Name: Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprende a analizar ARN-ss para estudiar la diapausa fotoperiódica en Aedes albopictus mediante secuenciación de alto rendimiento y procesamiento bioinformático. Este protocolo permite identificar genes diferencialmente expresados sin recursos genómicos previos.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención 5R21AI081041-02 de los Institutos Nacionales de Salud y la Universidad de Georgetown.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se presentan métodos para descubrir los genes expresados ​​diferencialmente debido a fotoperiódicas diapausa inducida en A. albopictus. El protocolo es importante porque combina de forma única cría de mosquitos y técnicas de bioinformática para hacer todos los aspectos experimentales de un programa de fisiología molecular accesible para los usuarios novatos - en particular para los que se centran en la respuesta diapausa photoperiodic. Los métodos existentes, hasta donde sabemos, no proporcionan ...

Los rápidos avances en las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) están proporcionando oportunidades emocionantes para sondear los fundamentos moleculares de una amplia gama de adaptaciones ecológicas genéticamente complejas en una amplia diversidad de organismos no modelo1–3. Este enfoque es extremadamente poderoso porque establece una base para los estudios de genómica funcional y de poblaciones de organismos con una ecología o historia evolutiva especialmente interesante y/o bien descrita, así como de organismos de interés práctico, como plagas agrícolas y vectores de enfermedades. Por lo tanto, las tecnologías NGS están conduciendo a rápidos avances en los campos de la ecología y tienen el potencial de abordar problemas como la comprensión de las bases mecanicistas de las respuestas biológicas al rápido cambio climático contemporáneo4, la propagación de especies invasoras5 y las interacciones huésped-patógeno6,7.
El extraordinario potencial de las tecnologías NGS para abordar cuestiones básicas y aplicadas en ecología y biología evolutiva se debe en parte al hecho de que estos enfoques se pueden aplicar a cualquier organismo a un costo moderado que es factible para la mayoría de los laboratorios de investigación. Además, estos enfoques proporcionan información de todo el genoma sin la necesidad de recursos genéticos a priori, como un chip de microarrays o una secuencia completa del genoma. Sin embargo, para maximizar la productividad de los experimentos de NGS se requiere una cuidadosa consideración del diseño experimental, incluyendo cuestiones como el tiempo de desarrollo y la especificidad tisular del muestreo de ARN. Además, las habilidades técnicas requeridas para analizar las cantidades masivas de datos producidos por estos experimentos, a menudo hasta varios cientos de millones de lecturas de secuencias de ADN, han sido un desafío particular y han limitado la implementación generalizada de los enfoques NGS.
Los recientes estudios de RNA-Seq sobre las bases transcripcionales de la diapausa en el mosquito invasor y médicamente importante Aedes albopictus proporcionan un ejemplo útil de algunos de los protocolos experimentales que se pueden emplear para aplicar con éxito la tecnología NGS para estudiar las bases moleculares de una adaptación ecológica compleja en un organismo no modelo 8-10. A. albopictus es una especie altamente invasora que es originaria de Asia, pero recientemente ha invadido América del Norte, América del Sur, Europa y África11,12. Al igual que muchos insectos templados, las poblaciones templadas de A. albopictus sobreviven durante el invierno entrando en un tipo de latencia conocida como diapausa fotoperiódica. En A. albopictus, la exposición de las hembras pupales y adultas a días cortos (otoñales) conduce a la producción de huevos en diapausa en los que se completa el desarrollo embriológico, pero la larva de farato dentro del corion del huevo entra en una detención del desarrollo que hace que el huevo sea refractario al estímulo de eclosión15-17. Los huevos con diapausa son más resistentes a la desecación5,18 y contienen más lípidos totales19 que los huevos sin diapausa. La diapausa fotoperiódica en A. albopictus es, por lo tanto, una plasticidad fenotípica adaptativa controlada por la madre que es esencial para sobrevivir a las duras condiciones del invierno en ambientes templados. A pesar de la importancia ecológica bien entendida de la diapausa fotoperiódica en una amplia gama de insectos20,21, la base molecular de esta adaptación crucial no está bien caracterizada en ningún insecto22. En organismos como A. albopictus que experimentan una diapausa embrionaria en la etapa larvaria de famarato, sigue siendo un desafío particularmente apremiante comprender cómo la señal fotoperiódica recibida por la madre se transmite a la descendencia y persiste a lo largo del curso del desarrollo embrionario para causar la detención en la etapa larvaria de famarato.
Este protocolo describe la cría de mosquitos, el diseño experimental y los análisis bioinformáticos para los experimentos de NGS (secuenciación del transcriptoma) realizados para dilucidar los componentes transcripcionales de la diapausa fotoperiódica en A. albopictus. Este protocolo se puede utilizar para estudios adicionales de diapausa en A. albopictus, se puede adaptar para investigar la diapausa en otras especies estrechamente relacionadas, como otros mosquitos aedine que experimentan diapausa en huevos23, y también es más relevante en general para emplear enfoques de NGS para estudiar las bases transcripcionales de cualquier adaptación compleja en cualquier insecto.

<table><tbody><tr><td>Incubadora - Modelo 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>Sala de ambiente controlado</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Sala de ambiente controlado construida según especificaciones personalizadas por Thermax Scientific Products. Una alternativa más grande a una incubadora. http://thermmax.com/</td></tr> <tr><td>Cool Bombilla fluorescente</td><td>Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro 20,5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de 9,5 L Plastican</td><td></td><td>Bway Productos</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>Utility Tela-Mosquitera blanca</td><td>Joann</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>Medias ortopédicas</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>N.º de producto 081420</td></tr><tr><td>Pasas orgánicas</td><td>Newman's Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>Copas de oviposición (marrón)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>El producto es en realidad una botella ámbar de 125 ml de la que vimos la tapa.</td></tr><tr><td>Toallas de papel recicladas</td> de <td>séptima generación</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>Modular Mates Square Tupperware Set</td><td>Tupperware</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td>Molinillo de vidrio</td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>Estos molinillos de papel tisú Tenbroeck rompen los huevos y liberan ARN en el reactivo TRI.</td></tr><tr><td>Reactivo TRI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>Aplicar 1 ml de Reactivo TRI por cada 50-100 mg de tejido. Precaución &#8212; Este reactivo es tóxico.</td></tr><tr><td>TURBO Libre de ADN</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>Este kit genera un mayor rendimiento que el tratamiento tradicional con DNasa seguido de limpieza con fenol/cloroformo, y es más fácil de usar.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>Aplicar generosamente sobre las superficies del banco y cualquier equipo que pueda estar en contacto con las muestras de ARN. La solución es ligeramente alcalina/corrosiva, puede causar irritación y es dañina cuando se ingiere.</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Coloque hasta 12 muestras de ARN en un chip.</td></tr><tr><td>Alimentador de membrana Hemotek</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>5W1</td><td>Este sistema proporciona 5 estaciones de alimentación que se pueden utilizar simultáneamente. Incluye unidad de alimentación PS5 y cable de alimentación; 5 alimentadores FUI + depósitos de harina y juntas tóricas; Tapones de plástico, membrana de alimentación de colágeno Hemotek; Herramienta de ajuste de temperatura; y Herramienta de extracción de tapones. La dirección postal de la empresa es: Hemotek Ltd; Unidad 5 Tribunal de la Unión; Alan Ramsbottom Way; Gran Harwood; Lancashire, Reino Unido; BB6 7FD; Tel: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>Termómetro digital y sonda</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>MT3KFU</td><td>Termómetro MicroT3 y sonda KFU. Se utiliza para ajustar la temperatura de cada unidad de alimentación FU</td></tr>.<tr><td>Sangre entera de pollo, no estéril con citrato de sodio</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td><td>Los 500 ml de sangre se congelaron y almacenaron en alícuotas de 20 ml a -80 &#176; C hasta por 1 año. Descongele la sangre a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de usarla.</td></tr></tbody></table>

un experimental y protocolo bioinformática para análisis de arn-ss de fotoperiódica diapausa en el mosquito tigre asiático, aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

La diapausa fotoperiódica es una adaptación importante que permite a los individuos escapar de los duros entornos estacionales a través de una serie de cambios fisiológicos, entre los que destacan la detención del desarrollo y la reducción del metabolismo. El perfil global de expresión génica a través de RNA-Seq puede proporcionar información importante sobre los mecanismos transcripcionales de la diapausa fotoperiódica. El mosquito tigre asiático, Aedes albopictus, es un organismo destacado para el estudio de las bases transcripcionales de la diapausa debido a su facilidad de crianza, diapausa fácilmente inducida y los recursos genómicos disponibles. Este manuscrito presenta un flujo de trabajo experimental general para identificar las diferencias transcripcionales inducidas por diapausa en A. albopictus. Se documentan las técnicas de cría, las condiciones necesarias para inducir el desarrollo de diapausa y no diapausa, los métodos para estimar el porcentaje de diapausa en una población, la extracción de ARN y la evaluación de la integridad de los mosquitos. Un flujo de trabajo para procesar datos de RNA-Seq de los secuenciadores Illumina culmina en una lista de genes expresados diferencialmente. Los resultados representativos demuestran que este protocolo puede ser utilizado para identificar de manera efectiva genes regulados diferencialmente a nivel transcripcional en A. albopictus debido a diferencias fotoperiódicas. Con ajustes modestos, este flujo de trabajo se puede adaptar fácilmente para estudiar las bases transcripcionales de la diapausa u otros rasgos importantes de la historia de vida en otros mosquitos.

Fluorometría de dos muestras de ARN representativos mostró dos bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). El 28S ribosomal RNA de insectos se compone de dos cadenas de polinucleótidos se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno, que son fácilmente interrumpido por calentamiento o agentes que interrumpen los enlaces de hidrógeno 35 breve. Los dos componentes resultantes son aproximadamente el mismo tamaño que el ARN ribosomal 18S. La segunda muestra de ARN mostró altos niveles de degrad...

Los análisis de RNA-Seq son cada vez más importantes para identificar los fundamentos moleculares de los rasgos adaptativos en organismos no modelo. Aquí, se describe un protocolo para identificar genes expresados diferencialmente entre mosquitos Aedes albopictus en diapausa y no diapausa, desde la cría de mosquitos, hasta la secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos de datos de RNA-Seq.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar los componentes transcripcionales de la respuesta de diapausa fotoperiódica. En un pictus de codo de mosquitos ochentero no modelo, esto se logra produciendo primero muestras biológicamente replicadas de huevos con diapausa y sin diapausa a través de diferentes tratamientos fotoperiódicos. Como segundo paso, el ARN se extrae de cada réplica para la secuenciación de ARN de alto rendimiento.A continuación, las secuencias de ARN se procesan computacionalmente para ensamblarlas en congs y anotarlas. En última instancia, las variaciones en la expresión génica en respuesta a los fotoperíodos que inducen la diapausa frente a los que no la inducen se pueden inferir del MAP de Reeds al ensamblaje de ARN. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de microrrayos, es que no se requieren recursos genéticos previos, como la secuencia del genoma o un microarray, para obtener estimaciones globales de la expresión génica en respuesta a condiciones de diapausa.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica ecológica, como cuál es la base transcripcional de los DPO u otras adaptaciones ecológicas clave en organismos no modelo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que puede ser difícil obtener cantidades suficientes de óvulos de diapausa y no DPOs, y el análisis bioinformático posterior puede ser un desafío. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que las tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento eran cada vez más asequibles y ofrecían un método manejable para obtener perfiles de expresión del genoma completo en organismos no modelo antes de comenzar el procedimiento.Configure dos cabinas de fotoperiodo con iluminación programable a 21 grados centígrados para una expresión óptima de la diapausa y aproximadamente un 80% de humedad relativa Programe una cabina para un fotoperiodo que no induzca la diapausa con un ciclo de oscuridad de 16 ocho luces y el otro para un ciclo de oscuridad de ocho 16 luces que induce una diapausa con las luces encendidas al mismo tiempo para que ambas cabinas sincronicen el tiempo circadiano entre los fotoperiodos. A continuación, sumerja los papeles de huevo para obtener el número adecuado de huevos en 500 mililitros de agua desionizada y agregue un mililitro de comida molida para perros y lechada de comida de camarones en salmuera. Cubra el recipiente con una malla colocando una banda elástica alrededor de la malla para mantenerla en su lugar.A continuación, incube los huevos en el armario de fotoperiodo de 16 ocho luces oscuras de día largo durante unas 24 horas. Al día siguiente, transfiera unas 30 larvas eclosionadas por grupo a placas de Petri individuales de 10 por 10 por dos centímetros llenas de 90 mililitros de agua desionizada. Cada 48 a 72 horas, transfiera las larvas a un plato limpio, alimentándolas con lechada de alimentos frescos en cada transferencia.Después de unos seis días, cubra el fondo de tres o cuatro jaulas de adultos para cada tratamiento fotomenstrual con papel de filtro húmedo y humedezca el papel de filtro con suficiente agua desionizada para aumentar la humedad local en la jaula y evitar el agua estancada. Anote el período de la foto, el número replicado, la fecha de inicio de la jaula y otra información relevante para el experimento con marcador permanente en el costado de la jaula. Luego, cada dos días durante 10 días, transfiera el puy a tazas pequeñas de agua limpia a no más de 50 puy por 25 mililitros de agua a las jaulas adultas apropiadas para el experimento y coloque pasas orgánicas en la malla superior de la jaula para proporcionar azúcar a los adultos emergidos. Para estimular la posición de los óvulos cuatro o cinco días después de la primera ingesta de sangre, Llene tazas de 50 mililitros de color oscuro forradas con una toalla de papel texturizada no blanqueada hasta la mitad con agua desionizada y coloque una taza en cada jaula para recolectar y almacenar los huevos.Reemplace los papeles de huevo en cada jaula con papel nuevo, colocando los papeles recién retirados en placas de Petri y almacenándolos en el gabinete de ocho fotoperiodos de 16 días oscuros claros para evitar efectos de confusión en el almacenamiento de huevos. Aproximadamente 48 horas después de la recolección, seque los papeles de huevo al aire libre de manera que estén flácidos y ligeramente húmedos al tacto, pero no tanto como para que los papeles se oscurezcan por el agua o estimulen la eclosión. Para medir los incidentes de diapausa, registre el número de huevos en cada papel de huevo.A continuación, sumerja completamente los papeles individuales en una placa de Petri de 90 mililitros con aproximadamente 80 mililitros de agua desionizada. Para estimular su eclosión, agregue aproximadamente 0,25 mililitros de lechada de comida y luego, después de 24 horas, transfiera la placa de Petri a una superficie negra. Ahora coloque una fuente de luz en un lado de la, las larvas se alejarán de la luz, lo que permitirá un recuento claro del individuo primero en las larvas estrella.Use una pipeta para eliminar cada larva después del conteo para evitar que se vuelvan a contar los individuos. Luego coloque los papeles de huevo en una nueva placa de Petri para que se sequen al rojo. Después de contar un segundo lote de crías una semana después, coloque los papeles de huevo con los huevos restantes sin eclosionar en nuevas placas de Petri de 90 mililitros con aproximadamente 80 mililitros de solución blanqueadora fresca, teniendo cuidado de que los papeles estén completamente sumergidos en la solución blanqueadora.Deje los papeles debajo de una campana extractora durante la noche y luego, al día siguiente, use un microscopio óptico para contar la cantidad de huevos sin eclosionar. Si un huevo está embrionado, exhibirá un color blanquecino con los ojos apareciendo como dos pequeños puntos negros opuestos entre sí en el lado dorsal. Para comenzar, limpie cuidadosamente el banco con una solución de descontaminación de ARN para eliminar las nucleasas residuales y evitar la degradación del ARN.A continuación, use un cepillo de pelo de camello para cepillar al menos 400 huevos de mosquitos que contengan embriones en desarrollo en el momento del desarrollo. Punto de interés en molinillos de vidrio. En una campana extractora, agregue un mililitro de triol y muela los huevos hasta que estén completamente pulverizados, y luego realice la extracción de ARN en triol, seguida de la precipitación de isopropanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Ahora use hasta un microlitro de D ns por hasta 10 microgramos de ARN en 50 microlitros de reacción durante 30 minutos a 37 grados Celsius de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, incube la reacción en cinco microlitros de reactivo de inactivación de ADN en suspensión durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vórtice suavemente la suspensión tres veces durante el período de incubación.A continuación, centrifugar los extractos de ARN durante 1,5 minutos a 10.000 veces G y Eloqua, los sobrenadantes que contienen ARN, en tubos frescos para su secuenciación. Por último, consulte el texto adjunto para obtener más información sobre cómo procesar los datos de secuenciación de próxima generación resultantes, desde la lectura, la preparación, el ensamblado y la anotación hasta el análisis de expresiones diferenciales. En esta primera figura, la fluorometría de dos muestras representativas de ARN muestra dos bandas a aproximadamente 2000 nucleótidos.El ARN ribosómico del insecto 28 está compuesto por dos cadenas de polinucleótidos unidas por enlaces de hidrógeno que se rompen fácilmente por un calentamiento breve o agentes que rompen los enlaces de hidrógeno. Los dos componentes resultantes son aproximadamente del mismo tamaño que un ARN ribosómico de 18 s en la segunda muestra de ARN, se pueden observar altos niveles de degradación en este experimento representativo. El tratamiento fotoperiódico de un grupo representativo de mosquitos albopictus resultó en una alta incidencia de diapausa en los mosquitos criados durante días cortos y una baja incidencia de diapausa en los mosquitos criados durante días largos.Aunque hubo alguna variación entre las réplicas, por ejemplo, el grupo del día dos corto exhibió una incidencia de diapausa más baja que las otras réplicas. Un ensamblaje Trinity de lecturas normalizadas digitalmente dio como resultado 76.377 contigs con una longitud media de conig de 1020 3,1 y una longitud máxima de Conti de 20.892. Tenga en cuenta que la distribución de las longitudes de Conti está muy sesgada hacia contigs más cortos.Esto es típico del ensamblaje del transcriptoma de Denovo. En este gráfico final, los análisis de expresión diferencial de un flujo de trabajo similar de embriones criados en condiciones inductoras de diapausa a los 11 y 21 días después de la posición de los óvulos revelan 3.128 genes expresados diferencialmente entre estos dos períodos de tiempo. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis a ocho meses desde la generación de tejidos hasta el análisis informático divino si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el éxito en cada paso debe verificarse antes de pasar al siguiente paso. Por ejemplo, confirme que las condiciones experimentales han producido DPAs y óvulos no diapausados antes de probar la integridad del ARN siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis cuantitativo R-T-P-C-R o el análisis genómico comparativo, para responder a preguntas adicionales sobre la expresión específica del tejido o el desarrollo de los genes de interés y/o los procesos de evolución molecular.No olvide que trabajar con triol puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, una bata de laboratorio y una campana extractora mientras se realiza este procedimiento.

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Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus (Video) | JoVE Journal

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