones para incluir la escala de grises media y el área. A continuación, realice la medición, cuantifique la fluorescencia de cada conjunto de imágenes a tres HPI y 24 HPI por embrión y transfiera los valores medios de la escala de grises a una hoja de cálculo para su posterior procesamiento.

Utilice el software adecuado para realizar análisis estadísticos y comparar grupos para determinar la significación estadística utilizando la prueba T del estudiante, como se muestra aquí. La inyección de RD en peces inyectados con bbbs nine Morpho dio como resultado que el 40% de los embriones desarrollaran quistes frícolos propensos cinco días después de la fertilización. Además, los peces morfina mostraron una reducción en la capacidad de eliminar el tinte fluorescente después de 24 HPI en comparación con los controles.

Una vez que se debe, se puede inyectar un grupo de 10 peces en 15 minutos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aprovechar la transparencia óptica del pez cebra para monitorear cuantitativamente el aclaramiento temporal de un tinte fluorescente microinyectado como una lectura efectiva de la función renal del pez cebra.