Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

El objetivo general del siguiente experimento es identificar los componentes transcripcionales de la respuesta de diapausa fotoperiódica. En un pictus de codo de mosquitos ochentero no modelo, esto se logra produciendo primero muestras biológicamente replicadas de huevos con diapausa y sin diapausa a través de diferentes tratamientos fotoperiódicos. Como segundo paso, el ARN se extrae de cada réplica para la secuenciación de ARN de alto rendimiento.

A continuación, las secuencias de ARN se procesan computacionalmente para ensamblarlas en congs y anotarlas. En última instancia, las variaciones en la expresión génica en respuesta a los fotoperíodos que inducen la diapausa frente a los que no la inducen se pueden inferir del MAP de Reeds al ensamblaje de ARN. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de microrrayos, es que no se requieren recursos genéticos previos, como la secuencia del genoma o un microarray, para obtener estimaciones globales de la expresión génica en respuesta a condiciones de diapausa.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica ecológica, como cuál es la base transcripcional de los DPO u otras adaptaciones ecológicas clave en organismos no modelo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que puede ser difícil obtener cantidades suficientes de óvulos de diapausa y no DPOs, y el análisis bioinformático posterior puede ser un desafío. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que las tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento eran cada vez más asequibles y ofrecían un método manejable para obtener perfiles de expresión del genoma completo en organismos no modelo antes de comenzar el procedimiento.

Configure dos cabinas de fotoperiodo con iluminación programable a 21 grados centígrados para una expresión óptima de la diapausa y aproximadamente un 80% de humedad relativa Programe una cabina para un fotoperiodo que no induzca la diapausa con un ciclo de oscuridad de 16 ocho luces y el otro para un ciclo de oscuridad de ocho 16 luces que induce una diapausa con las luces encendidas al mismo tiempo para que ambas cabinas sincronicen el tiempo circadiano entre los fotoperiodos. A continuación, sumerja los papeles de huevo para obtener el número adecuado de huevos en 500 mililitros de agua desionizada y agregue un mililitro de comida molida para perros y lechada de comida de camarones en salmuera. Cubra el recipiente con una malla colocando una banda elástica alrededor de la malla para mantenerla en su lugar.

A continuación, incube los huevos en el armario de fotoperiodo de 16 ocho luces oscuras de día largo durante unas 24 horas. Al día siguiente, transfiera unas 30 larvas eclosionadas por grupo a placas de Petri individuales de 10 por 10 por dos centímetros llenas de 90 mililitros de agua desionizada. Cada 48 a 72 horas, transfiera las larvas a un plato limpio, alimentándolas con lechada de alimentos frescos en cada transferencia.

Después de unos seis días, cubra el fondo de tres o cuatro jaulas de adultos para cada tratamiento fotomenstrual con papel de filtro húmedo y humedezca el papel de filtro con suficiente agua desionizada para aumentar la humedad local en la jaula y evitar el agua estancada. Anote el período de la foto, el número replicado, la fecha de inicio de la jaula y otra información relevante para el experimento con marcador permanente en el costado de la jaula. Luego, cada dos días durante 10 días, transfiera el puy a tazas pequeñas de agua limpia a no más de 50 puy por 25 mililitros de agua a las jaulas adultas apropiadas para el experimento y coloque pasas orgánicas en la malla superior de la jaula para proporcionar azúcar a los adultos emergidos. Para estimular la posición de los óvulos cuatro o cinco días después de la primera ingesta de sangre, Llene tazas de 50 mililitros de color oscuro forradas con una toalla de papel texturizada no blanqueada hasta la mitad con agua desionizada y coloque una taza en cada jaula para recolectar y almacenar los huevos.

Reemplace los papeles de huevo en cada jaula con papel nuevo, colocando los papeles recién retirados en placas de Petri y almacenándolos en el gabinete de ocho fotoperiodos de 16 días oscuros claros para evitar efectos de confusión en el almacenamiento de huevos. Aproximadamente 48 horas después de la recolección, seque los papeles de huevo al aire libre de manera que estén flácidos y ligeramente húmedos al tacto, pero no tanto como para que los papeles se oscurezcan por el agua o estimulen la eclosión. Para medir los incidentes de diapausa, registre el número de huevos en cada papel de huevo.

A continuación, sumerja completamente los papeles individuales en una placa de Petri de 90 mililitros con aproximadamente 80 mililitros de agua desionizada. Para estimular su eclosión, agregue aproximadamente 0,25 mililitros de lechada de comida y luego, después de 24 horas, transfiera la placa de Petri a una superficie negra. Ahora coloque una fuente de luz en un lado de la, las larvas se alejarán de la luz, lo que permitirá un recuento claro del individuo primero en las larvas estrella.

Use una pipeta para eliminar cada larva después del conteo para evitar que se vuelvan a contar los individuos. Luego coloque los papeles de huevo en una nueva placa de Petri para que se sequen al rojo. Después de contar un segundo lote de crías una semana después, coloque los papeles de huevo con los huevos restantes sin eclosionar en nuevas placas de Petri de 90 mililitros con aproximadamente 80 mililitros de solución blanqueadora fresca, teniendo cuidado de que los papeles estén completamente sumergidos en la solución blanqueadora.

Deje los papeles debajo de una campana extractora durante la noche y luego, al día siguiente, use un microscopio óptico para contar la cantidad de huevos sin eclosionar. Si un huevo está embrionado, exhibirá un color blanquecino con los ojos apareciendo como dos pequeños puntos negros opuestos entre sí en el lado dorsal. Para comenzar, limpie cuidadosamente el banco con una solución de descontaminación de ARN para eliminar las nucleasas residuales y evitar la degradación del ARN.

A continuación, use un cepillo de pelo de camello para cepillar al menos 400 huevos de mosquitos que contengan embriones en desarrollo en el momento del desarrollo. Punto de interés en molinillos de vidrio. En una campana extractora, agregue un mililitro de triol y muela los huevos hasta que estén completamente pulverizados, y luego realice la extracción de ARN en triol, seguida de la precipitación de isopropanol de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ahora use hasta un microlitro de D ns por hasta 10 microgramos de ARN en 50 microlitros de reacción durante 30 minutos a 37 grados Celsius de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, incube la reacción en cinco microlitros de reactivo de inactivación de ADN en suspensión durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vórtice suavemente la suspensión tres veces durante el período de incubación.

A continuación, centrifugar los extractos de ARN durante 1,5 minutos a 10.000 veces G y Eloqua, los sobrenadantes que contienen ARN, en tubos frescos para su secuenciación. Por último, consulte el texto adjunto para obtener más información sobre cómo procesar los datos de secuenciación de próxima generación resultantes, desde la lectura, la preparación, el ensamblado y la anotación hasta el análisis de expresiones diferenciales. En esta primera figura, la fluorometría de dos muestras representativas de ARN muestra dos bandas a aproximadamente 2000 nucleótidos.

El ARN ribosómico del insecto 28 está compuesto por dos cadenas de polinucleótidos unidas por enlaces de hidrógeno que se rompen fácilmente por un calentamiento breve o agentes que rompen los enlaces de hidrógeno. Los dos componentes resultantes son aproximadamente del mismo tamaño que un ARN ribosómico de 18 s en la segunda muestra de ARN, se pueden observar altos niveles de degradación en este experimento representativo. El tratamiento fotoperiódico de un grupo representativo de mosquitos albopictus resultó en una alta incidencia de diapausa en los mosquitos criados durante días cortos y una baja incidencia de diapausa en los mosquitos criados durante días largos.

Aunque hubo alguna variación entre las réplicas, por ejemplo, el grupo del día dos corto exhibió una incidencia de diapausa más baja que las otras réplicas. Un ensamblaje Trinity de lecturas normalizadas digitalmente dio como resultado 76.377 contigs con una longitud media de conig de 1020 3,1 y una longitud máxima de Conti de 20.892. Tenga en cuenta que la distribución de las longitudes de Conti está muy sesgada hacia contigs más cortos.

Esto es típico del ensamblaje del transcriptoma de Denovo. En este gráfico final, los análisis de expresión diferencial de un flujo de trabajo similar de embriones criados en condiciones inductoras de diapausa a los 11 y 21 días después de la posición de los óvulos revelan 3.128 genes expresados diferencialmente entre estos dos períodos de tiempo. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis a ocho meses desde la generación de tejidos hasta el análisis informático divino si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el éxito en cada paso debe verificarse antes de pasar al siguiente paso. Por ejemplo, confirme que las condiciones experimentales han producido DPAs y óvulos no diapausados antes de probar la integridad del ARN siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis cuantitativo R-T-P-C-R o el análisis genómico comparativo, para responder a preguntas adicionales sobre la expresión específica del tejido o el desarrollo de los genes de interés y/o los procesos de evolución molecular.

No olvide que trabajar con triol puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, una bata de laboratorio y una campana extractora mientras se realiza este procedimiento.