Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

El objetivo general de este procedimiento es investigar la progresión de las células mamarias después del injerto de células tumorales en la almohadilla de grasa viscoelástica del ratón. Esto se logra inyectando células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa de memoria de un ratón adulto y luego midiendo el volumen del tumor con un calibrador a niveles de tiempo predeterminados. Al final del experimento, se determinaron la masa y el volumen del tumor y se extrajeron la sangre y los pulmones del animal para su posterior análisis.

En última instancia, las metástasis macro y micro se pueden cuantificar mediante análisis visual e inmunohistoquímico, respectivamente. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inyección subcutánea de células tumorales, es que el sitio de inyección de la almohadilla de grasa mamaria imita el sitio original de la formación del tumor de mama, lo que produce resultados más confiables. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de mama, como qué tumor, supresores, oncogenes o componentes del compartimento estromal están involucrados en la progresión del cáncer.

Un día antes del procedimiento, afeitar los ratones gamma N-O-D-S-C-I-D desde el cuarto pezón hasta la línea media y pesarlos para verificar que todos los animales tengan pesos aproximadamente comparables. Al día siguiente, lave un cultivo de células de adenocarcinoma de mama humano una vez con PBS y luego intente anificar las células cuando la mayoría de las células se hayan desprendido. Apague la reacción con 10 mililitros de suero que contenga medios DMEM y luego centrifugue las células durante siete minutos a 1.200 RPM a temperatura ambiente, lave el pellet para eliminar cualquier rastro de suero y luego vuelva a suspender el segundo pellet en PBS.

Después de contar, alícuota las células en concentraciones de 500.000 por 150 microlitros en tubos de microcentrífuga estériles sobre hielo. Luego llene un tubo cónico de 50 mililitros con 35 mililitros de PBS y otro con etanol al 70% y remoje hisopos de algodón en cada uno. Cuando todas las herramientas estén listas para cada animal, aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal.

A continuación, utilice cinta adhesiva para sujetar suavemente un ratón anestesiado en una almohadilla térmica y confirme la sedación mediante un pellizco en los dedos de los pies. Use un hisopo de algodón empapado en etanol para limpiar el área afeitada y luego use una hoja de bisturí para hacer una pequeña incisión entre el cuarto pezón y la línea media. Inserte el hisopo de algodón empapado en PBS en la incisión para hacer un bolsillo y luego use pinzas para exponer una almohadilla de grasa viscoelástica, que se puede detectar por su color blanco.

Use otro par de pinzas para apretar la almohadilla de grasa en su base y exponer completamente el tejido. A continuación, pipetea las células del adenocarcinoma hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para crear una solución celular homogénea y aspira suavemente 150 microlitros de células en una jeringa de insulina. Tenga cuidado de sostener una jeringa horizontalmente con el orificio de la aguja hacia arriba.

Inyecte las células en la almohadilla de grasa mamaria confirmando una inyección exitosa por la hinchazón del tejido. A continuación, suelte suavemente la almohadilla de grasa y utilice unas pinzas para mosquitos para suturar la incisión, girando la sutura alrededor de las pinzas para mosquitos en el sentido de las agujas del reloj, en el sentido contrario a las agujas del reloj y en el sentido de las agujas del reloj para hacer tres nudos. Después de la cirugía, inyecte un analgésico y coloque a cada animal en posición reclinada esternalmente en una jaula individual, monitoreando a los ratones hasta que se recuperen por completo.

Ocho semanas después de la implantación de la célula, los ratones se preparan para la extracción de órganos. Fije al animal a una base de espuma y use pinzas para medir el volumen del tumor. A continuación, haga una incisión vertical larga en la línea media y luego haga dos incisiones horizontales justo debajo de la pata delantera y por encima de la pata trasera.

Sujete la piel con alfileres a la espuma para exponer el tumor y luego use unas tijeras para disociar el tumor de la piel. A continuación, se extraen suavemente los pulmones, colocando el pulmón izquierdo en la solución de Bowen durante tres días, después de los cuales este folky metastásico superficial se hará claramente visible a simple vista, se congelará parte del tejido en nitrógeno líquido para su posterior aislamiento del ARN y se colocará la parte restante del tumor en uno de los tubos cónicos llenos de formina. A continuación, después del sacrificio del animal por punción cardíaca, se dispensó la muestra de sangre de 450 microlitros en un tubo de microcentrífuga que contenía 50 microlitros de citrato de sodio al 3,2%, luego se centrifugaron los glóbulos rojos y se almacenaron las muestras de plasma a 20 grados centígrados negativos hasta que se utilizaran más recientemente. Los errores experimentales, como una inoculación imprecisa de las células o fugas, pueden provocar variaciones en el tamaño del tumor o incluso la ausencia de un tumor que conduzca a la formación de una estructura que parece similar a la memoria.

Almohadilla de grasa inyectada con tampón de control. La tasa de crecimiento del tumor también depende de la naturaleza de la línea celular inyectada y, en general, se puede observar a través de la piel del ratón. Además, el área alrededor del tumor puede mostrar grandes vasos que surgen de la remodelación vascular y que pueden desempeñar un papel crucial en la eliminación de productos de desecho y en el suministro de nutrientes y oxígeno al tejido tumoral.

A diferencia de los experimentos in vitro, la tasa de crecimiento de las células tumorales puede no ser constante en el tiempo in vivo debido a la hipoxia y la falta de nutrientes. Es posible que se formen áreas necróticas dentro del tejido circundante, y estas áreas afectarán la tasa de crecimiento del tumor. Además, las células inyectadas que expresan genes específicos de interés pueden afectar la progresión del cáncer, ya que los genes pueden inducir el crecimiento del tumor que comienza rápidamente, pero se ralentiza al final o viceversa.

La recolección de los pulmones en la solución de Bowen ayuda a visualizar los focos metastásicos superficiales, que aparecen como formaciones pálidas elevadas en la superficie del tejido pulmonar. La formación de focos depende de la línea celular. Las células no agresivas pueden dar lugar a micrometástasis solamente, que pueden identificarse fácilmente con tinción de h y e en el tejido pulmonar incluido en parafina.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como Eliza para responder preguntas adicionales como, ¿cómo afecta el crecimiento del tumor experimental a los niveles de citocinas o moléculas pro angiogénicas en el plasma?