Vortex asistida Microscale Electroporador para entrega secuencial Molecular
7 de agosto de 2014
Una plataforma de electroporación asistida vórtice de microfluidos fue desarrollado para la entrega secuencial de múltiples moléculas en poblaciones de células idénticas con control de la dosificación precisa e independiente. Tamaño basado electroporación anterior etapa de purificación de células diana del sistema ayudado a mejorar la eficiencia de la entrega molecular y la viabilidad celular procesada.
El objetivo general de este procedimiento es entregar diversos tipos de moléculas biológicamente significativas de manera secuencial y con dosis controlable, con alta eficiencia, utilizando el porador microfluídico asistido por vórtice. Esto se logra primero preparando cuatro tubos centrífugos de 50 mililitros que contienen individualmente soluciones de DPBS con células y biomoléculas, y conectando cada tubo a su respectivo soporte de vial unido al sistema neumático de control de flujo. El segundo paso consiste en insertar los tubos de entrada de cada vial en el dispositivo microfluídico con los 15 electrodos integrados. A continuación, las células se hacen fluir hacia el dispositivo, donde quedan atrapadas en vórtices a escala microscópica formados en las cámaras de electro poración.
El paso final consiste en aplicar pulsos eléctricos breves a las células atrapadas, seguido inmediatamente por la inyección de las soluciones que contienen las biomoléculas que se deben entregar al citosol. En última instancia, las células obtenidas mediante este proceso pueden liberarse y recolectarse para su análisis posterior. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que es capaz de entregar secuencialmente cantidades controladas de múltiples moléculas en una población celular idéntica previamente seleccionada, con alta eficiencia y viabilidad.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de intercambio de fluidos son difíciles de aprender debido al momento adecuado del flujo frío en cada solución. El paso de conmutación determina la estabilidad del atrapamiento celular. Se utilizará una línea celular de cáncer de mama metastásico M-D-A-M-B 2 31 en este experimento, sembrando una vez 10 a la quinta células por mililitro en un volumen de 10 mililitros por matraz de cultivo tisular T 75 en medio Leibovitz L 15 suplementado con 10% volumen por volumen de suero bovino fetal y 1% penicilina.
Incubar las células con estreptomicina en un incubador humedecido a 37 grados Celsius con un ambiente de 0 % de dióxido de carbono. Dos días después de la siembra, recolectar las células para experimentos. Después de lavar las células con solución salina tamponada con fosfato bukos o DPBS, tratar las células con tripsina-EDTA al 0,25 % durante dos minutos.
Añada ocho mililitros de medio de crecimiento para inactivar la actividad enzimática, peletee las células por centrifugación durante cinco minutos a 200 veces G y re suspenda en medio hasta una concentración final de cinco por 10 a la quinta células por mililitro. El diseño y la fabricación del dispositivo microfluídico de electro poración no se mostrarán en este video, pero se describen en el manuscrito adjunto. El sistema consta de entradas para células, moléculas y una solución de lavado.
Dos canales rectos donde ocurre el enfoque inercial. Diez cámaras de electropermeabilización con electrodos y una salida para configurar los experimentos de flujo. Inserte una salida, tubo de poliéter, éter cetona, o tubo peak, y el electrodo de aluminio de 15 pines para la aplicación de pulsos cortos de alto voltaje en los lugares designados mediante los orificios en el microcanal.
El electrodo de 15 pines consta de 10 electrodos positivos y cinco electrodos negativos. Cada electrodo positivo está separado 1,5 milímetros de un electrodo negativo, y cada electrodo de la misma polaridad está separado 1,35 milímetros entre sí. Conecte el equipo eléctrico para generar pulsos cuadrados cortos de alto voltaje a los electrodos de aluminio que están en contacto con las soluciones en flujo.
En el molde de PDMS, el equipo debe constar de un generador de pulsos y un amplificador de alto voltaje construido in situ. Prepare cuatro tubos cónicos de 50 mililitros que contengan individualmente DPBS y soluciones con células y moléculas. Conecte cada tubo a su respectivo portaviales conectado al sistema de control de flujo neumático.
Conecte el tubo del pico de entrada de los portaviales a los orificios de entrada correspondientes en el dispositivo microfluídico. A continuación, ajuste. La magnitud de los pulsos de onda cuadrada en voltios a 100 voltios.
Para que la intensidad del campo eléctrico en la cámara de electroforesis sea equivalente a 0,7 kilovoltios por centímetro, ajuste el regulador de presión a 40 PSIA. Se utiliza una fuente única de nitrógeno ajustable manualmente para presurizar uniformemente todos los viales de muestra y emplea un colector de alta velocidad para activar oportunamente los puertos individuales de la solución. Utilice el software personalizado LabView para el control de las válvulas.
Abra el software de vista de laboratorio denominado valve runner y haga clic en ejecutar en el menú desplegable titulado Operate. Haga clic en el icono de válvula correspondiente, válvula uno, para abrir la válvula del depósito de DPBS y cebado del flujo a la velocidad necesaria para la generación estable del vórtice de captura celular durante 1,5 minutos. El icono de la válvula debe cambiar de color gris a verde cuando se active el flujo, pasando simultáneamente soluciones de lavado y celulares a través del dispositivo durante 10 segundos antes del paso de captura celular.
Para garantizar un flujo ininterrumpido durante el paso de cambio de solución, este breve paso de flujo conjunto debe repetirse en cada paso de cambio de solución. Cambie el puerto de solución activo desde la solución de lavado hasta la solución celular para atrapar las células en la cámara de electroforesis durante 30 segundos. En esta película, las señales fluorescentes azules representan ganchos viables.
Células en estadio 3, 3, 3, 4, 5. Encienda el puerto de lavado y enjuague el dispositivo durante 20 segundos. Con el fin de eliminar las células contaminantes no atrapadas, haga fluir la solución que contiene la primera molécula de interés.
Propidio yoduro en el dispositivo con fines de visualización. En esta demostración, se utilizan colorantes de ácidos nucleicos en lugar de hebras DExT marcadas con fluorescencia debido a la relación señal-ruido superior de los colorantes; aplique cinco pulsos cortos inmediatamente después de la inyección de la solución molecular, supervise en tiempo real la magnitud y el número de los pulsos eléctricos aplicados mediante un osciloscopio, las señales fluorescentes de las moléculas pueden visualizarse bajo el microscopio, incube las células durante 100 segundos en la solución molecular. A continuación, haga fluir la solución que contiene la segunda molécula, el colorante de ácidos nucleicos yo-yo uno, hacia el dispositivo.
En esta demostración, la segunda molécula se administra sin aplicaciones adicionales de pulsos eléctricos. Esta película confirma que las células ahora expresan las tres señales fluorescentes. Verde para yo-yo, uno, rojo para yoduro de propidio y azul para hooks.
3, 3, 3, 4, 5. Libere las células en una placa de 96 pocillos para su análisis posterior reduciendo la presión de operación por debajo de cinco PSI. Se recoge aproximadamente 100 microlitros de solución con 100 células de cada liberación.
El procedimiento de electrotransferencia debe repetirse al menos tres veces para recolectar suficientes células para la centrifugación en citometría de flujo. La placa de 96 pocillos que contiene las células procesadas a 228 veces G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante que contiene moléculas fluorescentes en exceso y resuspenda las células en DPBS.
Si se entregaron hebras DExT marcadas con fluorescencia, las células se analizan posteriormente para evaluar la absorción molecular mediante citometría de flujo. La entrega molecular exitosa se determinó cualitativamente mediante el monitoreo de los cambios en la intensidad de fluorescencia de las células orbitantes electroporadas en C dos, lo que confirmó que el 90 % de las células tratadas absorbieron la molécula de hebra DExT aniónica de 70.000 Dalton.
La eficiencia para cada molécula de dextrano transferida, definida como la relación entre el número de células que incorporaron con éxito la molécula de interés y el número total de células procesadas, no varió sustancialmente según el peso molecular o las cargas eléctricas. Todas las moléculas de dextrano ensayadas se entregaron al citosol con una eficiencia superior al 70 %. Se muestran aquí nuestros perfiles representativos de citometría de flujo para células que no fueron tratadas con electrotransferencia. El umbral de fluorescencia que indica una entrega molecular exitosa se establece a partir de los datos de manera que las señales de las muestras control se encuentren por debajo del umbral.
Estos datos representativos de citometría de flujo para células electro poradas secuencialmente muestran el gráfico de citometría de flujo junto a las imágenes de manchas fluorescentes; los cuadros verdes representan señales de células que incorporaron solo dextrano neutro de 3000 Daltons, y los cuadros rojos representan señales de células. Las señales fluorescentes de células que incorporaron solo la hebra de DExT iónica de 3000 Daltons, ambas moléculas de hebra de DExT mostradas en amarillo indican una eficiencia de entrega de moléculas duales del 56 % tras su desarrollo. Esta técnica será útil para investigadores en el campo de la medicina, la biotecnología y la farmacología para explorar combinaciones de reactivos terapéuticos y lograr efectos sinérgicos en el tratamiento de enfermedades complejas.
No olvide que trabajar con pulsos eléctricos de alto voltaje puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como asegurarse de estar conectado a tierra, al realizar este procedimiento.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Una plataforma microfluídica de electro poración asistida por vórtice permite la entrega secuencial de múltiples moléculas en poblaciones celulares idénticas con control preciso de la dosis. Este método mejora la eficiencia de entrega molecular mientras mantiene la viabilidad celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microfluídica
- Electroporación
- Biología celular
Antecedentes
- La electroporación es una técnica utilizada para introducir moléculas en las células.
- Los dispositivos microfluídicos permiten un control preciso del flujo de fluidos y la manipulación celular.
- La administración secuencial de biomoléculas puede mejorar los resultados experimentales.
- Mantener la viabilidad celular durante el proceso es crucial para aplicaciones posteriores.
Objetivo del estudio
- Desarrollar una plataforma para la liberación controlada de múltiples biomoléculas.
- Mejorar la eficiencia de la entrega molecular en células.
- Garantizar una alta viabilidad celular tras la electropermeabilización.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones de DPBS con células y biomoléculas.
- Uso de un sistema neumático de control de flujo para la entrega de fluidos.
- Formación de vórtices a escala microscópica en cámaras de electropermeabilización.
- Aplicación de pulsos eléctricos breves para facilitar la absorción molecular.
Resultados principales
- Entrega exitosa de múltiples biomoléculas a las células.
- Alta eficiencia y viabilidad de las células procesadas.
- Capacidad demostrada para dosificación secuencial y controlada.
- Potencial para el análisis posterior de las células tratadas.
Conclusiones
- La plataforma desarrollada ofrece un avance significativo en las técnicas de entrega molecular.
- Permite un control preciso sobre la dosis y el momento de la administración de biomoléculas.
- Este método puede aplicarse a diversos estudios biológicos que requieran una viabilidad celular alta.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma de electroforesis microfluídica aborda la necesidad de una entrega precisa y secuencial de múltiples biomoléculas en poblaciones celulares homogéneas, una capacidad fundamental para la selección de terapias combinadas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Al permitir la visualización en tiempo real y el ajuste in situ de parámetros, el sistema aumenta la confianza predictiva en la eficiencia de absorción molecular al mantener una viabilidad elevada, lo que respalda decisiones confiables de avance o interrupción en los flujos de trabajo de validación de dianas. La capacidad de la tecnología para entregar macromoléculas cargadas y neutras con una eficiencia constante (>70%) independientemente del peso molecular proporciona una base escalable y reproducible para el desarrollo de ensayos en investigación oncológica y farmacológica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de los efectos moleculares combinatorios sobre células de cáncer de mama metastásico mediante la administración secuencial y controlada por dosis de moléculas de dextrano con diferentes tamaños y cargas.
- Valor operativo: Aísla poblaciones celulares uniformes mediante vórtices a escala microscópica, reduciendo la variabilidad en la eficiencia de la electropermeabilización y mejorando la reproducibilidad entre réplicas.
- Valor predictivo: El monitoreo en tiempo real mediante fluorescencia permite la optimización inmediata de los parámetros del pulso, mejorando la eficiencia de administración y la calidad de los datos para ensayos funcionales posteriores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Facilita la preparación de muestras estandarizadas de células electro poradas adecuadas para la cuantificación basada en citometría de flujo de la incorporación molecular, permitiendo lecturas de ensayo robustas.
- Valor operativo: Integra control neumático de flujo y automatización de válvulas para un intercambio de fluidos constante, lo que permite campañas de entrega secuencial de moléculas de alto rendimiento.
- Escalabilidad: El diseño de la plataforma permite su reutilización en múltiples experimentos con variación mínima, favoreciendo la estandarización de ensayos a nivel institucional.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene una alta viabilidad celular tras la electrotransferencia, asegurando que las células recuperadas sean adecuadas para análisis posteriores, como citometría de flujo y validación funcional.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Permite la prueba controlada de combinaciones moleculares para evaluar efectos sinérgicos o antagónicos, reduciendo la incertidumbre en la selección de combinaciones prometedoras.
- Confiabilidad Predictiva: Ha demostrado una eficiencia de entrega >70% tanto para moléculas de dextrano de 3.000 como de 70.000 Da, lo que respalda una extrapolación confiable a macromoléculas terapéuticas en modelos preclínicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La plataforma se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, donde la administración secuencial de biomoléculas permite la evaluación sistemática de los efectos combinados en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre sinergia molecular al permitir la administración precisa y secuencial de sondas a poblaciones celulares idénticas en condiciones controladas.
- Tamizaje: Proporciona métricas cuantitativas basadas en fluorescencia sobre la captación, que permiten comparar la eficiencia molecular en distintas propiedades fisicoquímicas.
- Análisis: Genera resultados cuantificables (eficiencia de captación, intensidad de fluorescencia) adecuados para análisis estadístico y selección de candidatos en campañas de tamizaje.
- Investigación Traductiva: Mantiene la integridad celular para ensayos funcionales, conectando hallazgos del descubrimiento con la evaluación preclínica de combinaciones moleculares.
- Reutilización Empresarial: Diseñado como un sistema modular de fluidos adaptable a diversas biomoléculas y tipos celulares, que permite su uso repetido en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en estudios de combinación al permitir la administración controlada y secuencial de múltiples agentes a poblaciones celulares uniformes.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante un control preciso del flujo, atrapamiento basado en vórtices y visualización en tiempo real, minimizando la variabilidad dependiente del operador.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al aumentar las tasas de éxito en experimentos de administración molecular, reduciendo el desperdicio de reactivos y los ensayos fallidos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de combinaciones moleculares basada en datos validados de eficiencia de administración y respuestas celulares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la operación de sistemas microfluídicos, generación de pulsos de alto voltaje y microscopía fluorescente para monitoreo en tiempo real.
- Depende de sistemas de control de flujo neumático, generadores de pulsos, amplificadores de alto voltaje y osciloscopios para un control preciso de parámetros eléctricos y fluídicos.
- Necesita la estandarización del temporizado de las válvulas, ajustes de presión y parámetros del pulso entre diferentes usuarios para garantizar la formación reproducible de vórtices y la eficiencia de la electropermeabilización.
- La adaptación a diferentes tipos celulares puede requerir la optimización de las tasas de flujo, la duración del atrapamiento y los parámetros del pulso según el tamaño celular y las propiedades de la membrana.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de manipular con cuidado los componentes de alto voltaje y el posible estrés por cizalladura en tipos celulares sensibles durante la formación del vórtice.
