Cartografía de la difusión molecular en la membrana plasmática de objetivos múltiples de Búsquedas (MTT)

Hi.In este video presentamos un experimento completo de seguimiento cuántico. Un algoritmo dedicado ha sido concebido íntegramente en colaboración con expertos en imágenes de ISIS. Durante este vídeo, utilizaremos el receptor del factor de crecimiento epidérmico como modelo para describir el método de esta técnica.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico es una proteína transmembrana. Este receptor se marcará utilizando un anticuerpo monoclonal, que se reduce para mantener solo el fragmento A a B. El fragmento A a B es biotinilado, y después de eso, unido a la estreptavidina del punto cuántico, el sistema de pared reconocerá con precisión el receptor EGF.

Nuestro objetivo es proporcionar una visión completa de la dinámica de los receptores de la superficie celular. De hecho, las trayectorias moleculares pueden desviarse de la difusión del brot al estar confinadas dentro de los nanodominios. Por ejemplo, y esto puede ser la firma de una interacción subyacente con, por ejemplo, socios de señalización o andamios moleculares.

Nuestro objetivo es describir dichos eventos de manera exhaustiva mediante el mapeo de la celda, lo que requiere trabajar a una alta resolución temporal SPECT junto con una alta densidad de etiquetado. Por lo tanto, llamamos a este enfoque rastreo de objetivos múltiples. El primer paso del experimento es la preparación de la muestra.

Trabajamos con células vivas sin antibióticos. Aquí utilizamos siete células, que expresan endógenamente receptores de EGF. Después de separar la célula, necesitamos confirmar con precisión para tener el mismo número de células en el pozo h del laboratorio.

Un número preciso de células es muy importante para aumentar la previsibilidad del número de puntos cuánticos por célula Después de dispensar la célula en H, bueno, debe incubar el labato durante 24 horas a 37 grados con 7% de CO2. El siguiente paso es la preparación de puntos cuánticos acoplados a anticuerpos. Los puntos cuánticos son pequeñas nanopartículas fluorescentes.

Estas partículas tienen un gran interés aquí porque son muy brillantes y estables en comparación con la sonda y la señal fluorescentes clásicas. La relación de la nariz es muy importante para este tipo de experimentos. En este caso, usamos medio completo para saturar los ides de tira alrededor de los puntos cuánticos y para evitar la agregación.

Después de eso, teníamos los puntos cuánticos en la proteína bioTE elada o anticuerpos de interés con una proporción de uno a uno para tener puntos cuánticos estadísticamente más monovalentes. En este experimento, utilizamos un fragmento a b contra el receptor de EGF producido en el laboratorio a partir de anticuerpos monoclonales y que se dirigen con biotina. Durante la incubación alrededor de 15 minutos, se puede mantener el control bajo agregación y homogeneidad utilizando un agitador a 1.200 rotación por minuto y dos cinco grados.

Cuando la mezcla esté lista, puedes agregarla en tus celdas. Retire el medio del pocillo con mucha suavidad para evitar el desprendimiento de células en la tecnología de laboratorio y agregue la cantidad necesaria de mezcla para su experimento. En este caso, añadiremos 100 microlitros de mezcla por pocillo.

Después de agregar la mezcla, puede incubar su célula durante 15 minutos. En este caso a 37 grados con un 7% de CO2. Después de esta incubación, es posible que encuentre un gran número de puntos gemelos frecuentes en suspensión en el medio.

Estos puntos cuánticos deben eliminarse antes de la obtención de imágenes. Por el ruido que traemos. Es por eso que necesitamos lavarnos a cada uno, bueno, varias veces en este caso, cinco veces para lavarnos.

Utilice un medio de imagen que no sea de autofluorescencia. Aquí usamos el búfer HBSS con aps. Ahora sus células están listas.

Es hora de ir a la configuración para la adquisición. La configuración se compone de cuatro partes principales, un microscopio invertido, una cámara con sensibilidad ocular, una potente lámpara de mercurio y una incubadora para mantener la célula a 37 grados. La luz de la lámpara de mercurio pasa a través de una fibra y a través de una rueda de filtros antes de iluminar la muestra.

El eSense de la muestra se filtra y se recoge mediante una cámara E-M-C-C-D a la izquierda. Actualmente utilizamos 1.3 y 1.49 de apertura numérica de los objetivos. El paso central de este experimento es la adquisición por sí mismo.

Una vez que las celdas están enfocadas, observamos una representativa con una etiqueta fuerte. En los puntos cuánticos, primero adquirimos una sola imagen en luz blanca transmitida, que se puede utilizar para verificar el aspecto de la celda y el límite especial de los podios LA. A continuación, adquirimos vídeo normalmente a una velocidad de 36 milisegundos, la velocidad más rápida permitida en el fotograma completo.

Utilizamos un CCD multiplicador de electrones para alcanzar la sensibilidad de una sola molécula con una relación señal/norte suficiente al menos por encima de 20 decibelios. Por lo general, alrededor de 25 decibelios, generalmente adquirimos 300 cuadros. Para evaluar un conjunto de datos determinado, solo necesita proporcionar el paso al directorio que contiene los archivos de video.

A continuación, al escribir el comando, el texto se vuelve a conectar en MetLab o el comando MTT 23 I, que primero muestra una lista de la interfaz gráfica. Todos los parámetros utilizados iniciarán el análisis totalmente automatizado. El análisis MTT central se realiza en cada fotograma, invocando tres tareas principales, la primera detección de cada píxel para la presencia o ausencia de una deuda cuántica objetivo.

Luego, para cada detección, estimación de los parámetros relevantes del objetivo, como la posición del píxel, la intensidad de la señal, etc. Última reconexión de los nuevos objetivos. Con los trazos ya construidos sobre los fotogramas anteriores para cada píxel.

Considerando una subregión local, comparamos dos hipótesis de presencia, ya sea de solo ruido o de una señal. Con la función de dispersión de puntos, ModuLite tiene un pico hin. Utilizamos un umbral que garantiza falsas alarmas lo suficientemente bajas con menos de una detección de perus por fotograma para cada objetivo detectado.

A continuación, realizamos un mínimo cuadrado de pies de nutrientes fantasma para estimar la posición, el ancho y la altura del Goshen detectado. Esto proporciona notablemente la posición de la celda picante del tinte, generalmente con una precisión de alrededor de 10 a 20 nanómetros para las relaciones típicas de señal a ruido en picos de alta densidad a menudo pueden ser demasiado cerrados y los picos fuertes pueden dificultar que los más débiles manejen eso. Desinflamamos los picos detectados a partir de la imagen inicial en ejecución.

Una vez más, la detección en el residuo puede normalmente retorcer el 10% de los picos. Llegar a una detección casi exhaustiva es muy fructífero para una reconexión precisa. A continuación, el conjunto de nuevos objetivos se compara con el conjunto de trazas anteriores para esta pupila.

Con el fin de asignar cada traza a un objetivo si es posible, y manejando posibles parpadeos, utilizamos toda la información estadística disponible obtenida de la etapa de detección. Por lo tanto, los objetivos no solo se asignan al seguimiento más cercano. En caso de conflictos, cuando las trazas pueden cruzarse, es decir, las respectivas regiones relevantes de investigación de superposición, consideraremos el valor estadístico de la intensidad, la velocidad, el ancho y el parpadeo tanto para las trazas como para los objetivos.

Esto proporciona la puntuación de reconexión estadísticamente óptima. La estrategia permite evitar, en la medida de lo posible, sesgar la reconexión hacia los vecinos más cercanos, es decir, el movimiento más lento. A continuación, utilizamos una función para evaluar el posible confinamiento transitorio dentro de las trayectorias.

Esta función está inversamente relacionada con la difusión local establecida por Sexton Simpson y colaboradores. La aplicación de un umbral permite definir episodios confinados o no. Al iterar estos trazos generales, finalmente podemos mapear la dinámica de la membrana en términos de confinamiento transitorio, evidencia de desaceleración, y esto se puede representar.

Alternativamente, utilizando los valores binarios o discretos de este índice de confinamiento, de forma predeterminada, MTT realizará automáticamente esas tareas, guardando para cada vídeo, los parámetros de fila para cada pico en un archivo eski, y para investigaciones más avanzadas. Los resultados típicos, como el mapa de trazas en cada celda y los histogramas de los gráficos para los parámetros de interés, las intensidades máximas, la relación señal-ruido, los valores locales deficientes, por lo que este aspecto también se puede adaptar fácilmente a cualquier investigación dedicada. Este video ahora resumirá los resultados típicos obtenidos por MTT.

Una parte sustancial del trabajo reside en la elaboración del algoritmo, que puede necesitar ser adaptado a investigaciones específicas como los modos de sufrimiento del movimiento o las interacciones. Pero ejecutar MTT es muy sencillo. Los usuarios solo deben optimizar algunos parámetros, como los límites de espacio y tiempo.

A la hora de elaborar el MTT, nos propusimos replantear por completo las opciones analíticas utilizadas para cada tarea. Optimizamos el proceso a lo largo de dos ejes desafiantes. En primer lugar, el manejo de altas densidades para obtener la mejor información especial sobre la superficie de la superficie y, en segundo lugar, el manejo de una SNR débil, que normalmente permite trabajar a baja eliminación y confinamiento a alta velocidad, puede interpretarse como la firma de una interacción subyacente.

Los receptores de membrana pueden interactuar con el citoesqueleto de la submembrana o con los dominios prolipídicos, por ejemplo. Tales eventos pueden ser investigados a través de las variaciones de confinamiento en el espacio y el tiempo. Las medidas dinámicas pueden compararse con enfoques complementarios como FRA, F, Cs o el flete.

El código fuente abierto está disponible para la investigación académica. Se puede descargar desde nuestra página web en CML punto univ si una S fr en nuestra página de equipos, que proporciona un enlace para descargar. Los industriales interesados también pueden ponerse en contacto con nosotros.

Nos gustaría agradecer especialmente a los miembros de nuestro equipo y de las instalaciones comunes por el apoyo y las fructíferas discusiones. Este proyecto cuenta con el apoyo financiero del CNRS en c MAA University Pac Region National de La, y Foundation Medical cuenta con el apoyo del controlador de la liga. Gracias por mirar.