Name: Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprende a analizar ARN-ss para estudiar la diapausa fotoperiódica en Aedes albopictus mediante secuenciación de alto rendimiento y procesamiento bioinformático. Este protocolo permite identificar genes diferencialmente expresados sin recursos genómicos previos.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención 5R21AI081041-02 de los Institutos Nacionales de Salud y la Universidad de Georgetown.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se presentan métodos para descubrir los genes expresados ​​diferencialmente debido a fotoperiódicas diapausa inducida en A. albopictus. El protocolo es importante porque combina de forma única cría de mosquitos y técnicas de bioinformática para hacer todos los aspectos experimentales de un programa de fisiología molecular accesible para los usuarios novatos - en particular para los que se centran en la respuesta diapausa photoperiodic. Los métodos existentes, hasta donde sabemos, no proporcionan ...

Los rápidos avances en las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) están proporcionando oportunidades emocionantes para sondear los fundamentos moleculares de una amplia gama de adaptaciones ecológicas genéticamente complejas en una amplia diversidad de organismos no modelo1–3. Este enfoque es extremadamente poderoso porque establece una base para los estudios de genómica funcional y de poblaciones de organismos con una ecología o historia evolutiva especialmente interesante y/o bien descrita, así como de organismos de interés práctico, como plagas agrícolas y vectores de enfermedades. Por lo tanto, las tecnologías NGS están conduciendo a rápidos avances en los campos de la ecología y tienen el potencial de abordar problemas como la comprensión de las bases mecanicistas de las respuestas biológicas al rápido cambio climático contemporáneo4, la propagación de especies invasoras5 y las interacciones huésped-patógeno6,7.
El extraordinario potencial de las tecnologías NGS para abordar cuestiones básicas y aplicadas en ecología y biología evolutiva se debe en parte al hecho de que estos enfoques se pueden aplicar a cualquier organismo a un costo moderado que es factible para la mayoría de los laboratorios de investigación. Además, estos enfoques proporcionan información de todo el genoma sin la necesidad de recursos genéticos a priori, como un chip de microarrays o una secuencia completa del genoma. Sin embargo, para maximizar la productividad de los experimentos de NGS se requiere una cuidadosa consideración del diseño experimental, incluyendo cuestiones como el tiempo de desarrollo y la especificidad tisular del muestreo de ARN. Además, las habilidades técnicas requeridas para analizar las cantidades masivas de datos producidos por estos experimentos, a menudo hasta varios cientos de millones de lecturas de secuencias de ADN, han sido un desafío particular y han limitado la implementación generalizada de los enfoques NGS.
Los recientes estudios de RNA-Seq sobre las bases transcripcionales de la diapausa en el mosquito invasor y médicamente importante Aedes albopictus proporcionan un ejemplo útil de algunos de los protocolos experimentales que se pueden emplear para aplicar con éxito la tecnología NGS para estudiar las bases moleculares de una adaptación ecológica compleja en un organismo no modelo 8-10. A. albopictus es una especie altamente invasora que es originaria de Asia, pero recientemente ha invadido América del Norte, América del Sur, Europa y África11,12. Al igual que muchos insectos templados, las poblaciones templadas de A. albopictus sobreviven durante el invierno entrando en un tipo de latencia conocida como diapausa fotoperiódica. En A. albopictus, la exposición de las hembras pupales y adultas a días cortos (otoñales) conduce a la producción de huevos en diapausa en los que se completa el desarrollo embriológico, pero la larva de farato dentro del corion del huevo entra en una detención del desarrollo que hace que el huevo sea refractario al estímulo de eclosión15-17. Los huevos con diapausa son más resistentes a la desecación5,18 y contienen más lípidos totales19 que los huevos sin diapausa. La diapausa fotoperiódica en A. albopictus es, por lo tanto, una plasticidad fenotípica adaptativa controlada por la madre que es esencial para sobrevivir a las duras condiciones del invierno en ambientes templados. A pesar de la importancia ecológica bien entendida de la diapausa fotoperiódica en una amplia gama de insectos20,21, la base molecular de esta adaptación crucial no está bien caracterizada en ningún insecto22. En organismos como A. albopictus que experimentan una diapausa embrionaria en la etapa larvaria de famarato, sigue siendo un desafío particularmente apremiante comprender cómo la señal fotoperiódica recibida por la madre se transmite a la descendencia y persiste a lo largo del curso del desarrollo embrionario para causar la detención en la etapa larvaria de famarato.
Este protocolo describe la cría de mosquitos, el diseño experimental y los análisis bioinformáticos para los experimentos de NGS (secuenciación del transcriptoma) realizados para dilucidar los componentes transcripcionales de la diapausa fotoperiódica en A. albopictus. Este protocolo se puede utilizar para estudios adicionales de diapausa en A. albopictus, se puede adaptar para investigar la diapausa en otras especies estrechamente relacionadas, como otros mosquitos aedine que experimentan diapausa en huevos23, y también es más relevante en general para emplear enfoques de NGS para estudiar las bases transcripcionales de cualquier adaptación compleja en cualquier insecto.

<table><tbody><tr><td>Incubadora - Modelo 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>Sala de ambiente controlado</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Sala de ambiente controlado construida según especificaciones personalizadas por Thermax Scientific Products. Una alternativa más grande a una incubadora. http://thermmax.com/</td></tr> <tr><td>Cool Bombilla fluorescente</td><td>Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro 20,5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de 9,5 L Plastican</td><td></td><td>Bway Productos</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>Utility Tela-Mosquitera blanca</td><td>Joann</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>Medias ortopédicas</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>N.º de producto 081420</td></tr><tr><td>Pasas orgánicas</td><td>Newman's Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>Copas de oviposición (marrón)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>El producto es en realidad una botella ámbar de 125 ml de la que vimos la tapa.</td></tr><tr><td>Toallas de papel recicladas</td> de <td>séptima generación</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>Modular Mates Square Tupperware Set</td><td>Tupperware</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td>Molinillo de vidrio</td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>Estos molinillos de papel tisú Tenbroeck rompen los huevos y liberan ARN en el reactivo TRI.</td></tr><tr><td>Reactivo TRI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>Aplicar 1 ml de Reactivo TRI por cada 50-100 mg de tejido. Precaución &#8212; Este reactivo es tóxico.</td></tr><tr><td>TURBO Libre de ADN</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>Este kit genera un mayor rendimiento que el tratamiento tradicional con DNasa seguido de limpieza con fenol/cloroformo, y es más fácil de usar.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>Aplicar generosamente sobre las superficies del banco y cualquier equipo que pueda estar en contacto con las muestras de ARN. La solución es ligeramente alcalina/corrosiva, puede causar irritación y es dañina cuando se ingiere.</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Coloque hasta 12 muestras de ARN en un chip.</td></tr><tr><td>Alimentador de membrana Hemotek</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>5W1</td><td>Este sistema proporciona 5 estaciones de alimentación que se pueden utilizar simultáneamente. Incluye unidad de alimentación PS5 y cable de alimentación; 5 alimentadores FUI + depósitos de harina y juntas tóricas; Tapones de plástico, membrana de alimentación de colágeno Hemotek; Herramienta de ajuste de temperatura; y Herramienta de extracción de tapones. La dirección postal de la empresa es: Hemotek Ltd; Unidad 5 Tribunal de la Unión; Alan Ramsbottom Way; Gran Harwood; Lancashire, Reino Unido; BB6 7FD; Tel: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>Termómetro digital y sonda</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>MT3KFU</td><td>Termómetro MicroT3 y sonda KFU. Se utiliza para ajustar la temperatura de cada unidad de alimentación FU</td></tr>.<tr><td>Sangre entera de pollo, no estéril con citrato de sodio</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td><td>Los 500 ml de sangre se congelaron y almacenaron en alícuotas de 20 ml a -80 &#176; C hasta por 1 año. Descongele la sangre a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de usarla.</td></tr></tbody></table>

un experimental y protocolo bioinformática para análisis de arn-ss de fotoperiódica diapausa en el mosquito tigre asiático, aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

La diapausa fotoperiódica es una adaptación importante que permite a los individuos escapar de los duros entornos estacionales a través de una serie de cambios fisiológicos, entre los que destacan la detención del desarrollo y la reducción del metabolismo. El perfil global de expresión génica a través de RNA-Seq puede proporcionar información importante sobre los mecanismos transcripcionales de la diapausa fotoperiódica. El mosquito tigre asiático, Aedes albopictus, es un organismo destacado para el estudio de las bases transcripcionales de la diapausa debido a su facilidad de crianza, diapausa fácilmente inducida y los recursos genómicos disponibles. Este manuscrito presenta un flujo de trabajo experimental general para identificar las diferencias transcripcionales inducidas por diapausa en A. albopictus. Se documentan las técnicas de cría, las condiciones necesarias para inducir el desarrollo de diapausa y no diapausa, los métodos para estimar el porcentaje de diapausa en una población, la extracción de ARN y la evaluación de la integridad de los mosquitos. Un flujo de trabajo para procesar datos de RNA-Seq de los secuenciadores Illumina culmina en una lista de genes expresados diferencialmente. Los resultados representativos demuestran que este protocolo puede ser utilizado para identificar de manera efectiva genes regulados diferencialmente a nivel transcripcional en A. albopictus debido a diferencias fotoperiódicas. Con ajustes modestos, este flujo de trabajo se puede adaptar fácilmente para estudiar las bases transcripcionales de la diapausa u otros rasgos importantes de la historia de vida en otros mosquitos.

Fluorometría de dos muestras de ARN representativos mostró dos bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). El 28S ribosomal RNA de insectos se compone de dos cadenas de polinucleótidos se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno, que son fácilmente interrumpido por calentamiento o agentes que interrumpen los enlaces de hidrógeno 35 breve. Los dos componentes resultantes son aproximadamente el mismo tamaño que el ARN ribosomal 18S. La segunda muestra de ARN mostró altos niveles de degrad...

Los análisis de RNA-Seq son cada vez más importantes para identificar los fundamentos moleculares de los rasgos adaptativos en organismos no modelo. Aquí, se describe un protocolo para identificar genes expresados diferencialmente entre mosquitos Aedes albopictus en diapausa y no diapausa, desde la cría de mosquitos, hasta la secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos de datos de RNA-Seq.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar los componentes transcripcionales de la respuesta de diapausa fotoperiódica. En un pictus de codo de mosquitos ochentero no modelo, esto se logra produciendo primero muestras biológicamente replicadas de huevos con diapausa y sin diapausa a través de diferentes tratamientos fotoperiódicos. Como segundo paso, el ARN se extrae de cada réplica para la secuenciación de ARN de alto rendimiento.A continuación, las secuencias de ARN se procesan computacionalmente para ensamblarlas en congs y anotarlas. En última instancia, las variaciones en la expresión génica en respuesta a los fotoperíodos que inducen la diapausa frente a los que no la inducen se pueden inferir del MAP de Reeds al ensamblaje de ARN. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de microrrayos, es que no se requieren recursos genéticos previos, como la secuencia del genoma o un microarray, para obtener estimaciones globales de la expresión génica en respuesta a condiciones de diapausa.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica ecológica, como cuál es la base transcripcional de los DPO u

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Investigación

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Biología

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio Dimopoulos para inyectar dsRNA en los mosquitos Anopheles gambiae, que albergan el parásito de la malaria. La técnica de la manipulación de la configuración de la inyección y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) es una herramienta eficaz para el diagnóstico de los niveles de mRNA en tejidos de insectos y diferentes etapas de desarrollo. En este informe se muestra el uso de QRT-PCR para determinar los niveles de ARNm en diferentes tejidos y estadios de desarrollo larvario de las especies de insectos invasores, el barrenador esmeralda del fresno.

Análisis de la expresión génica en el barrenador esmeralda del fresno ( Agrilus planipennis) Utilizando Real-PCR cuantitativa en tiempo

En este protocolo se combinan RNAi mediada por silenciamiento de los genes con...

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti

La interferencia de ARN (ARNi) es una herramienta extremadamente valiosa para descubrir la función de los genes. Sin embargo, la capacidad de dirigirse a genes utilizando ARNi durante las etapas preadultas es limitada en el principal vector de la malaria humana, Anopheles gambiae. Describimos un protocolo de ARNi para reducir la función génica mediante inyección directa durante el desarrollo de la pupa.

RNAi gatillo en la entrega<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Las pupas

Este protocolo describe una metodología de microinyección que hemos estandarizado y utilizado durante varios años a entregar cantidades específicas de ácidos nucleicos directamente a la hemolinfa de los mosquitos y las moscas de casa. Este protocolo da lugar a mortalidad mínima inyección y permite dosis correlacionadas medidas de fecundidad.

DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

IR-TEx explora perfiles transcripcionales relacionados con la resistencia a insecticidas en la especie Anopheles gambiae. Aquí se proporcionan instrucciones completas para el uso de la aplicación, modificaciones para explorar varios conjuntos de datos transcriptomáticos y el uso del marco para crear una base de datos interactiva para colecciones de datos transcriptomicos de cualquier organismo, generados en cualquier plataforma.

IR-TEx: Una herramienta de integración de datos de código abierto para transcriptomica de Big Data diseñada para las anopheles gambiae de vectores de malaria

Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.

Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti

La administración oral de dsRNA producido por bacterias, un método de administración para la interferencia de ARN (RNAi) que se usa rutinariamente en Caenorhabditis elegans, se aplicó con éxito aquí a mosquitos adultos. Nuestro método permite estudios robustos de genética inversa y estudios de vectores que bloquean la transmisión sin el uso de inyección.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

El presente protocolo describe el método de cría de insectos plaga tortricidas en los laboratorios. Los procedimientos para distinguir el sexo de los insectos y extraer ácidos nucleicos para la secuenciación de alto rendimiento se establecen utilizando dos plagas tortricidas.

Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae

Aprende a analizar ARN-ss para estudiar la diapausa fotoperiódica en Aedes albopictus mediante secuenciación de alto rendimiento y procesamiento bioinformático. Este protocolo permite identificar genes diferencialmente expresados sin recursos genómicos previos.

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Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

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