Name: Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a secuenciar genomas de miles de células individuales mediante microfluidos de alto rendimiento. Este método encapsula, lisa y codifica células preservando la heterogeneidad genómica para estudios de comunidades microbianas.

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Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation a través de un premio de carrera (número DBI-1253293); los institutos nacionales de salud (NIH) (grant números HG007233-01, 01-EB019453-R01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); y la defensa avanzada investigación proyectos Agencia fundiciones programa de vida (número de contrato HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

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Patentes relativas a este flujo de trabajo pueden ser licenciado en la Bio de la misión, de que Adam R. Abate es un accionista.

El flujo de trabajo de SiC-seq microfluídicos produce sola célula genoma secuencia datos de miles de células bacterianas. Códigos de barras digitales empalmados en los genomas de las células encapsuladas de microgel permiten la deconvolución en silico de datos NGS en grupos de código de barras Lee originarios de la misma célula. Un experimento de control con una comunidad microbiana de composición conocida es necesario para evaluar la pureza de los grupos de código de barras. Una gran parte de los grupos de baja pureza indica que la tasa de encapsulación de la célula es demasiado alto o que hay gota significativa la contaminación cruzada que ocurre durante las etapas de procesamiento de microfluidos. Según las estadísticas de Poisson, las células y códigos de barras deben ser encapsuladas en una proporción de blanco de 1 partícula por 10 gotas limitar la tasa de múltiples eventos de encapsulación a menos del 5% de todas las gotas no vacío. Una mayor tasa de encapsulación aumenta las tasas de Dobletes exponencialmente, por lo que la verificación de la relación de encapsulación durante el proceso de dropmaking es de importancia crítica. Los usuarios deben ser particularmente cautelosos de la encapsulación de varias celdas en una sola microgel ya lee de diversas células que comparten la misma secuencia de código de barras no puede ser bioinformatically separado. En el caso de 1 célula recibe 2 códigos de barras diferentes, la pureza del grupo de código de barras no se ve afectada aunque los parámetros de la abundancia están sesgados cuando cuenta la secuencia de código de barras.
Gota la contaminación cruzada también puede presentarse debido a las condiciones de fusión subóptima. Durante una operación de éxito, el dispositivo de fusión de microfluidos (figura 5) puede controllably par 1 gotita de código de barras con 1 microgel y un volumen de reactivo PCR. Las tasas de flujo no ideal se traducirá en una gota de emparejamiento en proporciones incorrectas: 1 código de barras puede combinarse con 2 microgels, por ejemplo. Todas las tarifas de flujo enumeradas en el protocolo pretenden ser las estimaciones y pueden necesitar ser ajustado según pequeñas variaciones en los tamaños de geometría y gotita de dispositivo. Los usuarios con acceso a cámaras con capacidad de grabación de alta velocidad (> 10.000 frames/s) deben verificar la fusión correcta gota al principio y en el transcurso de la operación de microfluidos. Los usuarios sin acceso a una cámara de alta velocidad pueden recoger un pequeño volumen de la salida fusionada y medir manualmente los tamaños de gota bajo el microscopio. El tamaño de las gotas debe ser uniforme: un exceso de códigos de barras sin combinar o microgel gotas indica que las tarifas de reinyección deben reducirse en consecuencia.
Varios general Precauciones al manejar microgels y microgotas para preservar su integridad. Microgels, aunque mecánicamente robusto, debe ser suficientemente refrigerado por antes de la ruptura y lavado pasos para asegurar la completa gelificación. Microgels no-esféricas son una indicación que la agarosa no se da suficiente tiempo para solidificar. Lavado microgels, desactivación las suspensiones a la velocidad requerida para evitar una pérdida de producto. Hidrogel de agarosa tiene un índice de refracción cerca que la del agua y puede ser difícil de ver en un tubo22, así que los usuarios deben identificar cuidadosamente el límite de gel líquido antes de la aspiración. Gotas de agua en aceite son susceptibles a la fusión por la acumulación de fuerzas estáticas23 laboratorio guantes y tubería. Por esta razón, se recomiendan cargar las jeringas de reinyección de gotitas con las manos desnudas y el tratamiento de todas las líneas de reinyección con una pistola antiestática antes de cebado de la bomba. Gotas grandes coaligadas pueden eliminarse lentamente girando las emulsiones en una jeringa y aspirar manualmente las gotas más grandes, que se acumulan en la parte superior debido a su mayor fuerza boyante.
SiC-seq es la primera tecnología para demostrar la secuenciación del genoma de unicelular de > 50.000 células bacterianas. Esta plataforma ofrece ventajas significativas en el rendimiento sobre los enfoques existentes y permite un muestreo más profundo de las comunidades microbianas heterogéneas. Hasta la fecha, tecnologías de microfluidos para la secuenciación del genoma de la célula solo han empleado microchambers micropocillos y9 24 para aislamiento de células y la amplificación, pero con rendimientos en el rango de sólo decenas a cientos de células. La clasificación del flujo de las células en wellplates5,6 no requiere ninguna instrumentación especializada microfluídicos pero posee un rendimiento igualmente bajo. Dado que las muestras de suelo y agua del ambiente comúnmente tienen las diversidades alfa de > 1.000 en las especies de nivel25,26, SiC-seq es altamente ventajosa en virtud de su capacidad para un número mucho mayor de organismos de la muestra. El flujo de trabajo de SiC-seq es adaptable a las entradas de celda de laboratorio cultura, el medio ambiente natural o un anfitrión vivo. Una muestra de células hay que estar en una suspensión acuosa y libre de partículas grandes (> 10 μm) adecuada para la encapsulación de microfluidos. Por ejemplo, el método se ha aplicado previamente a una muestra de agua de mar utilizando una serie de lavado y filtrado de pasos para el procesamiento previo de las células antes de la encapsulación17.
El protocolo de SiC-seq genera una cantidad relativamente escasa de los datos de la secuencia de cada célula individual y puede no ser adecuado para todas las aplicaciones. Algunos algoritmos de Bioinformática como Asamblea de genoma de novo o variante de un solo nucleótido (SNV) que requieren profundidades de cobertura más alto para trabajar con eficacia. En cambio, grupos de código de barras pueden ser agrupado en silico por binning taxonomía de métodos27 para que los algoritmos pueden ser aplicados en grandes conjuntos de lecturas. La relativamente baja eficiencia de código de barras general del flujo de trabajo SiC-seq también puede presentar retos en casos donde la disponibilidad de la muestra de entrada es baja. SiC-seq se basa en un paso de la encapsulación de código de barras de distribución de Poisson, por lo tanto, aproximadamente el 10% de las células recibe un código de barras molecular y se amplifican durante la etapa de preparación final de la biblioteca. Mientras que esto es comparable a otros planes microdroplet basado en código de barras del10, los usuarios que trabajan con muestras de células preciosas pueden tener dificultad para lograr el rendimiento adecuado de la biblioteca para la secuencia y pueden necesitar aumentar el número de ciclos PCR en la final etapa de AMPLIFICACION. Otra posible solución para usuarios con conocimientos de microfluidos es ordenar gotas de código de barras positivas después del paso PCR digital, así que la eficacia total de código de barras > 85%28.
Una potencial futura dirección para la tecnología SiC-seq es adaptar el flujo de trabajo para el uso con las células mamíferas, allanando el camino para nuevos estudios clínicos de unicelulares. Por ejemplo, un análisis de la variación del número de copia entre cáncer solo células mayo mejorar nuestra comprensión del papel de la heterogeneidad en la patología de cáncer2. Por otra parte, integrar SiC-seq con métodos existentes para probar y enriquecer secuencias de ADN de interés29 permitiría la secuenciación específica de unicelular de subpoblaciones o raras cepas de células. Con muestras ambientales, genes de dentro de un camino metabólico conocido podrían dirigidos y analizados contextualmente junto a vecinos de genes para identificar novela islas genómicas. Desde dentro de un ambiente del anfitrión humano, muestras de bacterias patógenas bajo título podrían ser aisladas y secuenciaron en el nivel unicelular para examinar más de cerca sus orígenes genotípicos de virulencia.

El genoma sirve como un modelo de identidad celular y función, que contiene la totalidad de un organismo del potencial de codificación. Una comprensión de la biología celular a nivel de genoma puede explicar la diversidad fenotípica observada en poblaciones celulares heterogéneas. Esta heterogeneidad es evidente en los sistemas biológicos y tiene amplias implicaciones para la salud y la enfermedad. Por ejemplo, las variaciones número de la copia del gene entre las células del tumor están ligadas a la evolución y propagación de cáncer1,2. Infecciones bacterianas, Islas de patogenicidad presentes en una pequeña fracción de los genomas pueden ser transferidas horizontalmente y conducen a la proliferación de bacterias antibiotic-resistant3,4. Un desafío principal en el estudio de genomas a nivel unicelular es la baja cantidad de ADN disponible, así como la necesidad de analizar miles de células a la muestra la completa diversidad de genotipos. Por estas razones, limitaciones en el rendimiento experimental han obstaculizado la efectividad de los estudios de unicelulares, sesgar los resultados hacia las células más abundantes. Técnicas de aislamiento de células individuales como flujo clasificación5,6, pinza óptica7, empotramiento en a granel geles8y microfluídica9 son capaces de procesar cientos de células para secuenciación; sin embargo, esto representa sólo una pequeña fracción de la mayoría de las muestras. Un método de secuenciación del genoma de unicelular con rendimiento de procesamiento substancialmente más alta permitiría más profunda y más completa de perfiles de poblaciones celulares, así dilucidar el papel de la diversidad genotípica dentro de estas comunidades.
Microfluídica de gotas permite la manipulación de alto rendimiento de las células y reactivos biológicos dentro de millones de reactores picolitros-escala. Hasta la fecha, microdroplet tecnologías se han utilizado para estudiar patrones de expresión diferencial entre las células de los tejidos heterogéneos10,11,12, profundamente la secuencia de moléculas largas13,14 ,15y análisis de secuencia (ChiP-seq) de inmunoprecipitación conducta cromatina de las células16. De hecho, microgotas son capaces de operaciones de alto rendimiento, compartimentadas, haciéndolos susceptibles a aplicaciones en genómica unicelular. El desarrollo de esta tecnología presenta sus propios retos tecnológicos, sin embargo. Células deben lisis, purificadas y amplificadas con sesgo mínimo, uniformemente las poblaciones celulares de muestra. Además, a diferencia de cofia transcripciones del mRNA en células de mamíferos, no existe motivo molecular comparable en el genoma para facilitar la captura del ácido nucleico Diana. Por estas razones, secuenciación del genoma de la célula de solo ha sido difícil de implementar en plataformas microdroplet.
En este trabajo, proporcionamos un protocolo detallado de nuestro enfoque previamente divulgados microfluídicos unicelular capaz de secuenciar los genomas de decenas de miles de células en un solo experimento17. Con esta tecnología, llamada SiC-seq, las células bacterianas son encapsuladas en microescala hidrogeles individualmente lisis, tagmented y se fusionó con un microdroplet que contiene un código de barras único oligonucleótido, que se empalma en el ADN genómico de la célula a través de un superposición única extensión reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los hidrogeles sirven como contenedores aislados en los que DNA genómico de alto peso molecular sterically se encajona, permitiendo que las moléculas más pequeñas tales como detergentes y enzimas líticas para acceder y purificar el ADN antes de código de barras18. Este protocolo de procesos > 50.000 células en cuestión de horas, lo que resulta en una biblioteca de código de barras para la secuencia. Tras la secuencia, las lecturas son demultiplexed según su secuencia de barras unicelular, resultando en un conjunto de datos conformada por millones de lecturas, cada una con un índice de celular.

<table><tbody><tr><td>Obleas de silicio de 3", tipo P, grado de prueba virgen</td><td>Obleas universitarias</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 fotorresistente</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>Recubridor</td> giratorio <td>Sistemas de recubrimiento especiales</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Fotomáscaras</td><td>CadArt Servcies</td><td>(personalizado)</td><td>Ver archivos complementarios para diseños de máscaras</td></tr><tr><td>Desarrollador de PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>484431</tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich 109827</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastómero de silicona</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de desgasificación</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>punzón de biopsia de 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio (75 mm x 50 mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel (tratamiento hidrofóbico del vidrio)</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 tubo de polietileno</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de calibre 27</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>New Era Sistemas de bombeo</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 aceite fluorado ( HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 aceite fluorado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE surfactante</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactante</td><td></td></tr><tr><td>Calefactor de espacio</td><td>Lasko&nbsp;</td><td>CD09250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa, baja temperatura de gelificación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7.4</td><td>E& K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (medio de gradiente de densidad)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80 (monooleato de sorbitano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbato 20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima Tipo IV</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase (enzima lítica de levadura)</td><td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>Lisostafina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Prueba (100%)</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I (tinción de ácido nucleico)</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (etoxilato de octilfenol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix (Mezcla maestra de arranque en caliente de alta fidelidad)</td><td>New England Biosciences</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst Polymerase (polimerasa isotérmica)</td><td>New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>NT buffer del kit Nextera XT (buffer de neutralización)</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Inversor fluorescente de cátodo frío</td> <td>(personalizado)</td> <td>(personalizado)</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de CC</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 pistola antiestática</td><td>Milty 5036694022153</td><td></td><td></td></tr><tr><td>soporte de jeringa de centrífuga impreso en 3D</td> <td>(personalizado</td><td>) (personalizado)</td><td>Ver archivos complementarios para el archivo de impresión</td></tr><tr><td>3D Zymo DNA Clean & Concentrador-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Tecnologías de secuenciación han experimentado un cambio de paradigma de bulto a la resolución sola célula en respuesta a una comprensión de la evolución del papel de la heterogeneidad celular en los sistemas biológicos. Sin embargo, unicelular secuenciación de grandes poblaciones se ha visto obstaculizado por limitaciones en el procesamiento de genomas para la secuencia. En este papel, describimos un método de secuenciación del genoma de unicelular (SiC-seq) que utiliza gotas de microfluídica para aislar, amplificar y código de barras los genomas de las células. Encapsulación de la célula en microgels permite la purificación compartimentado y tagmentation de la DNA, mientras que una fusión de microfluidos pares eficientemente cada genoma con un código de barras único oligonucleótido unicelular que permite > 50.000 células individuales a ser ordenados por ejecutar. Los datos de secuenciación se demultiplexan por código de barras, generación de grupos de Lee origina de las células. Como método de alto rendimiento y bajo sesgo de secuencia unicelular, SiC-seq permitirá una gama más amplia de estudios genómicos dirigidos a poblaciones de células diferentes.

El flujo de trabajo experimental de SiC-seq contiene 3 dispositivos de microfluidos PDMS fabricados mediante un procedimiento de litografía blanda (figura 1). Un dropmaker de flujo Co (Figura 3A) genera 25 μm de código de barras digital gotitas para el etiquetado de ADN genómico con un identificador único de unicelulares. Los oligonucleótidos de código de barras consisten en una secuencia degenerada de 15 bp flanqueado por las manijas de la PCR para la amplificación (tabla 2, BAR la cartilla). Los códigos de barras son diluidas a una concentración de femtomolar para lograr el encapsulamiento de una sola molécula, y todas las gotas reciben fragmentos de código de barras ya sea 0 o 1. Se amplifican las gotitas que contienen un código de barras, produciendo muchas copias de amplicones de código de barras de doble hebra. Una mancha de ácido nucleico se utiliza para comprobar la amplificación exitosa y cuantificar la tasa de encapsulación de los fragmentos de código de barras (Figura 4B). Los microgels son generados por fluir conjuntamente una suspensión bacteriana y un gel de agarosa fundida en caudales iguales (figura 2A). La agarosa está dispuesta en dos veces la concentración final deseada, como el proceso de dropmaking de flujo Co diluye efectivamente las soluciones acuosas por un factor de 2. Como la agarosa se enfría, se solidifica en un microgel de 25 μm de diámetro ocupando el volumen esférico de la gota.
Una serie de pasos de lavado y lisis purifica el DNA genómico de alto peso molecular en el microgels (figura 2B). Después de romper las emulsiones, se realizan lavados acuosos en grandes volúmenes para diluir un rastro disolventes orgánicos que pueden inhibir los posteriores tratamientos enzimáticos. El lavado microgels se observan bajo un microscopio para verificar la tasa de encapsulación de la célula (Figura 4A). Un cóctel de enzimas con actividad lítica amplia se añade a la suspensión de microgel para digerir las paredes celulares de las bacterias y microbios eucarióticos19. Un segundo tratamiento con proteinasa K y detergente degrada las proteínas y solubiliza restos celulares.
Tagmentation de la DNA purificada se lleva a cabo en gotas para evitar la contaminación cruzada potencial resultante de la difusión de fragmentos de ADN de pequeñas tagmented entre los microgels18. Un dispositivo de encapsulado de la gota (figura 3B) compartmentalizes cada microgel con una enzima tampón y tagmentation, que al mismo tiempo fragmentos de ADN de doble hebra mientras también "etiquetado" con un oligonucleótido precargado20. El microgels se cargan en las gotitas como partículas cerrar-embalado, lograr tasas de encapsulación acercarse 1 microgel para cada gota con pocos dobletes21 (figura 4).
En la etapa final del flujo de trabajo microfluídicos (figura 2), un dispositivo realiza una operación de doble fusión combinando 1 gota de código de barras, 1 gota que contiene el microgel y la mezcla de amplificación en un proceso de dos pasos controlados. En primer lugar, una gota de reactivo PCR está emparejada y se fusionó con una gota de código de barras en la región que se muestra en amarillo (figura 5). Los electrodos agua salados en el canal microfluídico producen un gradiente de alto campo eléctrico que provoca la fusión de gotas. De manera similar, la primera gota se fusionó es apareada con una gotita de microgel y combinó una segunda vez en la región que se muestra en rojo. Las gotitas son recogidas y off-chip en una extensión de solo-solapamiento (SOE) PCR ciclo térmico. Los extremos complementarios superpuestos del código de barras y el ADN genómico de tagmented permiten la fusión y la amplificación exponencial de construcciones de código de barras sólo correctamente.
Los datos de la secuencia es primero filtrados por una calidad de lectura y luego analizados agrupando las lecturas según su secuencia de 15-bp unicelular código de barras. Para que un grupo de código de barras ser considerado válido, debe contener un mínimo de lecturas; este umbral limita el análisis a las células con una cantidad útil de datos de secuenciación y elimina el código de barras de PCR-transformado "huérfanos" del conjunto de datos. En este ejemplo se ejecute, el mínimo se establece en 7,5 kbps por grupo (50 lecturas de 150 bp cada uno). Un histograma de las cuentas de código de barras versus el tamaño del grupo muestra que una porción significativa de los grupos de código de barras válido es justo por encima del tamaño de umbral (figura 6A).
En un experimento de control donde se conoce la composición de la comunidad microbiana, la pureza y abundancia relativa métricas se utilizan para evaluar la calidad de un SiC-seq ejecutar. Aquí, una comunidad de 10 células sintética de 3 bacterias Gram-negativas, 5 bacterias Gram positivas y 2 levaduras se analiza. La pureza de un grupo de código de barras determinado se define como el número de lecturas con el genoma más común en el grupo dividido por el número total de lecturas en el grupo. La gran mayoría de los grupos de código de barras tiene purezas superiores a 0.95 (Figura 6B). Abundancia relativa de los tipos de células se calcula contando el raw Lee y contando los grupos de código de barras, donde los grupos se asignan a un tipo de célula correspondiente al consenso de sus lecturas de miembro (figura 6). La abundancia de grupos de código de barras y lee la pista en proporciones aproximadamente iguales, lo que indica que las poblaciones celulares son ser muestreadas que ciertas especies no figuran en el código de barras desproporcionadamente pequeños o grandes grupos. Trazar la cobertura total de todos los grupos de código de barras de una sola especie indica una alta cobertura a través de todo el genoma, con pocos o ningún regiones de deserción (figura 7). La uniformidad de la cobertura puede ser verificada con una distribución de frecuencia de valores normalizados de la cobertura, con mayoría centrados alrededor de la media de los valores (figura 7, de la inserción).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg"> Figura 1 : Fabricación de dispositivos microfluídicos por Fotolitografía. Maestro (A) moldes con una altura característica solo se fabrican por una capa de photoresist SU-8 sobre una oblea de silicio de la capa de la vuelta. La fotoresistencia es entonces modelado con una máscara photolithographic y luz UV, reticulando el expuesto SU-8. Por último, todo SU-8 se disuelve en un baño de desarrollador. El molde resultante se utiliza para la fundición de PDMS que se enlaza a un portaobjetos de vidrio para producir el dispositivo de microfluidos completa. ()B) para un dispositivo de doble capa, la fabricación del mismo modo comienza con pasos de capa y la exposición de vuelta. Luego se repiten estos pasos para crear un dispositivo de dos capas. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg"> Figura 2: Resumen del flujo de trabajo SiC-seq. Suspensión microbiana (A) A es co fluyó con agarosa fundida en un dispositivo de dropmaker para encapsular las células en microgels. (B) los microgels son sometidos a una serie de lavados para purificar el ADN genómico bacteriano. Enzimas líticas digestión las paredes celulares de bacterias Gram positivas y levaduras, y detergente solubiliza los desechos celulares. Los microgels son re encapsulados en gotas para la tagmentation reducir la contaminación cruzada. (C) la fusión de microfluidos combina un código de barras digital de PCR, un genoma de microgel tagmented y una mezcla de amplificación a una velocidad &gt; 1 kHz. Off-chip SOE-PCR empalma un código de barras único unicelular en el genoma de tagmented y amplifica selectivamente plenamente construcciones de código de barras. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg"> Figura 3: Dispositivos de microfluidos para la encapsulación de la dropmaking y microgel. (A) este panel muestra un dropmaker de flujo Co (25 μm de altura característica). Células y agarosa fundida se introducen el dispositivo en caudales iguales para producir 25 gotitas de μm en un cruce de μm μm x 25 25. Para la dropmaking de código de barras digital, está conectada la entrada de la célula, y una mezcla PCR se introduce en la entrada de la agarosa. (B) este panel muestra un dispositivo de re-encapsulación microgel (25 μm de altura característica). Las microgels de flujo en un orificio de entrada en forma de embudo para mantener su cerrar-embalado el pedido y recibir un volumen de la mezcla tagmentation antes de la encapsulación en un cruce de μm 25 μm x 30. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg"> Figura 4 : Microfotografías de las gotas y microgels. (A) este panel muestra lavado 25 μm microgels antes de la lisis enzimática. Las bacterias se tiñen fluorescente para la cuantificación de la tasa de encapsulación. Estadísticas de carga de Poisson determinan que las células deben ser encapsulado en una tasa de 1 en 10 gotas o menos para reducir al mínimo la frecuencia de encapsulamiento de múltiples eventos. (B) este panel muestra una imagen de microscopía de fluorescencia de 25 μm gotas de código de barras digital tratada con una tinción de ácido nucleico. Las gotitas que contienen fragmentos de código de barras amplificado producen una señal de fluorescencia fuerte. (C) este panel muestra microgels volver a encapsularse en 50 μm gotas. El cerrar-embalaje de la microgels permite tarifas de encapsulación acercarse a 1 gel por cada gota con pocos dobletes. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg"> Figura 5 : Dispositivo de doble fusión de microfluidos para código de barras sola célula genoma. Una operación de fusión de dos etapas pares de gotas de código de barras con genomas de tagmented con un alto rendimiento. Una gota de la mezcla PCR es primero generada y se fusionó con una gotita de código de barras en la región que se muestra en amarillo utilizando electrodos agua salados. A continuación, una gota que contiene un microgel se introduce y se fusionaron una segunda vez en la región que se muestra en rojo. Entradas de aceite permiten un control preciso de la distancia entre las gotas reinjected. La cámara de reinyección de código de barras y sus separadores de aceite se colocan en la capa más corta de 25 μm, sombreada en azul. Todas las demás características dispositivo pertenecen a la capa más gruesa con 45 μm de altura total. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg"> Figura 6 : Métricas de grupo de código de barras para una comunidad microbiana sintético 10 celular. (A) este panel muestra la distribución del código de barras tamaños de grupo. El número de grupos de un tamaño determinado disminuye exponencialmente como el aumento de tamaño de grupo. Un umbral mínimo de 7,5 kbps por grupo limita el análisis a los grupos con una cantidad suficiente de información y elimina la secuencia mutada de PCR "huérfanos." (B) este panel muestra la distribución de código de barras purezas de grupo. La gran mayoría (&gt; 90%) de los grupos son de muy alta pureza (&gt; 95%). (C) este panel muestra la abundancia relativa de 10 especies calculado a nivel de grupo de lectura y código de barras. 2 contar métodos producen resultados similares, indicando que los tamaños de grupo de código de barras son compatibles entre especies. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg"> Figura 7 : Agregado cobertura genómica de Bacillus subtilis grupos de código de barras. Las lecturas de todos los grupos de código de barras con la bacteria B. subtilis (N = 9.398) son agrupados y analizados en conjunto. Mapa cobertura circular ilustra la uniformidad de la cobertura de la SiC-seq Lee, con las regiones de no deserción observables. Una línea discontinua alrededor de la circunferencia indica la cobertura promedio (5,55 x). El histograma de la inserción de las frecuencias de cobertura relativa muestra que una mayor parte de las bases están cubiertas en una profundidad cerca de la media de todo el genoma, representado por la línea punteada. <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dispositivo de</td>
			<td>1 altura de la capa (μm)</td>
			<td>1 º capa Spin Speed (rpm)</td>
			<td>2 º altura de la capa (μm)</td>
			<td>2 º capa Spin Speed (rpm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dropmaker de flujo de Co</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N / A</td>
			<td>N / A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Re-encapsulador gel</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N / A</td>
			<td>N / A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doble fusión</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: parámetros de fabricación de dispositivos microfluídicos. Esta tabla muestra un listado de los dispositivos de microfluidos en el flujo de trabajo del SiC-seq con sus velocidades requiere de vuelta photoresist capa (basado en las especificaciones del fabricante para SU-8 3025).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Etiqueta</td>
			<td colspan="5">Secuencia (5' &gt; 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Secuencias de la cartilla.
Archivo adicional 1: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo adicional 2: <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Sola célula secuencia revela heterogeneidad genotípica en los sistemas biológicos, pero las tecnologías actuales carecen de la capacidad necesaria para el perfilado profundo de la función y composición de la comunidad. Aquí, describimos un flujo de trabajo de microfluidos para la secuencia > 50.000 genomas unicelulares de diversas poblaciones de la célula.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

El objetivo general de este experimento es generar datos de secuenciación genómica con código de barras a partir de decenas de miles de células individuales utilizando una serie de dispositivos microfluídicos. Este método logra un rendimiento de secuenciación de una sola celda sin precedentes. Utilizamos la microfluídica para encapsular, lisar y codificar células de código de barras individualmente, preservando la heterogeneidad genómica subyacente, que se pierde en el choque convencional en los estudios de secuenciación.La principal ventaja de esta técnica es que es de alto rendimiento y capaz de producir datos de una sola célula a partir de decenas de miles de células. Aunque trabajamos con microbios en esta demostración, el flujo de trabajo se puede adaptar para su uso con diferentes tipos de células a través de pequeñas modificaciones en las dimensiones del dispositivo microfluídico. Para comenzar el protocolo, prepare un mililitro de agarosa de 3%% de peso por volumen a baja temperatura de fusión en tampón 1X Tris-EDTA, o TE.Mantenga la solución de agarosa en un bloque de calor a 90 grados centígrados hasta que se cargue la jeringa. Vuelva a suspender las células en un mililitro de solución salina tamponada con fosfato, o PBS, y centrifuga las células. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender la célula en un mililitro de 17% de volumen a volumen de medio de gradiente de densidad en PBS, y mantenga las células en hielo hasta que se cargue la jeringa.A continuación, cargue una jeringa de tres mililitros con aceite fluorado, o HFE, que contenga un surfactante PFPE-PEG del 2% de peso por peso. Colóquelo con una aguja de calibre 27 y colóquelo en una bomba de jeringa. Cargue la suspensión de celdas y la agarosa fundida en jeringas de un mililitro, ambas con agujas de calibre 27, y colóquelas en bombas de jeringa.Luego, ajuste un calentador de espacio a alto y coloque la superficie de calentamiento a 10 centímetros de la jeringa. Asegúrese de que la temperatura medida en la jeringa sea de aproximadamente 80 grados centígrados. Antes de insertar los tubos en el dispositivo, cebe las bombas para eliminar el aire de la línea.Conecte las agujas de la jeringa a las entradas del dispositivo microfluídico con trozos de tubo de polietileno o PE. Conecte un trozo de tubo a la toma de corriente y coloque el extremo libre en un tubo de recolección de 15 mililitros. Después de la caída en gota, coloque el tubo de recolección a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para asegurar la gelificación completa de la agarosa.Retire la capa inferior de aceite del tubo de recolección con una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 20, teniendo cuidado de no alterar la capa superior de las gotas de agarosa. Agregue un mililitro de 10% de volumen por volumen de PFO en HFE para romper las gotas de agarosa de su capa de surfactante. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo durante un minuto para cubrir completamente las emulsiones, que deben ser homogéneas y libres de grumos.Girar el tubo cónico a 2.000 g durante un minuto para recoger los microgeles de agarosa. Aspire el sobrenadante PFO/HFE y asegúrese de que los microgeles estén libres de su capa de surfactante y sean transparentes. Después de lavar los microgeles, verifique la encapsulación celular en los microgeles bajo un microscopio con un aumento de 400X tiñendo una alícuota de 10 microlitros de geles con tinción de ácido nucleico 1X.Conecte la entrada de las celdas de un dispositivo dropmaker de coflujo con una pequeña pieza de soldadura de plomo. Antes de insertar los tubos en el dispositivo, cebe las bombas para eliminar el aire de la línea. Conecte un trozo de tubo a la toma de corriente y coloque el extremo libre en un tubo de PCR de 0,2 mililitros.Utilice los caudales en la pantalla para la fabricación de gotas. Recoja las gotas en los tubos de PCR con aproximadamente 50 microlitros de gotas en cada tubo. Después de la caída de gotas, retire con cuidado la capa inferior de aceite HFE de las emulsiones con puntas de pipeta con carga de gel y reemplácela con aceite fluorado FC-40 que contenga un surfactante PFPE-PEG del 5 % de peso por peso.A continuación, programe el ciclo térmico. Antes de insertar los tubos en el dispositivo, cebe las bombas para eliminar el aire de la línea. Conecte las jeringas que contienen HFE, mezcla de etiquetado y microgeles a las entradas del dispositivo microfluídico utilizando trozos de tubo de PE.Conecte un trozo de tubo a la salida y coloque el extremo libre en una jeringa vacía de un mililitro con el émbolo dibujado hasta la línea de un mililitro. A continuación, verifique la tasa de encapsulación de microgel bajo un microscopio óptico con un aumento de 400X. Coloque la jeringa que contiene las emulsiones de etiquetado con una aguja e incube en posición vertical en un bloque de calor o en el horno durante una hora a 55 grados centígrados para fragmentar el ADN genómico.Prepare las gotas del código de barras para la fusión reemplazando la fracción de aceite FC-40 con HFE 2%peso por peso PFPE-PEG. Transfiera con cuidado las gotas a una jeringa de un mililitro, colóquela con una aguja y colóquela en una bomba de jeringa. Cargue la jeringa de gotas de microgel incubada y marcada en una bomba de jeringa.A continuación, conecte las tres jeringas de cloruro de sodio a las dos entradas de electrodos y a la entrada de un solo foso utilizando trozos de tubo de PE. Antes de insertar los tubos en el dispositivo, cebe las bombas para eliminar el aire de la línea. Conecte las tres jeringas HFE montadas en bombas a las dos entradas de aceite espaciadoras y a la entrada de aceite de dropmaking usando piezas de tubo de PE.Luego, dispare todos los tubos de reinyección de gotas con una pistola antiestática antes de conectar el tubo a las agujas de la jeringa. Conecte la jeringa de mezcla de PCR, la jeringa de microgel y la jeringa de código de barras a sus respectivas entradas con un tubo de PE. Conecte la aguja de la jeringa del electrodo a un inversor fluorescente de cátodo frío mediante una pinza de cocodrilo.Ajuste la fuente de alimentación de CC del inversor a dos voltios. Ejecute el dispositivo de doble fusión con los caudales recomendados. Recoja las gotas en tubos de PCR con aproximadamente 50 microlitros de emulsión en cada tubo.Antes del ciclo térmico, retire con cuidado la capa inferior de aceite HFE de las emulsiones utilizando puntas de pipeta con carga de gel y reemplácelas con aceite fluorado FC-40 que contenga un surfactante PFPE-PEG del 5% de peso por peso. Luego, programa el ciclo. Para recuperar el ADN de las gotas del ciclo térmico, agrupe las gotas en un tubo de microcentrífuga y rompa las emulsiones con 20 microlitros de PFO.Vórdelos durante 10 segundos para mezclar. Gira el tubo. Retire con cuidado la capa acuosa superior del tubo con una pipeta y transfiérala a un nuevo tubo de microcentrífuga.Deseche la fase oleosa. Luego, finalmente, continúe con los pasos de preparación, secuenciación y análisis de la biblioteca. Un histograma de los recuentos de códigos de barras en comparación con el tamaño del grupo muestra que una parte significativa de los grupos de códigos de barras válidos está justo por encima de los pares de kilobases por tamaño de umbral de grupo, lo que excluye los huérfanos mutados por PCR.La abundancia relativa de los tipos de células de una comunidad sintética de 10 células de tres bacterias gramnegativas, cinco bacterias grampositivas y dos levaduras se calculó contando las lecturas brutas y los grupos de códigos de barras. Un mapa de cobertura circular de las lecturas de B. subtilis de todos los grupos de códigos de barras ilustra la uniformidad de las lecturas de SiC-seq, sin regiones de abandono observables, donde la cobertura promedio fue de 5,55X. La uniformidad de la cobertura se verificó con una distribución de frecuencias de valores de cobertura normalizados.Al intentar este procedimiento, es importante mantener una tasa de encapsulación de alrededor de un código de barras o celda por cada 10 gotas. Esto limita la probabilidad de un evento de encapsulación doble, que puede convolucar los datos de una sola celda. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y operar los dispositivos microfluídicos utilizados para generar datos de secuenciación de una sola célula.Una vez dominada, esta técnica se puede ejecutar en ocho horas o dos días de cuatro horas.

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