Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti
10 de septiembre de 2021
Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.
Este protocolo es una forma muy simple y eficiente de detectar mutantes generados por la tecnología CRISPR / Cas9 de numerosos individuos. Las dos principales ventajas de esta técnica son que se puede realizar en pocas horas y que es aplicable a multitud de organismos. El diseño de imprimación puede ser un desafío para ciertos genes y se pueden requerir múltiples rondas de diseño y verificación de imprimación para que HRMA sea eficiente.
Para realizar una PCR de gradiente, comience por preparar una mezcla maestra. Luego retire 19 microlitros de la mezcla maestra para el control sin plantilla o NTC en una placa de 96 pocillos. A continuación, agregue la plantilla a la mezcla maestra restante.
Alícuota 20 microlitros de la mezcla de muestra en la placa de 96 pocillos. Realizar PCR siguiendo los parámetros de ciclo y luego generar los perfiles de fusión térmica utilizando los parámetros mencionados en el manuscrito. Después de reunir todo el material requerido, prepare una mezcla maestra con 0,5 microlitros del reactivo de liberación de ADN y 20 microlitros de tampón de dilución por individuo a genotipar.
Usando una pipeta multicanal, alícuota 20 microlitros de la mezcla en una placa de PCR y deje la placa de PCR en hielo. A continuación, coloque los mosquitos G1 anestesiados en una placa de Petri de vidrio para mantenerlos sedados y coloque ocho mosquitos de tipo silvestre en la segunda placa de Petri. Limpie un par de pinzas con etanol al 70% y use las pinzas desinfectadas para eliminar una de las patas traseras de los mosquitos.
Luego, sumerja la pierna en la solución de reactivo de liberación de ADN. Coloque el mosquito en el vial correspondiente y cierre el vial con una esponja. Una vez hecho esto, limpie las pinzas con etanol al 70% antes de proceder a quitar la pata del siguiente mosquito hasta que se complete la placa de 96 pocillos.
Más tarde, selle la placa con un sello de placa de PCR óptica e incube la placa de PCR que contiene las patas a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos, seguida de la incubación a 98 grados centígrados durante dos minutos. Deje que la placa se enfríe a temperatura ambiente. Para la PCR, prepare una mezcla maestra que contenga los componentes preferidos y luego use una pipeta multicanal para transferir 19 microlitros de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
Después de transferir un microlitro de la solución de liberación de ADN que contiene ADN de mosquito previamente preparado a la placa, selle la placa con un sello de placa de PCR óptica. Realice la PCR con los parámetros de ciclo apropiados para generar perfiles de fusión térmica siguiendo los parámetros descritos en el manuscrito, luego examine los perfiles de fusión asignando un control de tipo salvaje al clúster de referencia. Marque los diferentes clústeres con los colores correspondientes en la plantilla de 96 pocillos.
A continuación, seleccione los individuos con curvas de interés y retire los individuos seleccionados de los tubos para cruzar hacia atrás. La alimentación de sangre lo hizo hembras, seguido de la recolección de G2A. En el análisis representativo, se muestra el análisis de secuencia del mutante ZIP11 del Aedes aegypti.
El electroferograma de los mutantes heterocigotos Aedes aegypti ZIP11 indicó la posición del nucleótido donde se produjo el indel. El indel está representado por un cambio de picos simples a dobles, ya que las posiciones polimórficas muestran ambos nucleótidos concomitantemente. Al final de la ejecución, el número de pares de bases eliminados o insertados se calculó contando los picos individuales.
Los mosquitos que contienen mutaciones en los genes Aedes aegypti ZIP11 y myo-fem fueron genotipados y secuenciados verificados utilizando el análisis de fusión de alta resolución de HRMA. Las señales fluorescentes de las muestras se normalizaron a valores relativos de uno a cero. Además, cada curva se restó de la referencia de tipo salvaje y denotó el aumento correspondiente.
En los resultados representativos se muestra una asignación automática de clúster fallida, donde no se hizo una distinción adecuada entre los grupos. Además, cada muestra se analizó individualmente y se asignó a los grupos correctos en función de la similitud con las muestras de referencia de heterocigotos, homocigotos y transheterocigotos. Después de realizar HRMA, es necesario secuenciar el ADN de los individuos mutados para analizar los indels e identificar las otras mutaciones en la secuencia objetivo.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti mediante análisis de fusión de alta resolución. El método es eficiente y aplicable a diversos organismos, lo que permite la detección rápida de mutantes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genética
- Biología molecular
- Entomología
Antecedentes
- La tecnología CRISPR/Cas9 se utiliza ampliamente para la edición génica.
- Identificar mutaciones de manera eficiente es crucial para los estudios genéticos.
- El análisis de fusión de alta resolución (HRMA) ofrece un método de detección rápido.
- Los desafíos en el diseño de cebadores pueden afectar la eficiencia del HRMA.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo para identificar mutaciones inducidas por CRISPR.
- Mostrar la aplicabilidad de la HRMA en diversos organismos.
- Optimizar el proceso de selección de líneas mutantes.
Métodos Utilizados
- Preparación de una mezcla maestra para PCR.
- Uso de controles sin molde (NTC) en una placa de 96 pocillos.
- PCR con gradiente para optimizar condiciones.
- Análisis de fusión de alta resolución para detectar indels.
Resultados principales
- El protocolo permite la identificación rápida de mutantes.
- El HRMA puede completarse en unas pocas horas.
- Pueden ser necesarias varias rondas de diseño de cebadores para lograr eficiencia.
- El método es versátil en diferentes especies.
Conclusiones
- Este protocolo mejora la eficiencia de la detección de mutantes.
- Proporciona una herramienta valiosa para la investigación genética en mosquitos.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para aplicaciones más amplias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección rápida de inserciones y deleciones inducidas por CRISPR/Cas9 permite una validación eficiente de objetivos en la investigación de control de vectores, reduciendo los plazos para estudios funcionales de genes. El análisis de desnaturalización de alta resolución posibilita la genotipificación a gran escala sin sacrificar organismos, facilitando ensayos fenotípicos posteriores y cruces genéticos. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar detección cuantitativa de mutaciones a partir de muestras mínimas de tejido.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la detección rápida de inserciones y deleciones tras la mutagénesis con CRISPR.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos al identificar alelos mutantes sin sacrificar organismos, preservando las muestras para ensayos posteriores.
- Impacto en la cartera: Acelera los flujos de trabajo de validación de dianas, permitiendo una priorización más rápida de objetivos génicos en sistemas relevantes para enfermedades.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Produce curvas de fusión fluorescentes normalizadas que permiten la comparación cuantitativa de genotipos silvestres y mutantes.
- Valor operativo: Compatible con formatos de placas de 96 pocillos, lo que permite el cribado de mediana escala de individuos editados.
- Preparación del ensayo: Genera perfiles de fusión distinguibles para heterocigotos, homocigotos y transheterocigotos, posibilitando la asignación confiable de agrupamientos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la genotipificación seguida de fenotipificación o alimentación con sangre, conectando la modificación genética con resultados funcionales en modelos de enfermedades.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Facilita la caracterización de inserciones y deleciones mediante secuenciación posterior, confirmando efectos en el blanco e identificando posibles modificaciones fuera del blanco.
- Apoyo a Modelos Preclínicos: Permite el establecimiento de líneas mutantes en Aedes aegypti, un vector clave para estudios de transmisión de arbovirus.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la mutagénesis con CRISPR hasta la identificación de candidatos, proporcionando un punto de control de genotipificación antes de la validación funcional.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la identificación rápida de indels que interrumpen la función génica en vías diana.
- Detección: Permite la estandarización de ensayos mediante análisis normalizado de curvas de desnaturalización y agrupamiento basado en referencias.
- Análisis: Genera desplazamientos cuantitativos en los perfiles de desnaturalización que se correlacionan con el tamaño del indel, posibilitando el análisis comparativo entre muestras.
- Investigación Traducional: Conecta la modificación genética con la evaluación fenotípica al permitir el uso de organismos vivos tras la genotipificación.
- Reutilización Empresarial: Reutilizable en distintos organismos y genes, con adaptabilidad en el diseño de cebadores que respalda una amplia aplicabilidad a dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al proporcionar evidencia directa de los resultados de la edición génica.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de PCR y análisis de desnaturalización con controles integrados.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir el tiempo y los recursos necesarios para el cribado de mutantes.
- Impacto en la cartera: Permite un avance ajustado al riesgo al confirmar la presencia de mutaciones antes de invertir en ensayos fenotípicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño y optimización de cebadores, ya que ciertos genes pueden necesitar múltiples iteraciones de diseño para una HRMA eficiente.
- Depende de instrumentación con control preciso del rampa de temperatura y detección de fluorescencia para el análisis de fusión de alta resolución.
- Necesita una preparación estandarizada de muestras utilizando tejido de pata y reactivos de liberación de ADN para garantizar una calidad de entrada consistente.
- Requiere muestras de referencia de tipo silvestre para una asignación precisa de grupos y normalización del perfil de fusión.
- Limitado por la necesidad de secuenciación posterior a la HRMA para caracterizar completamente las inserciones y deleciones (indels) y detectar mutaciones adicionales en la secuencia diana.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacéuticos
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
