Plataforma de microfluídico digital basada en electrohumección para el ensayo automatizado de inmunoabsorbentes ligados a enzimas

La automatización de la activación de gotas individuales permite que las secuencias complejas de una operación de unidad de laboratorio se coloquen en un solo chip. Nuestra plataforma microfluídica digital aborda la detección rápida específica en el campo de patógenos virus. Este método se basa en la detección cuantitativa de antígenos específicos utilizando microfluídicos digitales basados en EWOD en combinación con inmunoprecipitación magnética.

En esta contribución, el método se evalúa contra muestras que contienen diversas concentraciones de bacterias, esporas, virus y proteínas. Este proceso es totalmente automatizado, secuencial, escalable y versátil. La secuencia y el volumen de droplet se pueden modificar para que coincidan con los requisitos de un protocolo determinado.

La detección basada en anticuerpos por completo, la plataforma de microfluídicos digitales podría construirse a una aplicación potencial basada en la biosenálisis de aptámeros donde las perlas magnéticas llevan aptámeros específicos para la captura y detección de secuencias de nucleótidos. Al probar esta técnica por primera vez, es importante tener en cuenta el tipo de surfactante y cómo interactúa con su elección de bioquímica y el recubrimiento de polímero hidrófobo. Comience quitando el imán de los microfluidos digitales o la plataforma DMF y colocándolo en el banco.

Coloque una placa de accionamiento limpia en el escenario giratorio con el cromo hacia arriba, alineando la placa con la esquina superior izquierda de la etapa empotrable. Sujete la placa de accionamiento desde la parte superior utilizando el panel con los 47 pasadores de contacto, que fijarán la placa en su lugar y facilitarán la alineación con los pasadores de contacto. A continuación, vajilla la cuña de 0,5 milímetros y el separador DE PMMA de dos milímetros en la etapa giratoria para proporcionar un espacio controlado entre las placas de accionamiento y de cubierta.

Para cargar las gotas en las almohadillas de carga propuestas, aliquot cuatro gotas de 2,5 microlitro del búfer en ejecución en las almohadillas denotadas B, A, R y E usando una gota por almohadilla. A continuación, alícuota 2,5 microlitros de solución de peróxido de hidrógeno luminol en la almohadilla denotada E. A continuación, los microlitros alícuotas 2,5 de Neutravidin conjugados con anticuerpos secundarios biotinilados HRP y microperras en las almohadillas F, G y I, respectivamente.

Finalmente, alícuota 2,5 microlitros de la muestra desconocida en la almohadilla denotada C. Coloque la placa de cubierta en la superficie de la plataforma junto al área de empotrar redonda y deslícela lateralmente en el hueco y en la parte superior de la placa de accionamiento. Coloque el imán permanente en la parte superior de la placa de cubierta y asegúrelo deslizando los dos pestillos, luego gire el escenario 180 grados e inspeccione visualmente para asegurarse de que las gotas cargadas todavía están en su lugar.

Compruebe que la posición de carga de cada gota coincide con la secuencia de accionamiento programada en el software. Coloque la lata de fotodetector filtrada en la ranura de la etapa giratoria y conecte el cable. Coloque la tapa sobre la plataforma DMF e inicie la secuencia del programa utilizando la interfaz de software.

La ubicación de las gotas se registra a través de la detección capacitiva y luego se puede observar en la interfaz de usuario. La secuencia del programa solicitará los mensajes que aparecen en la interfaz para informar al operador de que la gota de luminol está lista para recoger las perlas magnéticas extraídas o la gota de detección está lista para ser trasladada al sitio de detección. En ambos casos, se requiere la confirmación del operador para continuar.

La intensidad de la luz producida por la reacción quimiominiscente es leída por fotodetector y registrada en tiempo real. Para operar en modo visual para la optimización de protocolos, inicie la secuencia del programa utilizando la interfaz de software. El accionamiento automatizado de gotas se puede visualizar en el chip para cada uno de los pasos críticos del ensayo, como la extracción magnética de las perlas, la resuspensión de las perlas y la mezcla.

Cuando se le solicite, monte la lata de fotodetector cribada en la ranura de la etapa giratoria. Conecte el cable de la lata de fotodetector mediante la inserción de los pines en el zócalo. Coloque la tapa sobre la plataforma DMF y reanude el ensayo.

Las gotas se supervisan mediante detección capacitiva y se pueden observar en la interfaz de usuario. Para limpiar el equipo, abra la tapa de la plataforma DMF y gire el escenario 180 grados. Desenreje la carcasa del imán y retire el imán de la etapa giratoria.

Retire la oblea de silicio del resbalón con un par de pinzas y enjuáguela con agua destilada. Luego séquelo con aire comprimido y colócalo en un plato de Petri donde la oblea pueda ser almacenada y reutilizada. Utilice una micropipeta para eliminar los residuos líquidos de la almohadilla sin tocar la superficie y limpiar la superficie eliminando el líquido de la placa de accionamiento con papel absorbente.

Para investigar el impacto del voltaje de accionamiento, se condujo una gota del búfer a varias tensiones de accionamiento y se registró su movimiento. Se demostró una correlación entre Vrms y la velocidad media y se observó una meseta de velocidad después de un cierto valor de Vrms. La longevidad de la placa de accionamiento se redujo cuando se utilizaron valores altos para Vrms.

Para el funcionamiento de la unidad de laboratorio de extracción, la gota que contiene las perlas suspendidas fue conducida al lugar de separación en el centro de la zona de mezcla. Luego el imán se activó automáticamente para acercarse al chip y enfocar las perlas. A continuación, la gota se movió hacia la plataforma de residuos, dejando las cuentas.

Las operaciones de la unidad de laboratorio de extracción y mezcla en el chip EWOD facilitaron un procesamiento de muestras rápido y reproducible miniaturizado con detección consecutiva de los patógenos en 6 a 10 minutos. Los tiempos de incubación y las concentraciones conjugadas fueron variados para encontrar las condiciones óptimas para el ensayo. Se encontró que el tiempo de incubación de 160 segundos y la concentración conjugada de dos microgramos por mililitro lograron la mejor relación señal-ruido.

Se pueden introducir variaciones en el protocolo para lograr los niveles deseados de automatización. El ELISA de ocho pasos se utilizó para detectar diferentes antígenos como las esporas de Bacillus atrophaeus y el bacteriófago MS2. Mientras tanto, el protocolo de 10 pasos se utilizó para cuantificar E.coli.

Es importante asegurarse de que los voltajes aplicados, las concentraciones de analitos y reactivos son óptimos para la activación de las gotas y la separación magnética exitosa en el chip. Para lograr una medición precisa, se debe considerar la capacidad de unión de cuentas y podrían ser necesarias diluciones en serie de los analitos. Al intercambiar el tipo de anticuerpo, se podrían detectar diferentes patógenos del reportado en la sección de resultados.

El método también podría aplicarse, por ejemplo, para la detección de biomarcadores o el diagnóstico en el punto de atención. Además de las aplicaciones ya presentadas, el sistema se ha desarrollado teniendo en cuenta la detección en el campo de patógenos en el aire. DMF es una plataforma ideal para esta aplicación porque el volumen de gotas coincide con la salida de otro sampler que hemos desarrollado recientemente.