Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Sola célula secuencia revela heterogeneidad genotípica en los sistemas biológicos, pero las tecnologías actuales carecen de la capacidad necesaria para el perfilado profundo de la función y composición de la comunidad. Aquí, describimos un flujo de trabajo de microfluidos para la secuencia > 50.000 genomas unicelulares de diversas poblaciones de la célula.

El objetivo general de este experimento es generar datos de secuenciación genómica con código de barras a partir de decenas de miles de células individuales utilizando una serie de dispositivos microfluídicos. Este método logra un rendimiento de secuenciación de una sola celda sin precedentes. Utilizamos la microfluídica para encapsular, lisar y codificar células de código de barras individualmente, preservando la heterogeneidad genómica subyacente, que se pierde en el choque convencional en los estudios de secuenciación.

La principal ventaja de esta técnica es que es de alto rendimiento y capaz de producir datos de una sola célula a partir de decenas de miles de células. Aunque trabajamos con microbios en esta demostración, el flujo de trabajo se puede adaptar para su uso con diferentes tipos de células a través de pequeñas modificaciones en las dimensiones del dispositivo microfluídico. Para comenzar el protocolo, prepare un mililitro de agarosa de 3%% de peso por volumen a baja temperatura de fusión en tampón 1X Tris-EDTA, o TE.

Mantenga la solución de agarosa en un bloque de calor a 90 grados centígrados hasta que se cargue la jeringa. Vuelva a suspender las células en un mililitro de solución salina tamponada con fosfato, o PBS, y centrifuga las células. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender la célula en un mililitro de 17% de volumen a volumen de medio de gradiente de densidad en PBS, y mantenga las células en hielo hasta que se cargue la jeringa.

A continuación, cargue una jeringa de tres mililitros con aceite fluorado, o HFE, que contenga un surfactante PFPE-PEG del 2% de peso por peso. Colóquelo con una aguja de calibre 27 y colóquelo en una bomba de jeringa. Cargue la suspensión de celdas y la agarosa fundida en jeringas de un mililitro, ambas con agujas de calibre 27, y colóquelas en bombas de jeringa.

Luego, ajuste un calentador de espacio a alto y coloque la superficie de calentamiento a 10 centímetros de la jeringa. Asegúrese de que la temperatura medida en la jeringa sea de aproximadamente 80 grados centígrados. Antes de insertar los tubos en el dispositivo, cebe las bombas para eliminar el aire de la línea.

Conecte las agujas de la jeringa a las entradas del dispositivo microfluídico con trozos de tubo de polietileno o PE. Conecte un trozo de tubo a la toma de corriente y coloque el extremo libre en un tubo de recolección de 15 mililitros. Después de la caída en gota, coloque el tubo de recolección a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para asegurar la gelificación completa de la agarosa.

Retire la capa inferior de aceite del tubo de recolección con una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 20, teniendo cuidado de no alterar la capa superior de las gotas de agarosa. Agregue un mililitro de 10% de volumen por volumen de PFO en HFE para romper las gotas de agarosa de su capa de surfactante. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo durante un minuto para cubrir completamente las emulsiones, que deben ser homogéneas y libres de grumos.

Girar el tubo cónico a 2.000 g durante un minuto para recoger los microgeles de agarosa. Aspire el sobrenadante PFO/HFE y asegúrese de que los microgeles estén libres de su capa de surfactante y sean transparentes. Después de lavar los microgeles, verifique la encapsulación celular en los microgeles bajo un microscopio con un aumento de 400X tiñendo una alícuota de 10 microlitros de geles con tinción de ácido nucleico 1X.

Conecte la entrada de las celdas de un dispositivo dropmaker de coflujo con una pequeña pieza de soldadura de plomo. Antes de insertar los tubos en el dispositivo, cebe las bombas para eliminar el aire de la línea. Conecte un trozo de tubo a la toma de corriente y coloque el extremo libre en un tubo de PCR de 0,2 mililitros.

Utilice los caudales en la pantalla para la fabricación de gotas. Recoja las gotas en los tubos de PCR con aproximadamente 50 microlitros de gotas en cada tubo. Después de la caída de gotas, retire con cuidado la capa inferior de aceite HFE de las emulsiones con puntas de pipeta con carga de gel y reemplácela con aceite fluorado FC-40 que contenga un surfactante PFPE-PEG del 5 % de peso por peso.

A continuación, programe el ciclo térmico. Antes de insertar los tubos en el dispositivo, cebe las bombas para eliminar el aire de la línea. Conecte las jeringas que contienen HFE, mezcla de etiquetado y microgeles a las entradas del dispositivo microfluídico utilizando trozos de tubo de PE.

Conecte un trozo de tubo a la salida y coloque el extremo libre en una jeringa vacía de un mililitro con el émbolo dibujado hasta la línea de un mililitro. A continuación, verifique la tasa de encapsulación de microgel bajo un microscopio óptico con un aumento de 400X. Coloque la jeringa que contiene las emulsiones de etiquetado con una aguja e incube en posición vertical en un bloque de calor o en el horno durante una hora a 55 grados centígrados para fragmentar el ADN genómico.

Prepare las gotas del código de barras para la fusión reemplazando la fracción de aceite FC-40 con HFE 2%peso por peso PFPE-PEG. Transfiera con cuidado las gotas a una jeringa de un mililitro, colóquela con una aguja y colóquela en una bomba de jeringa. Cargue la jeringa de gotas de microgel incubada y marcada en una bomba de jeringa.

A continuación, conecte las tres jeringas de cloruro de sodio a las dos entradas de electrodos y a la entrada de un solo foso utilizando trozos de tubo de PE. Antes de insertar los tubos en el dispositivo, cebe las bombas para eliminar el aire de la línea. Conecte las tres jeringas HFE montadas en bombas a las dos entradas de aceite espaciadoras y a la entrada de aceite de dropmaking usando piezas de tubo de PE.

Luego, dispare todos los tubos de reinyección de gotas con una pistola antiestática antes de conectar el tubo a las agujas de la jeringa. Conecte la jeringa de mezcla de PCR, la jeringa de microgel y la jeringa de código de barras a sus respectivas entradas con un tubo de PE. Conecte la aguja de la jeringa del electrodo a un inversor fluorescente de cátodo frío mediante una pinza de cocodrilo.

Ajuste la fuente de alimentación de CC del inversor a dos voltios. Ejecute el dispositivo de doble fusión con los caudales recomendados. Recoja las gotas en tubos de PCR con aproximadamente 50 microlitros de emulsión en cada tubo.

Antes del ciclo térmico, retire con cuidado la capa inferior de aceite HFE de las emulsiones utilizando puntas de pipeta con carga de gel y reemplácelas con aceite fluorado FC-40 que contenga un surfactante PFPE-PEG del 5% de peso por peso. Luego, programa el ciclo. Para recuperar el ADN de las gotas del ciclo térmico, agrupe las gotas en un tubo de microcentrífuga y rompa las emulsiones con 20 microlitros de PFO.

Vórdelos durante 10 segundos para mezclar. Gira el tubo. Retire con cuidado la capa acuosa superior del tubo con una pipeta y transfiérala a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Deseche la fase oleosa. Luego, finalmente, continúe con los pasos de preparación, secuenciación y análisis de la biblioteca. Un histograma de los recuentos de códigos de barras en comparación con el tamaño del grupo muestra que una parte significativa de los grupos de códigos de barras válidos está justo por encima de los pares de kilobases por tamaño de umbral de grupo, lo que excluye los huérfanos mutados por PCR.

La abundancia relativa de los tipos de células de una comunidad sintética de 10 células de tres bacterias gramnegativas, cinco bacterias grampositivas y dos levaduras se calculó contando las lecturas brutas y los grupos de códigos de barras. Un mapa de cobertura circular de las lecturas de B. subtilis de todos los grupos de códigos de barras ilustra la uniformidad de las lecturas de SiC-seq, sin regiones de abandono observables, donde la cobertura promedio fue de 5,55X. La uniformidad de la cobertura se verificó con una distribución de frecuencias de valores de cobertura normalizados.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener una tasa de encapsulación de alrededor de un código de barras o celda por cada 10 gotas. Esto limita la probabilidad de un evento de encapsulación doble, que puede convolucar los datos de una sola celda. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y operar los dispositivos microfluídicos utilizados para generar datos de secuenciación de una sola célula.

Una vez dominada, esta técnica se puede ejecutar en ocho horas o dos días de cuatro horas.