Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

El objetivo general de este procedimiento es permitir el análisis de lapso de tiempo de diversos procesos de desarrollo utilizando un microscopio de disección fluorescente con estrategias simples para el realineamiento después de derivar en cualquier dirección. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, ya que permite la observación directa del desarrollo de tejidos y órganos en embriones vivos durante varias horas. La principal ventaja de este método es que es una alternativa asequible y fácil de usar a las técnicas más complejas que normalmente se utilizan para el registro de lapso de tiempo de tejidos y órganos en desarrollo, como el escaneo láser o la microscopía iluminada.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las alteraciones espaciales y temporales que ocurren durante el desarrollo de los embriones y larvas de peces barrenderos, también se puede aplicar para investigar los procesos de desarrollo temprano y otros organismos modelo. Además, es adecuado para observar procesos dinámicos en organismos adultos, como la curación y regeneración de raíces. En la preparación, identifique los peces adultos altamente reproductivos a partir de la línea de expresión de GFP transgénica.

En la tarde anterior a la microinyección de la planta, se colocaron cinco parejas de peces reproductivos macho-hembra en cinco contenedores de cría. En los recipientes, mantenga el macho y la hembra separados por un colador extraíble durante la noche. A la mañana siguiente, justo después de que se enciendan las luces, coloque un macho y una hembra juntos sobre el colador, lo que evitará que se coman sus huevos.

Ahora, observa a los peces mientras desovan. Una vez que la pareja produzca unos 50 huevos, sepáralos. A continuación, transfiera los óvulos con una pipeta Pasteur a una placa de Petrie llena de agua de embriones para una primera ronda de inyección.

Repita este proceso para cada par acoplado. Si se necesitan huevos adicionales, las mismas parejas de apareamiento se pueden juntar y separar varias veces. Para la microinyección, la preparación avanzada de platos y agujas de inyección se realiza de una manera bastante estándar.

Los detalles se pueden encontrar en el protocolo de texto. Comience cargando una aguja de inyección preparada. Con una punta de microcargador, rellene la aguja con dos microlitros de solución de trabajo de MO y luego coloque la aguja en un micromanipulador.

Luego, se puede abrir la punta de la aguja. Mientras lo observa con el microscopio de disección, use pinzas para pellizcar el extremo o empuje la punta contra una superficie rígida. A continuación, calibrar el volumen de inyección inyectando la solución de MO en una gota de aceite mineral en una retícula.

Ajuste la inyección para hacer gotas de 75 micras que corresponderán a unos 200 picolitros de solución. A continuación, prepare los embriones que se van a inyectar. Coloque los aproximadamente 21 embriones en etapa celular a lo largo de la ranura de la placa de microinyección con el polo vegetal orientado hacia el enfoque de la aguja de microinyección, que está en un ángulo de 45 grados con respecto a la ranura.

Ahora, inyecta los embriones. Con la aguja, perfore el corion y la yema, luego inyecte la solución de Morpholino cargada en la yema. Esto funciona para embriones en la etapa de una o dos células.

Después de inyectar todos los embriones, use un Pasteur de diámetro ancho para recogerlos. Transfiera los embriones inyectados a placas de Petri llenas de agua para embriones e incube a 28,5 grados centígrados. Más tarde en la tarde, extraiga los embriones muertos y reemplace el agua del embrión.

A la mañana siguiente, después de que los embriones hayan pasado por la gastrulación, inhiba su melanización reemplazando su agua con agua embrionaria que contenga una pequeña cantidad de PTU. Tenga cuidado, la PTU interrumpirá el desarrollo adecuado antes de la gastrulación. Más tarde, en la etapa de desarrollo deseada, descorionar los embriones con pinzas afiladas.

Usando el microscopio, agarre el corion con un par de pinzas e intente agarrar el otro lado del corion con un segundo par de pinzas. Luego, separa con cuidado las pinzas sin alterar el embrión. A continuación, anestesiar los embriones con tricaína y proceder a incrustar los embriones y la agarosa en una rejilla de reubicación de 15 micras colocada en una microplaca con fondo de vidrio.

Luego, cargue un mililitro de alícuotas de agarosa derretida en tubos de reacción de 1,5 mililitros. Coloque los tubos en bloques de calor a 36 grados centígrados y espere a que se enfríen. A continuación, con una pipeta de diámetro ancho, transfiera un embrión a la microplaca.

Extrae el exceso de agua del embrión y cubre el embrión con agarosa. Mientras la agarosa aún está líquida, utilice dos pequeñas puntas de pipeta para orientar los embriones. Coloque la estructura de interés, en este caso, el pronefros, lo más cerca posible del fondo de vidrio y cerca de la rejilla.

La cuadrícula no debe superponerse a la estructura de interés. Es ventajoso incrustar hasta cuatro embriones en diferentes microplacas, y planear obtener imágenes de la mejor. La incrustación adecuada necesita algo de práctica.

Mientras la agarosa aún está líquida, el embrión debe orientarse en la posición deseada. Si se trata de un pronefros cerca del fondo de vidrio, y a una distancia adecuada de la rejilla de reubicación. Revisa la agarosa de forma rutinaria.

Una vez que esté lo suficientemente duro como para sostener los embriones, déjelo reposar durante otros dos o tres minutos. A continuación, superponga el embrión incrustado con agua embrionaria que contenga trazas de PTU y tricaína. Decanta o extrae el exceso de agua del embrión y bloquea la tapa para evitar la evaporación.

El resultado no debe tener burbujas de aire. Ahora se puede obtener una imagen del embrión con la parte inferior de cristal orientada hacia la lente del objetivo. Utilizando la preparación para hacer imágenes de lapso, por ejemplo, tomando imágenes de pila Z periódicamente durante varias horas, es necesario corregir la deriva focal.

Si es posible, aplique una estrategia de enfoque automático. Alterne la opción de enfoque automático en el control de software. Para el canal de referencia, elija el canal de campo claro de luz transmitida para minimizar la fototoxicidad.

También es esencial elegir un rango de búsqueda dependiente de la muestra lo suficientemente grande para que el enfoque automático funcione correctamente. Antes de recopilar imágenes, coloque un punto particular de la cuadrícula impresa cerca de la estructura de interés en el punto de mira del software, luego guarde esta posición usando una captura de pantalla. A continuación, justo antes de que finalice cada intervalo de tiempo de imagen, consulte la captura de pantalla y reajuste la posición del escenario y el enfoque si el enfoque automático no está en uso.

El método presentado se utilizó para analizar el desarrollo renal en embriones morfados WT1A de una línea de pez cebra transgénico. Durante el nefrogénico temprano, esta línea eligió la fluorescencia verde en el mesodermo intermedio donde surgen los progenitores renales, y más tarde durante el desarrollo en los túbulos en formación y los primordios de la nefrona. Las imágenes de lapso de tiempo revelaron una nefrogénesis normal en los embriones inyectados con Morpholino de control.

A las 20 horas después de la fertilización, los túbulos pronefricos en desarrollo eran visibles. En sus extremos anteriores, se pudo detectar una acumulación esférica de células que representan los primordios de la nefrona en formación. Durante las horas siguientes, los túbulos y los primordios de las nefronas crecieron, y los primodios comenzaron a fusionarse en la línea media.

Por el contrario, la nefrogénesis se vio gravemente alterada en los mutantes. Aunque las estructuras tubulares positivas para GFP fueron visibles a las 20 horas después de la fertilización, estaban difusas y poco desarrolladas. Las imágenes de lapso de tiempo mostraron que los primogenios de la nefrona nunca se formaron, y un número sorprendente de células fluorescentes ubicadas fuera de las pronefronas en desarrollo migraron ventralmente, abandonando el campo pronefrico.

Al intentar este protocolo, es importante recordar que la ausencia de equipos adicionales, como el control de temperatura o las mesas antievaporación, requiere controles regulares de desviaciones y reajustes. Siguiendo este procedimiento, los embriones de imagen se pueden procesar para realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, la incetrohipertización o la PCR en tiempo real con el fin de identificar componentes específicos de células, tejidos o para evaluar la expresión génica.