Name: Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprende a segmentar datos complejos de microscopía electrónica 3D mediante métodos manuales y automatizados. Esta guía práctica ayuda a investigadores a seleccionar la estrategia óptima para extraer características celulares con precisión.

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Nos gustaría reconocer y agradecer a Tom Goddard de la Universidad de California en San Francisco por su infinita ayuda con Chimera, a Joel Mancuso y Chris Booth de Gatan, Inc. por su ayuda con la recopilación de datos SBF-SEM del conjunto de datos de bacterias, Doug Wei de Zeiss, Inc. por su ayuda con la recopilación de datos FIB-SEM del conjunto de datos de células epiteliales, Kent McDonald en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad de California en Berkeley para asesorar sobre la preparación de muestras, imágenes TEM y tomografía, Roseann Csencsits en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley por su ayuda en la toma de la imagen crio-TEM, Elena Bosneaga para la criosección del conjunto de datos de plantas, Jocelyn Krey de la Universidad de Salud y Ciencias de Oregón para la disección del tejido del utrículo, David Skinner en el Centro Nacional de Computación Científica de Investigación Energética (NERSC) y Jitendra Malik en la Universidad de California Berkeley por su asesoramiento en infraestructura de software, y Pablo Arbeláez de la Universidad de California Berkeley por sus contribuciones de códigos al script personalizado presentado en este artículo. 
La investigación fue apoyada por el Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Ciencia bajo el contrato No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], así como la subvención No. P01 GM051487 [M.A.] para el proyecto de células ciliadas del oído interno y el uso de instrumentación de microscopía.

1. Manual Abstraído Modelo Generación Nota: Los detalles de la metodología se describen a continuación son específicos de la quimera, pero otros paquetes de software pueden utilizarse en su lugar. Utilice este enfoque cuando el único objetivo es crear un modelo geométrico (por ejemplo, un modelo de bolas y palo) con el fin de realizar mediciones geométricas, en lugar de mostrar la forma del volumen de los objetos. <ol><li> Importe el volumen de datos en un programa adecuado para la generación manual de modelo abstracto. <ol><li> Seleccione Archivo&gt; Abrir mapa para tirar el cuadro de diálogo Abrir archivo. Navegue hasta la ubicación del archivo de mapa deseado. </li><li> Tire hacia arriba de la Volume Viewer (Herramientas&gt; Datos de Volumen&gt; Volume Viewer) y seleccione Opciones&gt; Estilo de visualización para mostrar los datos con diferentes estilos de reproducción. </li><li> Ajuste el umbral de la pantalla arrastrando la barra vertical en el histograma en el Visor de volumenventana. </li></ol></li><li> Navegue a través del volumen 3D (por ejemplo, rebanada por rebanada) para seleccionar un área de interés para la segmentación y aflora una sub-volumen más pequeño si es necesario. <ol><li> En el cuadro de diálogo Visor de volumen, haga clic en Eje, a continuación, seleccione X, Y o Z. </li><li> En el cuadro de diálogo Visor de volumen, seleccione Características&gt; Planes. Haga clic en uno para establecer la profundidad para mostrar el plano correspondiente al número en el cuadro de la izquierda y haga clic en Todas para ver todos los planos. </li><li> En el cuadro de diálogo Visor de volumen, seleccione Opciones&gt; Selección Subregión. <ol><li> Haga clic y arrastre para crear un cuadro rectangular alrededor de la región de interés. </li></ol></li></ol></li><li> Coloca los marcadores a lo largo de la característica de interés y conectarlos con engarces en su caso (a menudo realizan automáticamente por el programa) hasta que el modelo se ha completado. <ol><li> Desde la barra de menú Volume Viewer, seleccione Herramientas&gt;Diálogo trazador de volumen para abrir el diálogo de Tracer volumen. En el cuadro de diálogo de Tracer Volumen, seleccione Archivo&gt; Nuevo Set Marker. </li><li> En el cuadro de diálogo de Tracer Volumen, comprobar Mouse&gt; Coloque los marcadores en alta calidad, Coloque marcadores en los aviones de datos, mover y cambiar el tamaño de los marcadores, Link nuevo marcador al marcador seleccionado, y Link marcadores seleccionados consecutivamente. </li><li> Haga clic en la muestra de marcador de color y seleccione un color. Repita este paso para Enlace color. </li><li> Ingrese radios para los elementos de construcción de modelos de marcadores y enlaces. </li><li> En la ventana de Tracer Volumen, seleccione Coloque marcadores utilizando el botón [derecha] ratón e inserte radios para los marcadores y enlaces. </li><li> Haga clic derecho sobre los datos de volumen para iniciar el que se establecen los marcadores. Los marcadores se conectarán automáticamente. </li><li> En el cuadro de diálogo de Tracer Volumen, seleccione Archivo&gt; Guardar conjunto marcador actual, a continuación, Archivo&gt; Cerrar marcador conjunto. </li></ol></li&gt; <li> Abra un nuevo conjunto marcador (Paso 1.3.1) para comenzar a construir un modelo en una segunda característica de interés deseado. Utilizar colores contrastantes entre conjuntos de marcadores para enfatizar las diferencias en características. </li></ol> 2. Rastreo Manual de Funciones de interés Nota: Los detalles de la metodología se describen a continuación son específicos de Amira, pero otros paquetes de software pueden utilizarse en su lugar. Utilice este método cuando la densidad de población es relativamente pequeña y cuando la precisión de extracción de características es de suma importancia, como el trazado manual es un enfoque mucho tiempo. <ol><li> Datos sobre el volumen de importación en un programa con las opciones de rastreo manual. Software con esta capacidad en general ofrecen al menos una herramienta básica pincel. <ol><li> Para grandes volúmenes o tomografías (por ejemplo, de 16 bits 2048 x 2048 o mayor .rec o .mrc tomografías generada en IMOD): Seleccione Open Data&gt; clic derecho sobre filename.rec&gt; Formato ...&gt; Seleccione Raw como LargeDiskData </i&gt;&gt; Aceptar&gt; Cargar. Seleccione Parámetros de datos crudos adecuado de la información de cabecera&gt; Ok. Alternar y Guardar como un nuevo <a href="http://filename.am/">filename.am</a> archivo para su uso en los siguientes pasos. </li><li> Para los archivos de menor tamaño de imagen 3D de pila (por ejemplo, .tif 3D o .mrc o rec): Datos Abiertos&gt; Seleccionar filename.tif o filename.mrc. Activar y haga clic derecho&gt; Guardar como <a href="http://filename.am/">filename.am</a> . Si se genera un error o el programa no responde, el archivo puede ser demasiado grande y se puede abrir siguiendo el Paso 2.1.1. </li></ol></li><li> Navegue a través de los cortes para seleccionar un sub-volumen 3D para la segmentación, y después recortar a esta área de interés. <ol><li> En la ventana Visor 3D, seleccione Orthoslice abrir el archivo de imagen. Usar control deslizante en la parte inferior para desplazarse a través de las rebanadas. </li><li> Para recortar datos más grandes abiertos como LargeDiskData, toggle nombre del archivo en la ventana de piscina&gt; Haga clic derecho&gt; LatticeAccess. Enter Tamaño de la caja deseada&gt; Aplicar. Guardar nuevo archivo. </li></ol></li><li> Crear archivo de segmentación. <ol><li> Mueva el archivo en la ventana de piscina&gt; Haga clic derecho&gt; Etiquetado&gt; LabelField. Un nuevo archivo se creará y se carga automáticamente en la pestaña Segmentación Editor. </li></ol></li><li> Trazar la frontera de la primera característica de interés, a continuación, rellene el trazo a mano o mediante el uso de un comando específico para el software utilizado. Siga la característica de interés a través de todas las divisiones y repetir la segmentación trazado manual. Utilice los siguientes comandos al utilizar Amira: <ol><li> Para utilizar la herramienta Pincel, alterar el tamaño del pincel como se desee, a continuación, utilizar el puntero del ratón para trazar la frontera de la característica de interés. </li><li> Llene el área de trazado con acceso directo &quot;f&quot;. Añadir a la selección haciendo clic en el botón con el signo más o el acceso directo &quot;a&quot;. Si es necesario, pulse &quot;u&quot; para deshacer, y &quot;s&quot; para restar o borrar. </li></ol&gt; </li><li> Generar un renderizado de superficie para la visualización y cualitativa básica o análisis cuantitativo por el software de instrucciones guía del usuario. <ol><li> En la pestaña piscina de objetos, cambiar el nombre del archivo-labels.am en la ventana de piscina&gt; Haga clic derecho&gt; SurfaceGen. </li><li> Seleccione Propiedades superficiales deseadas&gt; Aplicar. Un nuevo filename.surf archivo se creará en la piscina. </li><li> Para visualizar el volumen segmentado, alternar filename.surf en ventana piscina&gt; Haga clic derecho&gt; SurfaceView. </li><li> Utilice las herramientas de la ventana 3dviewer para mover, rotar y hacer zoom en el volumen 3D. </li></ol></li><li> Extraer las densidades exactas y determinar medidas, como el volumen o superficie. Exportación a otros programas de visualización más avanzado, análisis y simulación. <ol><li> En la ventana de 3dviewer, haga clic en la herramienta Medida&gt; Seleccione la opción adecuada (longitud y ángulo 2D 2D para mediciones en un solo plano 2D, 3D longitud y ángulo 3Dpara mediciones en un volumen 3D). </li><li> Haga clic en la superficie de malla para medir la longitud deseada, la distancia y los ángulos. Los valores se muestran en la ventana Propiedades. </li></ol></li></ol> 3. automatizado de segmentación basada en la densidad Nota: Los detalles de la metodología se describen a continuación son específicos de Amira, pero otros paquetes de software pueden utilizarse en su lugar. <ol><li> Utilice este enfoque en conjuntos de datos con cualquier variedad de contraste, nitidez, o hacinamiento de retirar las densidades de interés. </li><li> Datos sobre el volumen de importación en un programa dotado de umbral, varita mágica, u otras herramientas basadas en la densidad para la segmentación automática. Siga los pasos descritos en 2.1-2.1.2 en las instrucciones para el trazado manual. </li><li> Navegue a través de las rebanadas y seleccionar el área para la segmentación. Si es necesario, recortar un sub-volumen 3D más pequeña para la segmentación. Siga los pasos descritos en 2.2-2.2.2 en las instrucciones para el trazado manual. </li><li> Seleccione la densidad deuna característica de interés, normalmente haciendo clic o la colocación de un punto de marca o de anclaje en la función. Si se permite en el software, introduzca un rango de números que abarca intensidad de los píxeles de la función y ajustar esta tolerancia si lo deseas. Densidades pertenecientes a la característica serán recogidos de conformidad con la intensidad de valor de píxel o la tolerancia del ancla. Utilice los siguientes comandos al utilizar Amira. <ol><li> Utilice la herramienta Varita mágica para las características con márgenes distinguibles. <ol><li> Haga clic en el área de interés, y luego ajustar los deslizadores en pantalla y Masking para capturar correcta gama de valores para que la característica está totalmente destacó. Añadir selección con acceso directo &quot;a&quot;. </li></ol></li><li> Utilice la herramienta Umbral de características sin márgenes claramente distinguibles. </li><li> Seleccione el icono Umbral. Ajuste el deslizador para ajustar la densidad dentro del rango deseable de manera que sólo las características de interés están enmascarados. Haga clic en el botón Seleccionar, a continuación, agregar la selección con acceso directo220; un &quot;. </li><li> Para toda segmento de volumen, seleccione Todos los cortes antes de añadir selección. </li><li> Para eliminar el ruido, seleccione Segmentación&gt; Eliminar Islas y / o segmentación&gt; etiquetas suaves. </li></ol></li><li> Generar una superficie para la visualización y el análisis cualitativo como se describe en la sección de trazado manual 2.6-2.6.2. Si se desea, la exportación a otros programas para la visualización 3D adecuado, análisis cuantitativos y simulaciones. </li></ol> 4. hecho a medida Automated Segmentación Nota: Utilice este método para crear secuencias de comandos personalizadas para la segmentación automática, que requiere experiencia previa en informática, pero permite la posibilidad de crear un modelo preciso de la densidad de un gran volumen. <ol><li> Herramientas (Ejemplo de una segmentación de Shape-Supervisado en MATLAB 27) <ol><li> Imagen de tratamiento previo:, mejora de la imagen de eliminación de fondo y realizar des-noisingutilizando la siguiente tubería: <ol><li> Cargue la imagen utilizando el comando imread. <ol><li> En la línea de comandos, escriba: &gt;&gt; im = imread ($ image_path), donde $ image_path es la ubicación de la imagen a analizar. </li></ol></li><li> Desde la caja de herramientas de procesamiento de imágenes, llame Wiener filtro usando una proporción estimada o conocida por el ruido-potencia de la señal (NSR). </li><li> En la imagen procesada con anterioridad, llame a la función de apertura de imagen imopen para estimar la capa de fondo, a continuación, asignar el resultado como una máscara diferente. <ol><li> En la línea de comandos, escriba:. &gt;&gt; Fondo = imopen (im, Strel ($ shape_string, $ size)), en este método, $ shape_string es igual a &#39;disco&#39; de $ variable de tamaño viene dado por el analizador es decir &gt;&gt; fondo = imopen (im, Strel (&#39;disco&#39;, 15)). </li></ol></li><li> Restar la imagen filtrada con el fondo. <ol><li> En la línea de comandos, escriba: &gt;&gt; im2 = im -fondo </li></ol></li><li> Dependiendo de la calidad de los resultados, realice la normalización de imágenes con o sin método de adaptación de Otsu 28, que se puede llamar mediante el imadjust función de la Imagen Processing Toolbox. <ol><li> En la línea de comandos, escriba: &gt;&gt; im3 = imadjust (IM2) </li></ol></li><li> Preparar las características de interés para la segmentación, la limitación de las regiones de interés recortando la imagen normalizada. <ol><li> El uso del comando imtool, explorar la región de interés que ha de ser cosechado y proporcionar las coordenadas para el comando: &gt;&gt; im3_crop = imcrop (im3, [x1 y1 x2 y2]), donde el vector [x1 y1 x2 y2] corresponde a la región cuadrada a recortar. </li></ol></li></ol></li><li> Reconocimiento de formas / clasificación de forma supervisada: Capacitar al algoritmo, proporcionando ejemplos concretos para cada categoría diferente de los objetos (los rastros lineales en una imagen 2D a través de las características de interés). <ol><li> Compruebe que VLFEAT 29 API se ha instalado correctamente y visitar el sitio web de VLFEAT para la documentación más detallada. </li><li> En la línea de comandos, escriba: &gt;&gt; [ÁRBOL, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K, $ NLEAVES) donde $ K es el número de grupo para ser utilizado o el número de clases que el observador quiere organizar los datos en, y $ NLEAVES es el número deseado de racimos de la hoja, es decir &gt;&gt; [ÁRBOL, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100) </li><li> Utilizar las funciones segmentadas manualmente como entrada para VLFeat. NOTA: Esta biblioteca de código abierto basada en C realizará parches de píxel, la agrupación de parches y posicionamiento centro de la agrupación en función del tipo de método elegido para trabajar mejor para los conjuntos de datos. Las opciones disponibles van desde agrupamiento k-mean a basado Texton-se aproxima a 30, y la salida es una matriz numérica que describe las características ideales en función de los ejemplares dados. </li></ol></li></ol></li><li> Segmentación: Utilice este fully automatizado, aunque computacionalmente costosa, enfoque para segmentar múltiples clases de objetos de forma simultánea, que se escriben como mapas separados para su posterior visualización y análisis. <ol><li> Cargue la matriz numérica generada anteriormente (modelo). </li><li> Llame a la función de la máquina de soporte vectorial (SVM) en VLFeat, utilizando el modelo y la imagen que se segmentado como una entrada. <ol><li> En la línea de comandos, escriba: &gt;&gt; [w, b] = vl_svmtrain (x, y, 0.1), donde x es el original recortada imagen im2_crop e y es la imagen objetivo, la imagen que se ha segmentado manualmente. Utilice &gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG (I, etiquetas) para dar color a los resultados de acuerdo a las etiquetas generadas por la agrupación. NOTA: A partir de las características del modelo, VLFeat clasificará la imagen en el número de clases (las características de interés) asignados desde el principio. Dependiendo del grado de exactitud deseado, es posible combinar este método con otros enfoques o estimación CLUSTer parámetros tales como centros de casco y de racimo. La salida del algoritmo SVM es un modelo probabilístico y múltiples máscaras binarias de las clases deseadas en los nuevos conjuntos de datos. </li></ol></li><li> Guardar los resultados introduciendo el comando: &gt;&gt; imwrite (im, $ formato, $ archivo) donde $ formato es &#39;TIFF&#39; y $ nombre_archivo es la ruta para el archivo de salida. </li><li> Para la visualización de imágenes, introduzca el comando: &gt;&gt; imshow (im). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Tradicionalmente, la microscopía electrónica de campo (EM) se ha dividido en 1) la rama de la biología estructural mediante resolución TEM de alta y súper alta, por lo general se combina con los datos implícitos o explícitos con un promedio de investigar la) estructura tridimensional (3D de complejos macromoleculares con una composición definida y típicamente un tamaño relativamente pequeño 1-4, y 2) la rama de formación de imágenes celular en el que la totalidad de escenarios celulares se visualizan 1,5,6. Mientras que la rama de la biología estructural ha experimentado un desarrollo espectacular en los últimos cuatro decenios, la rama de biología celular se restringe sobre todo a dos dimensiones, a menudo en muestras de menos-que-óptimamente conservados. Sólo con el advenimiento de la tomografía de electrones en la última década ha célula biológica imagen ultraestructural ampliado en la tercera dimensión 5,7, donde normalmente un promedio no se puede realizar como los escenarios móviles, y por lo tanto las características de interés, suelen ser único. Aunque escenas celulares visualizados son a menudo impresionante para el ojo, la extracción eficiente de las características de interés y el posterior análisis cuantitativo de tales volúmenes celulares altamente complejas queda atrás, en parte porque la composición de proteínas precisa generalmente se desconoce, por lo tanto haciendo que sea difícil de interpretar estos celular volúmenes 3D. Para esta fecha, la amplia experiencia biológica es a menudo necesaria para poder interpretar las tomografías complejas, o incluso para identificar las regiones importantes y componentes esenciales en el volumen 3D. Como una complicación adicional, la visualización de volúmenes 3D es notablemente no trivial. Volúmenes 3D pueden ser considerados y, por tanto visualizar como pilas de imágenes 2D. Inspección rebanada por rebanada de imágenes 2D secuenciales reduce la complejidad, pero también los límites de extracción de características y el análisis cuantitativo de este modo a las dos dimensiones. Sin embargo, para la mayoría de los objetos en 3D, la representación de volúmenes 3D como meramente una pila de planos consecutivos conduce a una incompleta unad perspectiva sesgada en la naturaleza de un sistema en particular 3D. Los modos alternativos de inspección visual requieren o bien representación de volumen o de la prestación de la superficie, lo cual dado-la naturaleza a menudo densa de un volumen celular-puede conducir fácilmente a una vista obstruida de objetos anidados o abrumar a un usuario por completo, con lo que la segmentación manual interactivo difícil. Para remediar estas barreras, una gran variedad de extracción de características automatizado (segmentación) enfoques han sido desarrollados que son típicamente densidad-o 8-10 basado en gradiente. Sin embargo, estos métodos tienden a segmentar todo el volumen sin tener en cuenta cuáles son las áreas o características son de interés para el experto, aunque algunos métodos recientes pueden dirigirse a una característica específica de interés, tales como los filamentos de actina 11. Además, los programas de ejecución de segmentación automatizado a veces pueden resultar en la producción de un gran número de sub-volúmenes (por ejemplo, al aplicar Immersio cuencan segmentación) que a menudo necesitan ser fusionado vuelta manualmente en que comprende toda la característica de interés o ser sujeto a una mayor segmentación. Esto es válido en particular para los conjuntos de datos complejos y llenos de gente, por lo que los algoritmos informáticos más representación son incapaces de extraer sólo las características de interés con fidelidad, y los esfuerzos sustanciales de curación por un experto a menudo son necesarios para producir un volumen segmentado deseada. Por otra parte, las soluciones personalizadas a un problema muy específico se publican a menudo como un documento de reunión científica, con poco o ningún énfasis en haciéndolos amplia y completas herramientas accesibles a los investigadores que no tienen un conocimiento profundo de los campos de las matemáticas, la informática y / o gráficos por ordenador. Un entorno de software de programación adaptable, que contiene una serie de bibliotecas de análisis de imagen, puede ser un conjunto poderosa herramienta que permite a los usuarios escribir sus propios módulos de manera eficiente para la segmentación precisa. Sin embargo, este enfoque requiere extformación Ensive y un fondo en ciencias de la computación con el fin de aprovechar sus muchas características o capacidades para el análisis de imágenes. Uno puede trabajar dentro de un entorno de software versátil para determinados conjuntos de datos donde las características son más escasos, por ejemplo, mediante la utilización de potentes enfoques basados ​​en la forma que se basan en la geometría única de &quot;plantillas&quot; para separar los objetos de interés de su entorno 12,13 . Una variedad razonable de los paquetes de visualización de gráficos de ordenador existe para la segmentación manual interactivo y la construcción de modelos. Algunos paquetes están disponibles en el mercado, mientras que otros son de origen académico y distribuidos de forma gratuita, tales como: la Universidad de California en San Francisco Chimera 14, Universidad de Colorado IMOD 15, y la Universidad de Texas, Austin VolumeRover 16. Sin embargo, la gran variedad y complejidad de las características y capacidades de estos programas poseen agudice la curva de aprendizaje de each. Ciertos programas de visualización proporcionan modelos geométricos simples, tales como bolas y palos de diferentes tamaños, que se pueden colocar en los mapas de densidad con el fin de crear un modelo simplificado del volumen 3D compleja. Estos modelos permiten mediciones geométricas y volumétricas simples y por lo tanto, van más allá de la &quot;imagen bonita&quot;. Tal trazado manual de objetos funciona bien para volúmenes donde sólo un pequeño número de objetos necesidad de ser rastreado y se extrajo. Sin embargo, el reciente desarrollo de gran volumen de formación de imágenes 3D ultraestructural utilizando microscopía electrónica de barrido de haz de iones focalizado (FIB-SEM) 17-20 de bloque serial o microscopía electrónica de barrido cara (SBF-SEM) 21 presenta la complicación adicional de que el tamaño de los datos 3D conjuntos pueden ir desde gigabytes a decenas y cientos de gigabytes e incluso los terabytes. Por lo tanto, estos grandes volúmenes 3D son prácticamente inaccesibles para la extracción de características manual, y por lo tanto eficiente semi-automatizado hazaña guiada por el usuarioUre extracción será uno de los cuellos de botella para el análisis eficiente de volúmenes 3D en el futuro previsible. Presentado aquí son cuatro enfoques diferentes de segmentación que se utilizan habitualmente en una gran variedad de tipos de imágenes biológicas. Estos métodos se comparan entonces para determinar su eficacia para diferentes tipos de conjuntos de datos, lo que permite una recopilación en una guía para ayudar a los biólogos a decidir lo que puede ser el mejor enfoque de segmentación para la extracción de características eficaz de sus propios datos. Como los manuales de usuario detallados están disponibles para la mayoría de los programas descritos, el objetivo no es hacer que los potenciales usuarios familiarizados con cualquiera de estos paquetes particulares. En cambio, el objetivo es demostrar los puntos fuertes y las limitaciones de estas diferentes estrategias de segmentación mediante su aplicación a seis ejemplo conjuntos de datos con características diversas. A través de esta comparación, un conjunto de criterios se han desarrollado que se basa tanto en las características de la imagen objetiva de laConjuntos de datos 3D, como el contraste de datos, vivacidad, hacinamiento, y la complejidad, o se derivan de consideraciones subjetivas, como el objetivo deseado para la segmentación, las morfologías de las características para ser segmentados, la densidad de población de las características de interés, es decir, la fracción de el volumen ocupado por la característica de interés, y cómo se procede de manera óptima con recursos finitos, como el tiempo y la disponibilidad de personal. Estos diferentes conjuntos de datos de ejemplo ilustran cómo estos criterios objetivos y subjetivos pueden aplicarse secuencialmente en una variedad de combinaciones para producir un emparejamiento de ciertos enfoques de extracción de características con ciertos tipos de conjuntos de datos. Las recomendaciones que se dan se espera ayude novatos enfrentan a una gran variedad de opciones de segmentación elegir el enfoque de segmentación más eficaz para su propio volumen 3D. Mientras que el enfoque de este trabajo es la extracción de características, la atención a la recogida de datos y los datos de pre-procesamiento es crucial para s eficientesegmentation. A menudo la tinción de las muestras puede ser desigual, y por lo tanto, posibles artefactos de tinción debe ser considerado en el procedimiento de segmentación. Sin embargo, la mancha por lo general proporciona una mayor relación señal-ruido, y por lo tanto requiere menos filtrado y otro tratamiento matemático de los volúmenes celulares, lo que potencialmente podría también resultar en artefactos. Los conjuntos de datos de imagen RAW respectivos deben ser adquiridos en los ajustes de contraste y de píxeles cámara correctos, alineados, y reconstruida en un volumen 3D. Para tomografías, imágenes alineadas se reconstruyen típicamente usando ponderado de retroproyección, y luego el conjunto de datos es generalmente sometidos a algoritmos de eliminación de ruido, tales como la difusión anisotrópica no lineal 22, filtrado bilateral 23, o la mediana de filtrado recursivo 24. Datos de imágenes FIB-SEM y SBF-SEM se alinean mediante cortes consecutivos-cross correlación en XY programas que utilizan como ImageJ 25. Mejora de contraste y filtrado se pueden aplicar para aumentar las características deinterés y así de-ruido la pila de imágenes. El filtrado puede llevarse a cabo ya sea en todo el volumen antes de la selección subvolumen o en los subvolúmenes seleccionados, como los enfoques de filtrado pueden ser computacionalmente caro. Down-muestreo de los datos (binning), que se utiliza a veces para reducir el ruido y / o la reducción de tamaño del archivo, sólo se recomienda si los datos han sido sobremuestreada significativamente en comparación con la resolución anticipada. Después de reducción de ruido, las imágenes procesadas a continuación pueden ser segmentados por diferentes métodos, y el enfoque en este estudio está en los cuatro siguientes: (1) Manual de generación de modelo abstracto a través de la creación de un modelo de bola y el palo, (2) el trazado manual de las características de interés, (3) la densidad umbral basado automatizado, y (4) la segmentación automatizada hecho a medida a través de una secuencia de comandos para la segmentación específica del proyecto. Segmentación Boundary 8 y segmentación de cuencas inmersiva 10 mejores alternativas a umbral simple, pero tbueno pertenecer a la misma categoría y no se han incluido explícitamente en esta discusión. El trazado manual de densidades requiere esbozar las características de interés, corte por corte, que permite la retención de la densidad original de las respectivas áreas subcelulares. Este enfoque permite el máximo control del proceso de segmentación, pero es un proceso tedioso y de trabajo intensivo. Enfoques automáticos de segmentación de la densidad (y relacionados) a base de umbral son semi-automático, donde un algoritmo elige pixeles basado en un conjunto de parámetros definidos por el usuario. Varios (gratis) paquetes de visualización académicas, como UCSF Chimera, IMOD, Fiji 26, y VolumeRover están disponibles, así como comercial (que requieren licencias pagadas) paquetes, y ambos tipos suelen incluir uno o más de estos enfoques de segmentación. Los paquetes de software utilizados en este trabajo para ilustrar estos diferentes métodos incluyen tanto programas comerciales y s abiertos académicosOurce programas para generar manualmente un modelo abstracto, así como la segmentación manual y automatizado densidad. Sin embargo, el software de código abierto puede a veces ofrecer opciones más avanzadas a través de la posibilidad de personalización. Una comparación de estas técnicas que utilizan diferentes tipos de conjuntos de datos llevó a la siguiente presentación de las normas y directrices sobre la forma de abordar la segmentación de los diversos volúmenes 3D de datos biológicos, que a nuestro entender no ha sido aún publicados. Por lo tanto, esta es la primera comparación sistemática de los diferentes enfoques y su utilidad en conjuntos de datos con diferentes características para los usuarios con diferentes objetivos.

<table><tbody><tr><td>Amira</td><td>FEI Grupo</td><td></td> de Ciencias de la Visualización <td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td></tr><tr><td>Chimera</td><td>UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>Instituto Nacional de Salud</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>IMOD</td><td>Laboratorio de Boulder para Microscopía Electrónica 3D de Células</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td></tr> <tr><td>Photoshop,</td><td>Adobe http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB,</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>VLFeat,</td><td>VLFeat http://www.vlfeat.org/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desde voxels al conocimiento: una guía práctica para la segmentación del complejo microscopía electrónica 3d-data

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Enfoques modernos de microscopía electrónica 3D han permitido recientemente visión sin precedentes de la organización ultraestructural 3D de células y tejidos, lo que permite la visualización de grandes máquinas macromoleculares, tales como los complejos de adhesión, así como estructuras de orden superior, tales como el citoesqueleto y orgánulos celulares en su respectivo contexto celular y tisular. Dada la complejidad inherente de los volúmenes celulares, es esencial para extraer primero las características de interés con el fin de permitir la visualización, cuantificación, y por lo tanto la comprensión de su organización 3D. Cada conjunto de datos se define por las características distintas, por ejemplo, la relación señal-ruido, nitidez (nitidez) de los datos, la heterogeneidad de sus características, hacinamiento de características, presencia o ausencia de formas características que permiten una fácil identificación y el porcentaje de todo el volumen que una región específica de interés ocupa. Todas estas características deben ser consideradosla hora de decidir qué enfoque tomar para la segmentación. Los seis conjuntos de datos 3D ultraestructural distintos presentados fueron obtenidos por tres imágenes diferentes enfoques: tomografía electrónica manchado incrustado resina, se centró de iones de haz y la microscopía electrónica de barrido cara- bloque serial (FIB-SEM, SBF-SEM) de las muestras ligeramente manchadas y muy manchadas , respectivamente. Para estos conjuntos de datos, se han aplicado cuatro enfoques de segmentación diferentes: (1) la construcción de modelos totalmente manual seguido únicamente por la visualización del modelo, (2) segmentación de trazado manual de los datos seguidos por la representación de la superficie, (3) enfoques semi-automatizado siguieron por la representación de la superficie, o algoritmos de segmentación de diseño personalizado (4) automatizados seguido por la representación de la superficie y el análisis cuantitativo. Dependiendo de la combinación de las características del conjunto de datos, se encontró que típicamente uno de estos cuatro enfoques categóricos supera a los otros, pero dependiendo de la secuencia exacta de criterios, more de un enfoque puede tener éxito. Basándose en estos datos, se propone un esquema de clasificación que clasifica tanto objetivas características del conjunto de datos y criterios subjetivos personales para el análisis de los diferentes conjuntos de datos.

El cuello de botella para la microscopía electrónica 3D celular es la extracción de características (segmentación) en mapas muy complejos de densidad 3D. Hemos desarrollado un conjunto de criterios, que proporciona orientación sobre qué enfoque de segmentación (manual, semiautomático o automático) es el más adecuado para los diferentes tipos de datos, proporcionando así un punto de partida para la segmentación efectiva.

Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en segmentar características de interés a partir de conjuntos de datos complejos de microscopía electrónica 3D de células y tejidos, para analizar su organización tridimensional. Esto se logra mediante la recopilación de un conjunto de datos compuesto por imágenes individuales de microscopía electrónica. Los datos 2D brutos luego se reconstruyen en un volumen 3D y se filtran para reducir el ruido y realzar las características de interés; en una segunda etapa, se evalúan las características objetivas y subjetivas de los datos para determinar la mejor elección del método de segmentación.A continuación, ya sea mediante abstracción manual, generación de modelos o trazado manual de las características de interés, se realiza una segmentación automatizada basada en densidad o una segmentación automatizada personalizada para extraer las características de interés. Los resultados muestran modelos segmentados tridimensionales finales de las características de interés, basados en la clasificación de las características de la imagen y en objetivos personales para elegir el enfoque de segmentación óptimo.Una comparación entre los diferentes enfoques para cada conjunto de datos ayudará a seleccionar la estrategia de segmentación adecuada. Demostramos diferentes métodos para la extracción de características de interés. Debido a la complejidad de los volúmenes de microscopía electrónica subcelular, cada enfoque tiene sus ventajas y limitaciones.Por lo general, las personas nuevas en la segmentación pueden tener dificultades porque no siempre es claro identificar el mejor enfoque para diferentes conjuntos de datos. Junto con la expresión de opiniones de estudiantes de posgrado. Tai demostrará el procedimiento y será BU como investigador posdoctoral.En mi laboratorio, Amit Hassan, un asociado de investigación en mi laboratorio, y Joaquin Korea, un ingeniero de sistemas informáticos en mi laboratorio, el modelo abstracto manual se utiliza cuando el único objetivo consiste en crear un modelo geométrico con el fin de realizar mediciones geométricas. Para comenzar, importe el volumen de datos a un programa adecuado. Para la generación del modelo abstracto manual, en esta demostración se utiliza el software kymera.Primero, seleccione el archivo y ábralo para mostrar el cuadro de diálogo de apertura de archivo; navegue hasta la ubicación del archivo del mapa deseado. A continuación, abra el visor de volúmenes y seleccione el estilo de visualización de características para mostrar los datos con diferentes estilos de representación. Ajuste el umbral de visualización arrastrando la barra vertical en el histograma de la ventana del visor de volúmenes.Navegue por el volumen 3D para seleccionar un área de interés para la segmentación y recorte un subvolumen más pequeño si es necesario. En el cuadro de diálogo del visor de volumen, seleccione características, selección de subregión y haga clic y arrastre para crear un cuadro rectangular alrededor de la región de interés. A continuación, coloque marcadores a lo largo de la característica de interés y conéctelos con enlazadores cuando corresponda hasta que el modelo esté completo.Para lograr esto desde la barra de menú del visor de volumen, seleccione herramientas, diálogo del rastreador de volumen. Para abrir el diálogo del rastreador de volumen allí, seleccione archivo, nuevo conjunto de marcadores. En el diálogo del rastreador de volumen, active el ratón, coloque marcadores en alta densidad, coloque marcadores en los datos, los planos se mueven y el tamaño de los marcadores enlaza el nuevo marcador al marcador seleccionado y enlaza consecutivamente los marcadores seleccionados.Luego, en la ventana de trazado de volumen, seleccione colocar marcadores utilizando el botón derecho del ratón e inserte los radios para los marcadores y enlaces. A continuación, haga clic derecho sobre los datos de volumen para comenzar a colocar los marcadores. Los marcadores se conectarán automáticamente en el cuadro de diálogo de trazado de volumen.Seleccione el archivo, guarde el marcador actual. Establezca y luego cierre el marcador del archivo. Abra un nuevo conjunto de marcadores para comenzar a construir un modelo en una segunda característica de interés.Utilice colores contrastantes entre conjuntos de marcadores para resaltar las diferencias en las características. El trazado manual de características de interés es un enfoque que consume tiempo, utilizado cuando la densidad de población es relativamente baja y cuando la precisión en la extracción de características es fundamental. Para comenzar, importe los datos de volumen en un programa con opciones de trazado manual. Software.Con esta funcionalidad, por lo general se ofrece una herramienta básica de pincel. En esta demostración, el software Amira se utiliza para tomogramas grandes. Seleccione abrir datos y haga clic derecho sobre el nombre del archivo rec.Luego haga clic en formato, seleccione datos en bruto como datos de disco grande. Bien, y cargue. Seleccione los parámetros de datos en bruto adecuados a partir de la información del encabezado y haga clic en aceptar.Active y guarde con un nuevo nombre de archivo. archivo am. Para una secuencia de imágenes 3D, seleccione abrir datos y elija el nombre de archivo tiff o el nombre de archivo dot mrmc.Luego, active, haga clic derecho y seleccione guardar como nombre de archivo am. En la ventana del visor 3D, seleccione corte ortogonal para abrir el archivo de imagen. A continuación, utilice un control deslizante en la parte inferior para navegar a través de las secciones y recortar los datos más grandes abiertos como datos de disco grande.Active el nombre del archivo en la ventana de grupo, haga clic derecho y seleccione acceso a la red. Ingrese el tamaño de cuadro deseado, mueva el cuadro al área deseada y haga clic en aplicar. Guarde el nuevo archivo.A continuación, cree un archivo de segmentación alternando el archivo en la ventana de grupo. Luego, haga clic con el botón derecho y seleccione el campo de etiquetado. Se creará un nuevo archivo y se cargará automáticamente en la pestaña del editor de segmentación, así como en el grupo de objetos.Utilice la herramienta de pincel para trazar el borde de la primera característica de interés. Modifique el tamaño del pincel según desee y luego use el puntero del ratón para trazar el borde de la característica de interés. Rellene el área trazada con el atajo F. Agregue la selección haciendo clic en el botón con el símbolo de suma.Siga la característica de interés a través de todas las secciones y repita la segmentación por trazado manual. Genere una representación en superficie para la visualización y el análisis cualitativo o cuantitativo básico según las instrucciones del manual del usuario del software en la pestaña de grupo de objetos; active las etiquetas de nombres de archivo am en la ventana del grupo. A continuación, haga clic derecho y seleccione generación de superficie.Seleccione las propiedades de superficie deseadas y haga clic en aplicar. Se creará un nuevo archivo con el nombre surf en el grupo. Para visualizar el volumen segmentado, active o desactive el archivo con el nombre surf en la ventana del grupo.Luego, haga clic con el botón derecho y seleccione vista de superficie. Genere una superficie para la visualización y el análisis cualitativo según se describe en el protocolo escrito. Se utiliza una segmentación automatizada basada en densidad en conjuntos de datos con cualquier variedad de contraste, nitidez o grado de congestión para extraer las densidades de interés y comenzar a importar los datos de volumen a un programa equipado con una varita mágica de umbral u otras herramientas basadas en densidad para la segmentación automática.Como se hace en la técnica de trazado manual de características de interés, en esta demostración se utiliza el software Amira para características sin márgenes claramente distinguibles. Utilice la herramienta de umbral seleccionando el icono de umbral. Ajuste un control deslizante para modificar la densidad dentro del rango deseado, de modo que solo las características de interés queden enmascaradas.Haga clic en el botón seleccionar y luego agregue una selección haciendo clic en el botón con el símbolo de suma o mediante el atajo. Genere una superficie para la visualización y el análisis cualitativo según se describe en el protocolo del texto. Todos un cuarto enfoque.La segmentación automatizada personalizada puede utilizarse para segmentar eficientemente grandes conjuntos de datos, pero requiere conocimientos en programas como matlab. Consulte el video complementario sobre segmentación personalizada para obtener instrucciones paso a paso sobre este método. Seis conjuntos de datos de ejemplo fueron segmentados mediante cuatro enfoques: generación manual de modelos abstractos, trazado manual de características de interés, segmentación automatizada basada en densidad y segmentación automatizada personalizada. La generación manual de modelos abstractos fue eficaz para la resina.La tomografía teñida incluida con un propósito tenía como objetivo crear un modelo con fines cuantitativos, en lugar de extraer densidades exactas para la tomografía teñida incluida en resina de una pared celular vegetal. La segmentación automatizada basada en densidad fue la más eficaz para extraer rápidamente la celulosa a través de muchas secciones. Los métodos manuales requirieron más esfuerzo en solo unas pocas secciones de datos.La generación manual de modelos abstractos produjo el triplete de microtúbulos en la tomografía de etapa del cinocilio, mientras que los dos enfoques automatizados extrajeron las densidades más rápidamente y por ello fueron preferidos debido a la forma de las mitocondrias a partir de haces iónicos enfocados, y microscopía electrónica de barrido de células epiteliales mamarias. El trazado manual proporcionó el resultado más limpio y la baja densidad poblacional permitió una segmentación rápida. Dado el gran volumen que necesitaba ser segmentado, la segmentación automatizada personalizada resultó ser la más eficiente para segmentar los datos bacterianos de microscopía electrónica de barrido de superficie de bloque en serie.Aunque lleva mucho tiempo, el único método para extraer la microscopía electrónica de barrido por haz de iones enfocado de la membrana de células epiteliales mamarias fue el trazado manual. El desarrollo de los enfoques de segmentación allana el camino para que los investigadores en este campo emergente de la biología celular estructural exploren y determinen la arquitectura tridimensional celular a nivel de complejos macromoleculares, orgánulos y células en una gran variedad de cultivos celulares, cultivos de organoides o organismos modelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elegir y aplicar el enfoque de segmentación óptimo para su conjunto de datos.

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Segmentación basada en aprendizaje profundo de tomogramas crioelectrónicos

La criotomografía electrónica (crio-ET) permite la visualización en 3D de la ultraestructura celular con una resolución nanométrica, pero la segmentación manual sigue siendo lenta y compleja. Presentamos un novedoso flujo de trabajo que integra un software avanzado de realidad virtual para la segmentación de tomografías crio-ET, mostrando su efectividad a través de la segmentación de mitocondrias en células de mamíferos.

Aprovechamiento de la realidad virtual para la segmentación y el análisis inmersivos de datos de tomografía crioelectrónica

Se demuestra la fabricación de una etapa criogénica de bajo costo diseñado para adaptarse a la mayoría de los microscopios de luz reflejada. Esta etapa criogénica de laboratorio permite construir imágenes correlativas eficiente y confiable entre la luz y la crio-crio-microscopía electrónica.

Bajo Costo Cryo-microscopio de luz para la luz de la etapa de fabricación correlacionadas / Microscopía Electrónica

Un biorreactor presión cíclica capaz de someter a los tejidos del corazón de la válvula de presión a las condiciones fisiológicas y patológicas ha sido diseñado. Un programa LabVIEW permite a los usuarios para controlar la presión magnitud, amplitud y frecuencia. Este dispositivo puede ser utilizado para estudiar el tejido mecanobiología de las válvulas del corazón o células aisladas.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

Aprende a segmentar datos complejos de microscopía electrónica 3D mediante métodos manuales y automatizados. Esta guía práctica ayuda a investigadores a seleccionar la estrategia óptima para extraer características celulares con precisión.

Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data

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