Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data

El objetivo general del siguiente experimento consiste en segmentar características de interés a partir de conjuntos de datos complejos de microscopía electrónica 3D de células y tejidos, para analizar su organización tridimensional. Esto se logra mediante la recopilación de un conjunto de datos compuesto por imágenes individuales de microscopía electrónica. Los datos 2D brutos luego se reconstruyen en un volumen 3D y se filtran para reducir el ruido y realzar las características de interés; en una segunda etapa, se evalúan las características objetivas y subjetivas de los datos para determinar la mejor elección del método de segmentación.

A continuación, ya sea mediante abstracción manual, generación de modelos o trazado manual de las características de interés, se realiza una segmentación automatizada basada en densidad o una segmentación automatizada personalizada para extraer las características de interés. Los resultados muestran modelos segmentados tridimensionales finales de las características de interés, basados en la clasificación de las características de la imagen y en objetivos personales para elegir el enfoque de segmentación óptimo.

Una comparación entre los diferentes enfoques para cada conjunto de datos ayudará a seleccionar la estrategia de segmentación adecuada. Demostramos diferentes métodos para la extracción de características de interés. Debido a la complejidad de los volúmenes de microscopía electrónica subcelular, cada enfoque tiene sus ventajas y limitaciones.

Por lo general, las personas nuevas en la segmentación pueden tener dificultades porque no siempre es claro identificar el mejor enfoque para diferentes conjuntos de datos. Junto con la expresión de opiniones de estudiantes de posgrado. Tai demostrará el procedimiento y será BU como investigador posdoctoral.

En mi laboratorio, Amit Hassan, un asociado de investigación en mi laboratorio, y Joaquin Korea, un ingeniero de sistemas informáticos en mi laboratorio, el modelo abstracto manual se utiliza cuando el único objetivo consiste en crear un modelo geométrico con el fin de realizar mediciones geométricas. Para comenzar, importe el volumen de datos a un programa adecuado. Para la generación del modelo abstracto manual, en esta demostración se utiliza el software kymera.

Primero, seleccione el archivo y ábralo para mostrar el cuadro de diálogo de apertura de archivo; navegue hasta la ubicación del archivo del mapa deseado. A continuación, abra el visor de volúmenes y seleccione el estilo de visualización de características para mostrar los datos con diferentes estilos de representación. Ajuste el umbral de visualización arrastrando la barra vertical en el histograma de la ventana del visor de volúmenes.

Navegue por el volumen 3D para seleccionar un área de interés para la segmentación y recorte un subvolumen más pequeño si es necesario. En el cuadro de diálogo del visor de volumen, seleccione características, selección de subregión y haga clic y arrastre para crear un cuadro rectangular alrededor de la región de interés. A continuación, coloque marcadores a lo largo de la característica de interés y conéctelos con enlazadores cuando corresponda hasta que el modelo esté completo.

Para lograr esto desde la barra de menú del visor de volumen, seleccione herramientas, diálogo del rastreador de volumen. Para abrir el diálogo del rastreador de volumen allí, seleccione archivo, nuevo conjunto de marcadores. En el diálogo del rastreador de volumen, active el ratón, coloque marcadores en alta densidad, coloque marcadores en los datos, los planos se mueven y el tamaño de los marcadores enlaza el nuevo marcador al marcador seleccionado y enlaza consecutivamente los marcadores seleccionados.

Luego, en la ventana de trazado de volumen, seleccione colocar marcadores utilizando el botón derecho del ratón e inserte los radios para los marcadores y enlaces. A continuación, haga clic derecho sobre los datos de volumen para comenzar a colocar los marcadores. Los marcadores se conectarán automáticamente en el cuadro de diálogo de trazado de volumen.

Seleccione el archivo, guarde el marcador actual. Establezca y luego cierre el marcador del archivo. Abra un nuevo conjunto de marcadores para comenzar a construir un modelo en una segunda característica de interés.

Utilice colores contrastantes entre conjuntos de marcadores para resaltar las diferencias en las características. El trazado manual de características de interés es un enfoque que consume tiempo, utilizado cuando la densidad de población es relativamente baja y cuando la precisión en la extracción de características es fundamental. Para comenzar, importe los datos de volumen en un programa con opciones de trazado manual. Software.

Con esta funcionalidad, por lo general se ofrece una herramienta básica de pincel. En esta demostración, el software Amira se utiliza para tomogramas grandes. Seleccione abrir datos y haga clic derecho sobre el nombre del archivo rec.

Luego haga clic en formato, seleccione datos en bruto como datos de disco grande. Bien, y cargue. Seleccione los parámetros de datos en bruto adecuados a partir de la información del encabezado y haga clic en aceptar.

Active y guarde con un nuevo nombre de archivo. archivo am. Para una secuencia de imágenes 3D, seleccione abrir datos y elija el nombre de archivo tiff o el nombre de archivo dot mrmc.

Luego, active, haga clic derecho y seleccione guardar como nombre de archivo am. En la ventana del visor 3D, seleccione corte ortogonal para abrir el archivo de imagen. A continuación, utilice un control deslizante en la parte inferior para navegar a través de las secciones y recortar los datos más grandes abiertos como datos de disco grande.

Active el nombre del archivo en la ventana de grupo, haga clic derecho y seleccione acceso a la red. Ingrese el tamaño de cuadro deseado, mueva el cuadro al área deseada y haga clic en aplicar. Guarde el nuevo archivo.

A continuación, cree un archivo de segmentación alternando el archivo en la ventana de grupo. Luego, haga clic con el botón derecho y seleccione el campo de etiquetado. Se creará un nuevo archivo y se cargará automáticamente en la pestaña del editor de segmentación, así como en el grupo de objetos.

Utilice la herramienta de pincel para trazar el borde de la primera característica de interés. Modifique el tamaño del pincel según desee y luego use el puntero del ratón para trazar el borde de la característica de interés. Rellene el área trazada con el atajo F. Agregue la selección haciendo clic en el botón con el símbolo de suma.

Siga la característica de interés a través de todas las secciones y repita la segmentación por trazado manual. Genere una representación en superficie para la visualización y el análisis cualitativo o cuantitativo básico según las instrucciones del manual del usuario del software en la pestaña de grupo de objetos; active las etiquetas de nombres de archivo am en la ventana del grupo. A continuación, haga clic derecho y seleccione generación de superficie.

Seleccione las propiedades de superficie deseadas y haga clic en aplicar. Se creará un nuevo archivo con el nombre surf en el grupo. Para visualizar el volumen segmentado, active o desactive el archivo con el nombre surf en la ventana del grupo.

Luego, haga clic con el botón derecho y seleccione vista de superficie. Genere una superficie para la visualización y el análisis cualitativo según se describe en el protocolo escrito. Se utiliza una segmentación automatizada basada en densidad en conjuntos de datos con cualquier variedad de contraste, nitidez o grado de congestión para extraer las densidades de interés y comenzar a importar los datos de volumen a un programa equipado con una varita mágica de umbral u otras herramientas basadas en densidad para la segmentación automática.

Como se hace en la técnica de trazado manual de características de interés, en esta demostración se utiliza el software Amira para características sin márgenes claramente distinguibles. Utilice la herramienta de umbral seleccionando el icono de umbral. Ajuste un control deslizante para modificar la densidad dentro del rango deseado, de modo que solo las características de interés queden enmascaradas.

Haga clic en el botón seleccionar y luego agregue una selección haciendo clic en el botón con el símbolo de suma o mediante el atajo. Genere una superficie para la visualización y el análisis cualitativo según se describe en el protocolo del texto. Todos un cuarto enfoque.

La segmentación automatizada personalizada puede utilizarse para segmentar eficientemente grandes conjuntos de datos, pero requiere conocimientos en programas como matlab. Consulte el video complementario sobre segmentación personalizada para obtener instrucciones paso a paso sobre este método. Seis conjuntos de datos de ejemplo fueron segmentados mediante cuatro enfoques: generación manual de modelos abstractos, trazado manual de características de interés, segmentación automatizada basada en densidad y segmentación automatizada personalizada. La generación manual de modelos abstractos fue eficaz para la resina.

La tomografía teñida incluida con un propósito tenía como objetivo crear un modelo con fines cuantitativos, en lugar de extraer densidades exactas para la tomografía teñida incluida en resina de una pared celular vegetal. La segmentación automatizada basada en densidad fue la más eficaz para extraer rápidamente la celulosa a través de muchas secciones. Los métodos manuales requirieron más esfuerzo en solo unas pocas secciones de datos.

La generación manual de modelos abstractos produjo el triplete de microtúbulos en la tomografía de etapa del cinocilio, mientras que los dos enfoques automatizados extrajeron las densidades más rápidamente y por ello fueron preferidos debido a la forma de las mitocondrias a partir de haces iónicos enfocados, y microscopía electrónica de barrido de células epiteliales mamarias. El trazado manual proporcionó el resultado más limpio y la baja densidad poblacional permitió una segmentación rápida. Dado el gran volumen que necesitaba ser segmentado, la segmentación automatizada personalizada resultó ser la más eficiente para segmentar los datos bacterianos de microscopía electrónica de barrido de superficie de bloque en serie.

Aunque lleva mucho tiempo, el único método para extraer la microscopía electrónica de barrido por haz de iones enfocado de la membrana de células epiteliales mamarias fue el trazado manual. El desarrollo de los enfoques de segmentación allana el camino para que los investigadores en este campo emergente de la biología celular estructural exploren y determinen la arquitectura tridimensional celular a nivel de complejos macromoleculares, orgánulos y células en una gran variedad de cultivos celulares, cultivos de organoides o organismos modelo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elegir y aplicar el enfoque de segmentación óptimo para su conjunto de datos.