Name: Vortex asistida Microscale Electroporador para entrega secuencial Molecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprende a usar un electroporador microfluídico asistido por vórtices para la entrega secuencial de múltiples biomoléculas en poblaciones celulares idénticas. Este método mejora la eficiencia de entrega manteniendo alta viabilidad celular.

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Este trabajo es apoyado por el programa Rowland junior becario. Los autores desean expresar su agradecimiento a los científicos y el personal del Instituto Rowland en Harvard: Chris Stokes por su ayuda en el desarrollo de la, la configuración de control de presión asistida por computadora hecha a la medida, Diane Schaak, Ph.D. por su aportación para la manipulación de la muestra biológica, Winfield Hill por el desarrollo de la instalación eléctrica, Alavaro Sánchez, Ph.D. para conceder el acceso a la citómetro de flujo, Scott Bevis, Kenny Spencer y Don Rogers para el mecanizado de componentes de plomería mecánicos necesarios para la configuración de presión. Maestros de microfluidos fueron fabricados en el Centro de Sistemas de nanoescala (CNS) de la Universidad de Harvard.

1. Preparación de la célula <ol><li> Placa 1 × 10 5 células / ml de metastásico línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 en un volumen de 10 ml por matraz de cultivo tisular T75 en de Leibovitz L-15 suplementado con 10% (v / v) de suero fetal bovino y 1 % de penicilina-estreptomicina. </li><li> Incubar MDA-MB-231 células en un incubador humidificado a 37 ° C con 0% de CO 2 medio ambiente. </li><li> Cosecha células para los experimentos de 2 días después de la siembra por tratamiento de las células con 0,25% de tripsina-EDTA durante 2 min e inactivar la actividad enzimática de tripsina mediante la adición de 8 ml de medio de crecimiento. </li><li> Precipitar las células por centrifugación durante 5 min a 200 x g y resuspender en tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS, 1x, sin Ca2 + y Mg2 +) a una concentración final de 5 × 10 5 células / ml. </li></ol> 2. Diseño y fabricación de dispositivos NOTA: La máscara, las fabricaciones de molde maestro y elproceso que la contiene microcanal se lleven a cabo dentro de una habitación limpia mientras que el proceso de fundición microcanal polidimetilsiloxano (PDMS) se puede realizar en una mesa de trabajo de laboratorio habitual. <ol><li> Diseñar un dispositivo de microfluidos como se ilustra en la Figura 1 con AutoCAD. El dispositivo debe consistir en una entrada con múltiples puertos de inyección, filtros gruesos y dos canales rectangulares rectas paralelas inerciales de enfoque (L = 7 mm, W = 40 m, y H = 70 m). Canal recto individual consta de 5 cámaras de electroporación, que se colocan 800 micras de separación (W C = 400 m) con dos agujeros a través de los electrodos de aluminio. Dos cámaras de electroporación transversalmente adyacentes comparten el agujero para el electrodo negativo. Dos canales rectos se funden en una salida en la región aguas abajo de la electroporación. </li><li> Convertir el archivo CAD con micro-patrones en un archivo GDSII usando LinkCAD. Escriba los micro-patrones en un 5 &quot;x 5&quot; fotomáscara en blancousando un escritor máscara de láser. Desarrollar la máscara siguiendo el protocolo del fabricante. NOTA: El proceso de desarrollo de máscara incluye desarrollo fotoprotector, grabado cromo y resistir la retirada. Alternativamente, micro-patrones impresos en una transparencia alta resolución (&gt; 20.000 dpi) se pueden comprar a partir de un fabricante de terceros y se utiliza como una fotomáscara. Características a microescala finales sobre una fotomáscara deben ser transparentes para que coincida con la polaridad de un fotoprotector negativo. </li><li> Fabricar el molde de colada del diseño del dispositivo utilizando técnicas de litografía suave estándar 23 con una capa fotorresistente negativo giró sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas a 2.000 rpm para tener el espesor final de 70 micras. </li><li> Precocción la oblea con fotorresistencia negativa durante 20 min a 95 ° C. </li><li> Póngase en contacto con la máscara con la oblea y exponer a una fuente de UV (17,4 mJ / cm 2) durante 80 segundos utilizando un alineador de máscara. </li><li> Desarrollar la oblea expuesta durante 4 minutos en un desarrollador de SU-8. </li><li> Mida laespesor fotoprotector desarrollada usando un perfilómetro de superficie. </li><li> Mezclar con rigor una proporción de 10: 1 de elastómero de agente (kit de elastómero de silicona) curar y verter la mezcla en el molde de fundición para generar réplicas de PDMS. Desgasificar el elastómero de colada durante 30 min y curar el molde de fundición con elastómero desgasificada en un horno a 70 ° C durante 2 horas. </li><li> Delaminarse curado réplica de PDMS con patrones de microcanales de los orificios del molde y punzón para las entradas, salida y electrodos inserciones utilizando una prensa de tornillo pasador. NOTA: El diámetro normal borde de corte de la prensa de tornillo pasador debe ser 0,76 mm, adecuada para la fuerza que sostiene tubo de PEEK (OD de 1/32 &quot;) y electrodos de aluminio (OD de 0,029&quot;) en su lugar. </li><li> Crear canales de microfluidos encerrada por unión PDMS réplicas a un portaobjetos de vidrio tratado en un limpiador de oxígeno-plasma durante 7 s a una potencia y presión parcial de oxígeno de radiofrecuencia de 75 W y 500 mTorr, respectivamente. </li></ol> 3. experimentos de flujo <ol><li> Insertarelectrodos de aluminio (0,029 &quot;OD) y un tubo de PEEK de salida (1/32&quot; OD) en los lugares designados a través de agujeros en las microcanal (véase la Figura 3B). </li><li> Conectar el equipo eléctrico 18 responsable de la generación de alta tensión impulsos cortos de onda cuadrada a los electrodos de aluminio (véase la Figura 3C) que están en contacto con soluciones que fluye en el molde de PDMS. NOTA: El equipo debe constar de un generador de impulsos y un amplificador de alto voltaje construido en la casa 18. </li><li> Preparar cuatro tubos de centrífuga de 50 ml que contienen individualmente DPBS, soluciones con células y biomoléculas, y adjuntar cada tubo a su respectivo soporte del vial conectado al sistema de control de flujo neumático (véase la Figura 3A). 18 </li><li> Conectar tubo de PEEK de entrada de los titulares de los viales en los respectivos orificios de entrada en el dispositivo de microfluidos. </li><li> Establecer la magnitud de pulsos de onda cuadrada, V, 100 V, a fin de tener la fie eléctricafuerza ld, E = V / L e, a través de la cámara de electroporación ser equivalente a 0,7 kV / cm. NOTA: Aquí, L e es la distancia entre dos puntos en los que los electrodos positivos y negativos están en contacto con la solución que fluye (véase la Figura 1). </li><li> Ajuste el regulador de presión de 40 psi. NOTA:. Una fuente de nitrógeno ajustable manualmente solo se utiliza para presurizar uniformemente todos los viales de muestra y un colector de alta velocidad se utiliza para activar oportuna puertos de soluciones individuales utilizando el software LabVIEW hecha a la medida 18 </li><li> Para el control de la válvula, abra el software LabVIEW hecha a la medida marcada Válvula Runner, y haga clic en Ejecutar en el menú desplegable titulado operar. </li><li> Abra las válvulas haciendo clic en cada icono de la válvula correspondiente. NOTA: El icono de la válvula cambiará a verde cuando se activa. Al hacer clic en el icono de activo se desactivará y cerrar la válvula. El icono de la válvula cerrada debe volverse gris. </li><li> Abra la válvula del depósito DPBS (es decir., solución de lavado) para cebar la velocidad de flujo requerida para estable generación de vórtice celular-trampeo durante 1,5 min. </li><li> Cambiar el puerto solución activa de la solución de lavado a la solución de células a las células en la cámara de trampa de electroporación durante 30 segundos (es decir, el paso de células que atrapan). </li><li> Flujo ambas soluciones de lavado y de células a través del dispositivo de manera simultánea durante 10 s antes de la etapa de células que atrapan para asegurar el flujo ininterrumpido durante el paso de la solución de conmutación. NOTA: Esta breve etapa de co-flujo se debe repetir en cada paso de la solución de conmutación. </li><li> Girar en el puerto de lavado y enjuague el dispositivo durante 20 segundos con el fin de eliminar las células contaminantes no atrapados. </li><li> Se inyecta la solución que contiene la primera molécula de interés (0,2 mg / ml de 3000 Da moléculas de dextrano neutro o aniónico y 1,5 mg / ml de 70000 Da molécula de dextrano neutro) en el dispositivo. </li><li> Aplicar cinco pulsos cortos (T = 30 mseg con intervalos de 2 seg) inmediatamente después de la inyección de lasolución molecular y monitorear la magnitud y duración de los pulsos eléctricos aplicados en tiempo real, utilizando un osciloscopio. </li><li> Repita el paso 3,10 tantas veces como el número de moléculas adicionales para ser entregado. Para cada entrega molecular, incubar las células para 100 s en la solución molecular y luego enjuagar el dispositivo con la solución de lavado de 100 s para eliminar el exceso de moléculas. </li><li> Liberar las células en una placa de 96 pocillos para el análisis de aguas abajo mediante la reducción de la presión de operación por debajo de 5 psi. NOTA: Aproximadamente 100 l de solución con 100 células se obtuvieron de cada versión. </li><li> Ejecute el experimental los pasos 3.9 a través de 3.16 tres veces para recolectar suficientes células para citometría de flujo. </li><li> Centrifugar la placa de 96 pocillos que contenía células procesadas durante 5 min a 228 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante que contiene moléculas fluorescentes exceso. </li><li> Resuspender las células en DPBS para análisis de citometría de flujo. </li><li> Células de carga en el citómetro de flujo para u molecularptake análisis de eficiencia. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con la nueva plataforma de electroporación paralelizado, mejora de 10 veces en el rendimiento y la eficiencia de la prestación de múltiples molécula se logró, además de todas las ventajas que el sistema de una sola cámara previamente desarrollado proporciona. 18 méritos Anteriormente disponibles incluyen (i) antes de la purificación de dirigirse a las células con una distribución uniforme del tamaño para la mejora de la viabilidad, (ii) control de la dosificación precisa y molecular individual, y (iii) la cor...

En los últimos años, el uso de pulsos eléctricos para facilitar la entrega citosólica de moléculas extracelulares se ha convertido en un medio atractivo para la manipulación de células de mamífero. 1 Este proceso, también conocido como electroporación, permeabiliza reversiblemente la membrana celular, lo que permite la membrana inherentemente moléculas impermeables para acceder al medio intracelular de las células. Debido a que prácticamente cualquier molécula se puede introducir en el citosol a través de poros creados temporales en la membrana de cualquier tipo de células por medio de electroporación, la técnica ha sido reportado como siendo más reproducible, de aplicación universal, y más eficiente que otros métodos, incluyendo mediada por virus, química y los enfoques ópticos. 2-3 Esta técnica se ha utilizado para introducir moléculas fluorescentes, 4 drogas 5 y ácidos nucleicos 6-7 manteniendo células viables e intacto. Teniendo en cuenta estos beneficios, electroporación ha sido adoptado como un trabajo comúnAtory técnica de ADN para la transfección, in vivo la terapia génica 8 y estudios de vacunación celular. Es, sin embargo, sigue siendo difícil para los sistemas convencionales de electroporación para lograr simultáneamente eficiencia práctica y la viabilidad para las muestras con gran heterogeneidad en el tamaño debido a que la intensidad de campo eléctrico requerida para la electroporación éxito se correlaciona estrechamente con el diámetro de la célula. Por otra parte, esos sistemas no permiten un control preciso de los múltiples cantidades moleculares entregado debido a la confianza en el proceso de entrega molecular estocástico mayor. 9 A fin de abordar estas cuestiones, muchos grupos han desarrollado plataformas de electroporación de microfluidos, que ofrece la ventaja de voltajes inferiores poración, mejor eficiencia de transfección, una gran reducción de la mortalidad celular, y la capacidad de ofrecer múltiples moléculas. fueron posibles 10-13 Estas ventajas debido a las pequeñas dimensiones de los sistemas de electroporación microescala cuyo electrodo de tonolongitudes son sub-milímetros, disminuyendo drásticamente tensiones requeridas para la entrega exitosa. Además, estos sistemas de electroporación microescala pueden lograr una distribución de campo eléctrico uniforme y rápidamente disipar el calor generado, produciendo mortalidad celular reducida al tiempo que mejora la eficiencia de la entrega. La utilización de materiales transparentes para estos microchips adicionales permite la observación in situ del proceso de electroporación para las modificaciones de parámetros rápidas. 2,12 Sin embargo, el control de la dosificación precisa y el control de parámetros-molecular y celular dependiente, requerido para la investigación y aplicaciones terapéuticas, 6 emergente, 14-16 todavía siguen sin resolverse. Este trabajo presenta un sistema de electroporación de microfluidos vórtice asistida, capaz de entregar múltiples moléculas secuencialmente en una población idéntica pre-seleccionado de las células diana. Las células con distribución de tamaño uniforme son aislados antes de la electroporación utilizando si se informó anteriormentemecanismo-ze selectiva de captura. 17-18 Al tener una distribución uniforme del tamaño, menor variación en la eficiencia de la electroporación y la mayor viabilidad por determinada intensidad de campo eléctrico se lograron. 19 Por otra parte, se agitaba continuamente células atrapadas utilizando vórtices microescala permitido para la entrega uniforme de moléculas a través de la citosol entero, de acuerdo con los resultados previamente reportados usando otra plataforma electroporación vórtice asistida. 20 Para demostrar que este sistema sería aplicable a una amplia gama de moléculas comúnmente utilizados en aplicaciones biológicas, macromoléculas con una amplia gama de pesos moleculares fueron entregados a metastásico de células de cáncer de mama. Además, con la ayuda de la monitorización de procesos en tiempo real, este trabajo proporciona más evidencias de poner fin al largo debate permanente sobre el mecanismo de entrega molecular durante electrporation, siendo predominantemente mediada por electroforesis versus difusión mediada. 14 </sup&gt; A diferencia de otros sistemas de electroporación, esta plataforma proporciona de forma única las ventajas combinadas de entrega precisa multi-molécula, de alta eficiencia en la entrega molecular, la mortalidad celular mínima, un amplio abanico de tamaño y cargos de moléculas entregados, así como la visualización en tiempo real de la electroporación proceso. Dadas estas capacidades, el sistema de electroporación desarrollado tiene potencial práctico como una herramienta versátil para los estudios de reprogramación celular, aplicaciones de suministro de drogas 6,14,21-22 10,19 y aplicaciones que requieren de la comprensión en profundidad de los mecanismos de entrega de electroporación moleculares.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 línea celular cancerosa</td><td>Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15</td><td>Cell Mediano, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma de oxígeno</td><td>Technics Perfilador de superficies Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 ELASTÓMERO DE SILICONA KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gas nitrógeno comprimido</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de alta presión</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Regulador aguas abajo</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>Colector de válvulas de alta velocidad de 3/2 vías 8 Válvula de retención en</td> línea <td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idex</td><td>Salud y Ciencia</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32" de diámetro exterior x 3/32" de diámetro interno Tubos de poliuretano</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4" de diámetro exterior x 0,17" de diámetro interno Tubos de poliuretano</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PEEK de 1/16"</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PEEK de 1/32"</td><td>Idex Salud y Ciencia</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>Uniones de tubos de PEEK</td><td>Salud y Ciencia</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>Generador de impulsos</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de aluminio</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Agilent DSO3062A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos de centrífuga VWR</td><td></td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 Matraz de cultivo VWR</td><td></td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano, Tetrametilrodamina, 3.000 MW, Gibco aniónico</td><td>, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano, Tetrametilrodamina, 70.000 MW, Neutro&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3.000 MW, Neutral</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

vortex asistida microscale electroporador para entrega secuencial molecular

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

La electroporación ha recibido una creciente atención en los últimos años, debido a que es una técnica muy poderosa para la introducción de sondas moleculares físicamente exógenos no permeantes en las células. Este trabajo presenta una plataforma de electroporación de microfluidos capaz de realizar la entrega molécula múltiple para células de mamífero con control de parámetros precisos y molecular-dependiente. La capacidad del sistema para aislar células con una distribución de tamaño uniforme permite una menor variación en la eficiencia de la electroporación por intensidad de campo eléctrico dado; por lo tanto, una mayor viabilidad de la muestra. Además, su función de visualización de procesos permite la observación del proceso de absorción molecular fluorescente en tiempo real, lo que permite ajustes de parámetros de entrega moleculares rápidas in situ para la mejora de la eficiencia. Para mostrar las enormes capacidades de la plataforma informado, macromoléculas con diferentes tamaños y cargas eléctricas (por ejemplo, dextrano con un PM de 3.000 y 70.000 Da) fueronentregado a las células de cáncer de mama metastásico con altas eficiencias de entrega (&gt; 70%) para todas las moléculas ensayadas. La plataforma desarrollada ha demostrado su potencial de uso en la expansión de los campos de estudio en el chip técnicas de electroporación pueden ser beneficiosos.

El electroporador microfluidos paralelo desarrollado entregado macromoléculas con varios tamaños y cargas eléctricas en las células de cáncer de mama metastásico que viven. El éxito de la entrega molecular se determinó cualitativamente mediante la supervisión de los cambios en la intensidad de fluorescencia de las células que orbitan alrededor de electroporación in situ y confirmado por mediciones cuantitativas mediante análisis de citometría de flujo. Figura 4A muestra que el 90% de las célula...

Una plataforma de electroporación asistida vórtice de microfluidos fue desarrollado para la entrega secuencial de múltiples moléculas en poblaciones de células idénticas con control de la dosificación precisa e independiente. Tamaño basado electroporación anterior etapa de purificación de células diana del sistema ayudado a mejorar la eficiencia de la entrega molecular y la viabilidad celular procesada.

Vortex asistida Microscale Electroporador para entrega secuencial Molecular

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

El objetivo general de este procedimiento es entregar diversos tipos de moléculas biológicamente significativas de manera secuencial y con dosis controlable, con alta eficiencia, utilizando el porador microfluídico asistido por vórtice. Esto se logra primero preparando cuatro tubos centrífugos de 50 mililitros que contienen individualmente soluciones de DPBS con células y biomoléculas, y conectando cada tubo a su respectivo soporte de vial unido al sistema neumático de control de flujo. El segundo paso consiste en insertar los tubos de entrada de cada vial en el dispositivo microfluídico con los 15 electrodos integrados. A continuación, las células se hacen fluir hacia el dispositivo, donde quedan atrapadas en vórtices a escala microscópica formados en las cámaras de electro poración.El paso final consiste en aplicar pulsos eléctricos breves a las células atrapadas, seguido inmediatamente por la inyección de las soluciones que contienen las biomoléculas que se deben entregar al citosol. En última instancia, las células obtenidas mediante este proceso pueden liberarse y recolectarse para su análisis posterior. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que es capaz de entregar secuencialmente cantidades controladas de múltiples moléculas en una población celular idéntica previamente seleccionada, con alta eficiencia y viabilidad.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de intercambio de fluidos son difíciles de aprender debido al momento adecuado del flujo frío en cada solución. El paso de conmutación determina la estabilidad del atrapamiento celular. Se utilizará una línea celular de cáncer de mama metastásico M-D-A-M-B 2 31 en este experimento, sembrando una vez 10 a la quinta células por mililitro en un volumen de 10 mililitros por matraz de cultivo tisular T 75 en medio Leibovitz L 15 suplementado con 10% volumen por volumen de suero bovino fetal y 1% penicilina.Incubar las células con estreptomicina en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con un ambiente de 0 % de dióxido de carbono. Dos días después de la siembra, recolectar las células para experimentos. Después de lavar las células con solución salina tamponada con fosfato bukos o DPBS, tratar las células con tripsina-EDTA al 0,25 % durante dos minutos.Añada ocho mililitros de medio de crecimiento para inactivar la actividad enzimática, peletee las células por centrifugación durante cinco minutos a 200 veces G y re suspenda en medio hasta una concentración final de cinco por 10 a la quinta células por mililitro. El diseño y la fabricación del dispositivo microfluídico de electro poración no se mostrarán en este video, pero se describen en el manuscrito adjunto. El sistema consta de entradas para células, moléculas y una solución de lavado.Dos canales rectos donde ocurre el enfoque inercial. Diez cámaras de electropermeabilización con electrodos y una salida para configurar los experimentos de flujo. Inserte una salida, tubo de poliéter, éter cetona, o tubo peak, y el electrodo de aluminio de 15 pines para la aplicación de pulsos cortos de alto voltaje en los lugares designados mediante los orificios en el microcanal.El electrodo de 15 pines consta de 10 electrodos positivos y cinco electrodos negativos. Cada electrodo positivo está separado 1,5 milímetros de un electrodo negativo, y cada electrodo de la misma polaridad está separado 1,35 milímetros entre sí. Conecte el equipo eléctrico para generar pulsos cuadrados cortos de alto voltaje a los electrodos de aluminio que están en contacto con las soluciones en flujo.En el molde de PDMS, el equipo debe constar de un generador de pulsos y un amplificador de alto voltaje construido in situ. Prepare cuatro tubos cónicos de 50 mililitros que contengan individualmente DPBS y soluciones con células y moléculas. Conecte cada tubo a su respectivo portaviales conectado al sistema de control de flujo neumático.Conecte el tubo del pico de entrada de los portaviales a los orificios de entrada correspondientes en el dispositivo microfluídico. A continuación, ajuste. La magnitud de los pulsos de onda cuadrada en voltios a 100 voltios.Para que la intensidad del campo eléctrico en la cámara de electroforesis sea equivalente a 0,7 kilovoltios por centímetro, ajuste el regulador de presión a 40 PSIA. Se utiliza una fuente única de nitrógeno ajustable manualmente para presurizar uniformemente todos los viales de muestra y emplea un colector de alta velocidad para activar oportunamente los puertos individuales de la solución. Utilice el software personalizado LabView para el control de las válvulas.Abra el software de vista de laboratorio denominado valve runner y haga clic en ejecutar en el menú desplegable titulado Operate. Haga clic en el icono de válvula correspondiente, válvula uno, para abrir la válvula del depósito de DPBS y cebado del flujo a la velocidad necesaria para la generación estable del vórtice de captura celular durante 1,5 minutos. El icono de la válvula debe cambiar de color gris a verde cuando se active el flujo, pasando simultáneamente soluciones de lavado y celulares a través del dispositivo durante 10 segundos antes del paso de captura celular.Para garantizar un flujo ininterrumpido durante el paso de cambio de solución, este breve paso de flujo conjunto debe repetirse en cada paso de cambio de solución. Cambie el puerto de solución activo desde la solución de lavado hasta la solución celular para atrapar las células en la cámara de electroforesis durante 30 segundos. En esta película, las señales fluorescentes azules representan ganchos viables.Células en estadio 3, 3, 3, 4, 5. Encienda el puerto de lavado y enjuague el dispositivo durante 20 segundos. Con el fin de eliminar las células contaminantes no atrapadas, haga fluir la solución que contiene la primera molécula de interés.Propidio yoduro en el dispositivo con fines de visualización. En esta demostración, se utilizan colorantes de ácidos nucleicos en lugar de hebras DExT marcadas con fluorescencia debido a la relación señal-ruido superior de los colorantes; aplique cinco pulsos cortos inmediatamente después de la inyección de la solución molecular, supervise en tiempo real la magnitud y el número de los pulsos eléctricos aplicados mediante un osciloscopio, las señales fluorescentes de las moléculas pueden visualizarse bajo el microscopio, incube las células durante 100 segundos en la solución molecular. A continuación, haga fluir la solución que contiene la segunda molécula, el colorante de ácidos nucleicos yo-yo uno, hacia el dispositivo.En esta demostración, la segunda molécula se administra sin aplicaciones adicionales de pulsos eléctricos. Esta película confirma que las células ahora expresan las tres señales fluorescentes. Verde para yo-yo, uno, rojo para yoduro de propidio y azul para hooks.3, 3, 3, 4, 5. Libere las células en una placa de 96 pocillos para su análisis posterior reduciendo la presión de operación por debajo de cinco PSI. Se recoge aproximadamente 100 microlitros de solución con 100 células de cada liberación.El procedimiento de electrotransferencia debe repetirse al menos tres veces para recolectar suficientes células para la centrifugación en citometría de flujo. La placa de 96 pocillos que contiene las células procesadas a 228 veces G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante que contiene moléculas fluorescentes en exceso y resuspenda las células en DPBS.Si se entregaron hebras DExT marcadas con fluorescencia, las células se analizan posteriormente para evaluar la absorción molecular mediante citometría de flujo. La entrega molecular exitosa se determinó cualitativamente mediante el monitoreo de los cambios en la intensidad de fluorescencia de las células orbitantes electroporadas en C dos, lo que confirmó que el 90 % de las células tratadas absorbieron la molécula de hebra DExT aniónica de 70.000 Dalton.La eficiencia para cada molécula de dextrano transferida, definida como la relación entre el número de células que incorporaron con éxito la molécula de interés y el número total de células procesadas, no varió sustancialmente según el peso molecular o las cargas eléctricas. Todas las moléculas de dextrano ensayadas se entregaron al citosol con una eficiencia superior al 70 %. Se muestran aquí nuestros perfiles representativos de citometría de flujo para células que no fueron tratadas con electrotransferencia. El umbral de fluorescencia que indica una entrega molecular exitosa se establece a partir de los datos de manera que las señales de las muestras control se encuentren por debajo del umbral.Estos datos representativos de citometría de flujo para células electro poradas secuencialmente muestran el gráfico de citometría de flujo junto a las imágenes de manchas fluorescentes; los cuadros verdes representan señales de células que incorporaron solo dextrano neutro de 3000 Daltons, y los cuadros rojos representan señales de células. Las señales fluorescentes de células que incorporaron solo la hebra de DExT iónica de 3000 Daltons, ambas moléculas de hebra de DExT mostradas en amarillo indican una eficiencia de entrega de moléculas duales del 56 % tras su desarrollo. Esta técnica será útil para investigadores en el campo de la medicina, la biotecnología y la farmacología para explorar combinaciones de reactivos terapéuticos y lograr efectos sinérgicos en el tratamiento de enfermedades complejas.No olvide que trabajar con pulsos eléctricos de alto voltaje puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como asegurarse de estar conectado a tierra, al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

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