Vortex asistida Microscale Electroporador para entrega secuencial Molecular

El objetivo general de este procedimiento es administrar varios tipos de moléculas biológicamente significativas de manera secuencial y controlable por dosis con alta eficiencia utilizando el porer microfluídico asistido por Vortex, esto se logra preparando primero cuatro tubos de centrífuga de 50 mililitros que contienen individualmente soluciones de DPBS con células y biomoléculas, y conectando cada tubo a su respectivo soporte de vial conectado al sistema de control de flujo neumático. El segundo paso es insertar los tubos de entrada de cada vial respectivo en el dispositivo microfluídico con los electrodos de 15 pines incorporados. A continuación, las células fluyen hacia el dispositivo, donde quedan atrapadas en vórtices a microescala formados en las cámaras de electroporación.

El paso final es aplicar pulsos eléctricos cortos a las células atrapadas, seguidos rápidamente de inyectar las soluciones que contienen las biomoléculas que se entregarán en el citosol. En última instancia, las células obtenidas de este proceso pueden liberarse y recogerse para su análisis posterior. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que la técnica propuesta es capaz de administrar secuencialmente una cantidad controlada de múltiples moléculas en una población celular idéntica preseleccionada con alta eficiencia y viabilidad.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de intercambio de fluidos son difíciles de aprender debido a la sincronización del paso de flujo frío en cada solución. El paso de conmutación determina la estabilidad del atrapamiento de celdas. En esta placa experimental se utilizará una línea celular de cáncer de mama metastásico M-D-A-M-B 2 31 una vez 10 por la quinta célula por mililitro en un volumen de 10 mililitros por T 75 Matraz de cultivo de tejidos en el medio L 15 de Leibovitz suplementado con 10% de volumen por volumen, suero fetal bovino y 1% de penicilina.

La estreptomicina incuba las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un ambiente de 0% de dióxido de carbono. Dos días después de la siembra, coseche las células para los experimentos. Después de lavar las células con solución salina tamponada con fosfato bukos o DPBS, trate las células con 0,25% de tripsina EDTA durante dos minutos.

Agregue ocho mililitros de medio de crecimiento para inactivar la actividad enzimática de las células de pellets por centrifusión durante cinco minutos a 200 veces G y resuspenda el medio a una concentración final de cinco veces 10 a la quinta célula por mililitro. El diseño y la fabricación del dispositivo de electroporación microfluídica no se mostrarán en este video, pero se describen en el manuscrito adjunto. El sistema consta de entradas para células, moléculas y una solución de lavado.

Dos canales rectos donde se produce el enfoque inercial. 10 cámaras de electroporación con electrodos y una salida para configurar los experimentos de flujo. Inserte una salida, poliéter, éter cetona o tubo de pico, y el electrodo de aluminio de 15 pines para aplicaciones de alto voltaje y pulso corto en los lugares designados a través de los orificios del microcanal.

El electrodo de 15 pines consta de 10 electrodos positivos y cinco negativos. Cada electrodo positivo está espaciado a 1,5 milímetros de distancia de un electrodo negativo, y cada electrodo de la misma polaridad está espaciado a 1,35 milímetros de distancia. Conecte el equipo eléctrico para generar pulsos de onda cuadrada corta de alto voltaje a los electrodos de aluminio que están en contacto con soluciones fluidas.

En el molde PDMS, el equipo debe consistir en un generador de pulsos y un amplificador de alto voltaje construido internamente. Prepare cuatro tubos de centrífuga de 50 mililitros que contengan individualmente DPBS y soluciones con células y moléculas. Conecte cada tubo a su respectivo soporte de vial conectado al sistema de control de flujo neumático.

Conecte el tubo de pico de entrada de los soportes de viales a los orificios de entrada respectivos en el dispositivo microfluídico. A continuación, listo. La magnitud de los pulsos de onda cuadrada es de voltios a 100 voltios.

Para que la intensidad del campo eléctrico a través de la cámara de electroporación sea equivalente a 0,7 kilovoltios por centímetro. Ajuste el regulador de presión a 40 PSIA, se utiliza una sola fuente de nitrógeno ajustable manualmente para presurizar uniformemente todos los viales de muestra y utiliza un colector de alta velocidad para activar oportunamente los puertos de solución individuales. Uso del software de vista de laboratorio personalizado para el control de válvulas.

Abra el software de vista de laboratorio etiquetado como corredor de válvulas y haga clic en ejecutar en el menú desplegable titulado Operar. Haga clic en el icono de la válvula correspondiente valve one para abrir la válvula del depósito DPBS para cebar la velocidad de flujo requerida para la generación de vórtices de atrapamiento de celdas estables durante 1,5 minutos. El icono de la válvula debe cambiar de gris a verde cuando se activa el flujo, tanto el lavado como las soluciones celulares a través del dispositivo simultáneamente durante 10 segundos antes del paso de atrapamiento de celdas.

Para garantizar un flujo ininterrumpido durante el paso de conmutación de la solución, este breve paso de coflujo debe repetirse en cada paso de conmutación de la solución. Cambie el puerto de solución activa de la solución de lavado a la solución de celda para atrapar las celdas en la cámara de electroporación durante 30 segundos. En esta película, las señales fluorescentes azules representan ganchos viables.

Celdas de 3, 3, 3, 4, 5 etapas. Encienda el puerto de lavado y enjuague el dispositivo durante 20 segundos. Con el fin de eliminar las células contaminantes no atrapadas, fluye la solución que contiene la primera molécula de interés.

Yoduro de propidio en el dispositivo con fines de visualización. En esta demostración, se utilizan tintes de ácido nucleico en lugar de hebras DExT marcadas con fluorescencia debido a la relación superior entre el ruido y la señal de los tintes, aplique cinco pulsos cortos inmediatamente después de la inyección de la solución molecular, controle la magnitud y el número de los pulsos eléctricos aplicados en tiempo real utilizando un osciloscopio, las señales fluorescentes de las moléculas se pueden visualizar bajo el microscopio, Incubar las células durante 100 segundos en la solución molecular. A continuación, la solución que contiene la segunda molécula, el ácido nucleico, se colorea yo-yo en el dispositivo.

En esta demostración, la segunda molécula se administra sin aplicaciones de pulsos eléctricos adicionales. Esta película confirma que las células ahora expresan las tres señales fluorescentes. Verde para el yo-yo, uno, rojo para el propidio, el yoduro y el azul para los ganchos.

3, 3, 3, 4, 5. Libere las celdas en una placa de 96 pocillos para el análisis posterior bajando la presión de funcionamiento por debajo de cinco PSI. De cada liberación se recogen aproximadamente 100 microlitros de solución con 100 células.

El procedimiento de electroporación debe repetirse al menos tres veces para recolectar suficientes celdas para la centrífuga de citometría de flujo. La placa de 96 pocillos que contiene células procesadas a 228 veces G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante que contiene el exceso de moléculas fluorescentes y vuelva a suspender las células en DPBS.

Si se administraron hebras DExT marcadas con fluorescencia, las células se analizan posteriormente para determinar la absorción molecular. Eficiencia por citometría de flujo. El éxito de la entrega molecular se determinó cualitativamente mediante el seguimiento de los cambios en la intensidad de la fluorescencia de las células orbitales electroporadas en C dos, lo que confirmó que el 90% de las células tratadas absorben los 70.000 Dalton una molécula iónica de la cadena DExT.

La eficiencia de cada molécula de dextrano transferida, definida como la relación entre el número de células que absorbieron con éxito la molécula de interés y el número total de células procesadas, no varió sustancialmente en función del peso molecular o de las cargas eléctricas. Todas las moléculas de dextrano probadas se administraron en el citosol con una eficiencia superior al 70%Aquí se muestran nuestros perfiles representativos de citometría de flujo para células que no se trataron con electroporación. El umbral fluorescente que indica el éxito de la administración molecular se establece a partir de los datos, de modo que las señales de las muestras de control se encuentran por debajo del umbral.

Estos datos representativos de citometría de flujo para células electroporadas secuencialmente muestran el gráfico de citometría de flujo junto a las imágenes de rayas fluorescentes, los cuadros verdes representan las señales de las células que absorben 3000, el dextrano neutro de Dalton solamente, y los cuadros rojos representan las señales de las células. Absorción de 3000 Dalton, una hebra iónica de DExT, solo señales fluorescentes de las células que absorben, ambas moléculas de hebra de DExT que se muestran en amarillo indican una eficiencia de entrega de molécula dual del 56% después de su desarrollo. Esta técnica será útil para que los investigadores en el campo de la medicina, la biotecnología y la farmacología exploren la combinación de reactivos terapéuticos para lograr efectos sinérgicos en el tratamiento de enfermedades complejas.

No olvide que trabajar con pulsos eléctricos de alto voltaje puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como asegurarse de estar conectado a tierra mientras se realiza este procedimiento.