Name: Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a evaluar la conformación de glicoproteínas del envoltorio del VIH-1 mediante un ensayo ELISA basado en células. Este método permite analizar la interacción de anticuerpos monoclonales con menor cantidad de reactivos y alto rendimiento.

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Agradecemos al Dr. James Robinson por su generosa donación de la A32, 17b, 48d, y C11 mAbs. PGT 121 se obtuvo a través del Programa de reactivos de SIDA de los NIH, la División de SIDA, NIAID, NIH (Cat # 12343). Este trabajo fue apoyado por la Fundación Canadiense para la Innovación Líder del Programa # 29866, por un operativo CIHR # 257792, por un Establecimiento FRQS de Joven Científico Grant # 24639 de la FA y por un subsidio continuo CRCHUM, así como por un CIHR subvención catalizador # 126630 a AF y RM. AF es el destinatario de un FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 beca # 24639. MV fue apoyado por un Premio de Investigación Doctoral CIHR # 291485.

1. Día 1 - Cultivo Celular <ol><li> Plate 2 x 10 4 células por pocillo en un 96 pocillos placa de cultivo celular opaco adecuado para la lectura de luminiscencia osteosarcoma humano (HOS). Utilice Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina. Incubar hasta el día siguiente a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. Día 2 - Polietilenimina (PEI) Transfección <ol><li> Preparar la mezcla de transfección de acuerdo con los pasos subsiguientes. Ajuste reactivos y cantidades de ADN de acuerdo con el número de pozos que van a ser transfectadas con el mismo Env. </li><li> Tubo A: Añadir 10 ng de plásmido Tat-codificación (tal como pTat-III 27) y 150 ng de plásmido que codifica la Env a 5 l de DMEM suplementado con 25 mM HEPES. </li><li> El plásmido Tat-codificación sólo es necesaria para utilizar plásmidos Tat-dependientes Env-codifican como pSVIII. </li><li> Tubo B: Añadir 450 ng PEI (desde un 1g / l solución) a 5 l de DMEM. </li><li> Añadir el contenido del tubo B al tubo A. Mezclar bien por agitación durante 10 segundos e incubar la mezcla de transfección de 10 minutos a temperatura ambiente (22 ° C). </li><li> Añadir 10 l de la mezcla de transfección por pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 3. Día 4 - ELISA <ol><li> Lleve a cabo todos los experimentos a temperatura ambiente para reducir al mínimo posible la endocitosis de los complejos Env / anticuerpos. </li><li> Preparar 250 ml de tampón de lavado por placa que se utilizan al mismo tiempo. Tampón de Lavado es solución salina tamponada con Tris 1X (TBS) pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; NaCl 150 mM), suplementado con 1 mM de MgCl 2 y 1,8 mM CaCl 2. </li><li> Preparar 125 ml de tampón de bloqueo por plato añadiendo leche en polvo sin grasa 1% y 5 mM Tris pH 8,0 y tampón de lavado. </li><li> Retire el medio de cultivo de células y mezcla de transfección (sobrenadante) de la placa de 96 pocillos. </li><li> Añadir 100 μ; L de tampón de bloqueo por pocillo y se incuba 20 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 50 l de anticuerpo (o suero) por pocillo, se diluyó a la concentración apropiada en tampón de bloqueo. Típicamente, usar una concentración de 1 g / ml. Incubar 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lave 3 veces con 100 l tampón de bloqueo y luego repetir 3x proceso de lavado con 100 l tampón de lavado. </li><li> Aspirar el sobrenadante, añadir 100 l tampón de bloqueo, e incubar 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir 50 l de anticuerpo secundario, diluido 1/3000 en tampón de bloqueo. Variar dilución óptima de anticuerpo de acuerdo a las diferencias fabricante. Incubar 40 min a RT. </li><li> Lave 3 veces con 100 l tampón de bloqueo y luego repetir 3x proceso de lavado con 100 l tampón de lavado. </li></ol> 4. Adquisición de Datos <ol><li> Aspirar el sobrenadante de la placa y añadir 30 l 1x aumento de quimioluminiscencia (ECL) de sustrato por pocillo. </li><li> Adquirir chemiluminescence señal durante 1 seg / pocillo en un lector de placas adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tiempo de lectura puede variar de acuerdo a las diferencias de hardware. </li></ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
<li>Koff, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccine+development%3A+challenges+and+opportunities+towards+solving+the+HIV+vaccine-neutralizing+antibody+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem.</a> Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).</li>
<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
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<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
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<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
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<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
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<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
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<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
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<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Este ensayo se optimiza para detectar la interacción de los mAb específicos con el VIH-1 trimérica Env expresada en la superficie celular. Una vez que el protocolo ha sido establecida, puede ser utilizado en medios a altos rendimientos con bajos costes de materiales globales y pequeñas cantidades de anticuerpos. Dado que este ensayo está basado en la transfección, puede ser fácilmente adaptado para la coexpresión de las proteínas celulares tales como CD4 con el fin de estudiar sus efectos sobre la conformación Env. ...

Humana tipo 1 del virus de inmunodeficiencia (VIH-1) de entrada, mediada por las glicoproteínas de la envoltura viral triméricos (ENV) es el primer paso del ciclo infeccioso. Siendo el único antígeno viral expuesto presentado en la superficie de los viriones, la Env trímero provoca anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes. Como tal, representa un candidato interesante para el diseño inmunógeno de la vacuna. Sin embargo, los ensayos de vacunación con Env en formas solubles o recombinantes suscitó respuestas con sólo una eficacia mínima contra más primaria del VIH-1 aislados de 1-3. No obstante, la eficacia parcial observada en el ensayo de la vacuna RV144 4 renovado interés en el VIH-1 Env como candidato inmunógeno. Esto fue corroborado por un reciente estudio describiendo que los anticuerpos anti-Env vacuna-suscitó fueron suficientes para generar un cierto grado de protección contra el VIS y el VIH desafía 5. Después de ser sintetizada en el retículo endoplásmico, el glycoprote Enven precursora, gp160, experimenta varias modificaciones post-traduccionales que son críticos para su capacidad para alimentar el proceso de fusión viral. El precursor de Env debe doblar correctamente y asociado en trímeros antes de ser escindida en sus gp120 y gp41 transmembrana extra-citoplasmáticos subunidades 6-10, con interacciones no covalentes que mantienen el enlace con gp120-gp41. La maquinaria de la célula infectada también es en gran medida responsable de glicosilar Env, que comprende aproximadamente 50% de su masa total 11,12. La compleja estructura resultante permite Env para ser conformacionalmente flexible de 13,14, mientras que proporciona una metaestabilidad que se piensa para permitir Env para adaptarse y ocultar ciertos epítopos altamente inmunogénicos que de otro modo estar expuestos 15-19, subrayando la importancia de comprender mejor las diferentes conformaciones muestreada por el trimer Env nativa. Hasta la fecha, varias técnicas se han desarrollado y utilizado con éxito para estudiar Env ch conformacionalanges. Sin embargo, varían en sus limitaciones, está a menudo restringido a contextos específicos Env. Por ejemplo, la resonancia de plasmón de superficie o ensayos de inmunoprecipitación utilizando anticuerpos monoclonales específicos de conformación (mAbs), se basan ya sea en moléculas Env solubles o solubilizados monoméricas que se sabe que son inmunogenéticamente diferentes de sus formas triméricas 20,21. Estudios recientes también sugieren que la escisión afecta conformaciones resultantes Env en la exposición de los epítopos reconocidos principalmente por anticuerpos no neutralizantes 14,22,23. A continuación se describe en detalle un método que permite la determinación rápida y fácil de la conformación de celularmente-expresado Env trímeros 18,24-26. Después de la transfección transitoria de Env en una línea de células adherentes humana la unión de los anticuerpos de Env-específicos se detecta utilizando una reacción de quimioluminiscencia simple. Esta técnica también se puede utilizar para caracterizar la preferencia conformacional de conformación depen-anticuerpos abolladura. Por lo tanto, este ensayo proporciona un método robusto y altamente flexible de detección.

<table><tbody><tr><td>Células HOS ATCC</td><td></td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos opaca blanca, 96 pocillos, fondo plano</td><td>BD</td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, lineal, 25.000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Preparado en solución de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>IgG antihumana de cabra, peroxidasa conjugada</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato de quimioluminiscencia mejorada</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941, Lector de placas</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación conformacional del vih-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica el uso de un elisa ensayo basado en células

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Las glicoproteínas de la envoltura del VIH-1 (Env) median la entrada viral en las células diana y son esenciales para el ciclo infeccioso. Comprender cómo esas glicoproteínas son capaces de alimentar el proceso de fusión a través de sus cambios conformacionales podría conducir al diseño de inmunógenos mejores y más eficaces para las estrategias de vacunación. En este trabajo describimos un ensayo ELISA basado en células que permite estudiar el reconocimiento de Env trimérico del VIH-1 por anticuerpos monoclonales. Tras la expresión de Env trimérico del VIH-1 en la superficie de las células transfectadas, se incuban con las células anticuerpos anti-Env específicos de conformación. A continuación, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y una reacción de quimioluminiscencia simple para detectar anticuerpos unidos. Este sistema es altamente flexible y puede detectar cambios conformacionales de Env inducidos por CD4 soluble o proteínas celulares. Requiere una cantidad mínima de material y no requiere equipos o conocimientos técnicos altamente especializados. Por lo tanto, esta técnica se puede establecer para el cribado de antígenos y anticuerpos, como los anticuerpos recién aislados.

Usando el procedimiento general descrito anteriormente, se adaptó el protocolo para ensayar el impacto de CD4 soluble (sCD4) y CD4 celular coexpressed en la exposición de los epítopos CD4i en cualquiera de tipo salvaje (wt) o mutado Env, como se describió previamente 18,24, 25,28. La figura 1 representa esquemáticamente el procedimiento general y la exposición de epítopos CD4i después del tratamiento con sCD4 o por coexpresión de CD4 celular 18. En la Figura 2, se ...

Comprender las conformaciones de los antígenos de superficie viral es necesario para evaluar la neutralización de anticuerpos y guiar el diseño de inmunógenos de vacunas efectivos. En este trabajo describimos un ensayo ELISA basado en células que permite estudiar el reconocimiento de la trimérica VIH-1 Env expresada en la superficie de las células transfectadas por anticuerpos anti-Env específicos.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

El objetivo general del siguiente experimento es interrogar la confirmación de las glicoproteínas de una envoltura del VIH RIC con anticuerpos monoclonales. Esto se logra seccionando primero las células de adherencia para expresar las proteínas quiméricas VIH one E NV en la superficie celular. Como segundo paso, las células se incuban con anticuerpos monoclonales anti ENV, que se unirán a ENV dependiendo de la exposición al epítopo.A continuación, se añade un anticuerpo secundario conjugado HRP para cuantificar la interacción del anticuerpo mediante un ensayo de quimioluminiscencia. Se obtienen resultados que muestran los niveles relativos de anticuerpos unidos al VNV en función de las unidades de luz relativas adquiridas para cada uno. Bueno, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el atado basado en hechos, es que esta técnica se puede realizar con una baja cantidad de anticuerpos y con un alto rendimiento, un postdoctorado en el laboratorio realizará esta técnica.Las células de osteosarcoma humano se utilizan en este experimento un día antes de la placa de transfección, dos veces 10 por la cuarta célula por pocillo. En una placa opaca de cultivo celular de 96 pocillos adecuada para la lectura de luminiscencia. El medio de águila modificado delcos usado, suplementado con suero fetal bovino y estreptomicina penicilina, incuba las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono al día siguiente.Prepara la mezcla de transfección. Primero, coloque dos tubos, dos bahías y dos bahías B a dos bahías. Agregue cinco microlitros de DMEM suplementado con 25 milimolares hippies, seguidos de 10 nanogramos de tat y plásmido de recubrimiento, y 150 nanogramos de plásmido codificante de glicoproteína de una envoltura quimérica para el VIH.Tenga en cuenta que el plásmido que codifica TAT solo es necesario cuando se utiliza el plásmido que codifica la glicoproteína de una envoltura del VIH dependiente de TAT a dos B a cinco microlitros de DMM y 450 nanogramos de polietalina o PEI. Las cantidades de los reactivos y del ADN deben ajustarse de acuerdo con el número de pocillos que se van a transfectar con la misma glicoproteína del VIH de una envoltura. A continuación, agregue el contenido de dos B a dos bahías y mezcle bien mediante vórtice durante 10 segundos.Incubar la mezcla de transfección durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, agregue 10 microlitros de la mezcla de transfección por pocillo de la placa de 96 pocillos incubar durante 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de óxido de carbono. El Ali SA para estudiar el reconocimiento de la glicoproteína quimérica del VIH de una envoltura por anticuerpos monoclonales se realiza dos días después de la transfección de las células de osteosarcoma humano.Prepare 250 mililitros de tampón de lavado por plato que se esté utilizando al mismo tiempo. Prepare 125 mililitros de tampón de bloqueo por plato agregando 1% de leche en polvo descremada y cinco milimolares de tris pH 8.0 al tampón de lavado. Retire el medio de cultivo celular y la mezcla de transfección de la placa de 96 pocillos.Agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo por pocillo e incube durante 20 minutos. A temperatura ambiente, retirar el sobrenadante y añadir 50 microlitros de anticuerpo por pocillo diluido hasta la concentración adecuada en tampón bloqueante. Incubar durante una hora a temperatura ambiente.Lavar tres veces con 100 microlitros de tampón bloqueante y luego repetir el proceso de lavado tres veces. Lavar tres veces con 100 microlitros de tampón de bloqueo y luego lavar tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado después del último lavado. Retire el sate.Añadir 100 microlitros de tampón de bloqueo e incubar durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante y agregue 50 microlitros de anticuerpo secundario diluido de uno a 3000 en tampón de bloqueo. Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente después de 40 minutos.Lavar tres veces con 100 microlitros de tampón de bloqueo, seguido de tres lavados con 100 microlitros de tampón de lavado. Para preparar las muestras para la adquisición de datos, retire el sobrenadante de la placa de 96 pocillos y agregue 30 microlitros de un sustrato de quimioluminiscencia mejorada por pocillo. Adquiera la señal de quimioluminiscencia durante un segundo por pocillo en un lector de placas adecuado.De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el impacto de CD cuatro soluble o S CD cuatro en la exposición de los epítopos de CD cuatro I en las glicoproteínas de la envoltura o ENV fue la interacción del ensayo de CD cuatro con ENV induce cambios de confirmación de ENV que exponen epítopos 17 B y 48 D que se superponen al sitio de unión del correceptor, pero no afecta al anticuerpo de reconocimiento de dominio externo dos G 12. Para evaluar el impacto de las mutaciones puntuales en la confirmación de NV, se utilizaron dos mutantes ENV: H 66 A, que tiene una menor propensión a muestrear espontáneamente la confirmación unida a CD cuatro y S3 75 W, que predispone a NV al estado unido a CD cuatro. La normalización de los datos brutos de acuerdo con los niveles de expresión, revela que H 66 A disminuye el reconocimiento de CD cuatro I 17 B, mientras que S3 75 W mejora la señal 17 B y es suficiente para restaurar el fenotipo de H 66.Un mutante de células de ensayo transfectadas con cantidades crecientes de un expresor de CD cuatro. Junto con las barras azules NV, revelaron señales crecientes para los anticuerpos monoclonales CD cuatro I, A tres, dos y C 11, que reconocieron epítopos discontinuos en el dominio interno de la glicoproteína ENV. El reconocimiento de GP one 20 ENV por los dos anticuerpos G 12 no se vio afectado.Por último, los datos brutos se normalizaron a dos G 12, la ausencia de una modulación 32 y C 11 cuando ENV se transfectó con un mutante CD cuatro con capacidad disminuida para interactuar con ENV indica que el aumento de las señales dependió de la interacción de E NV CD cuatro Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La región de la corona de las diferentes secuencias V3 bucle de la glicoproteína de superficie (gp120) del VIH-1 puede ser caracterizado estructuralmente en muchos casos en el plegamiento in silico de las posiciones 10 a 22 del ciclo con un estado de la...

Evaluación de la inmunológicamente relevantes características dinámicas estructurales Terciario de la pandemia del VIH-1 secuencia de bucle V3 R2 Corona Ab initio Plegable

Hemos desarrollado un vector lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, el elemento de respuesta Rev (RRE) que pueden regular la expresión del gen de una forma del VIH-1 Tat y Rev-dependiente. El vector permite la detección específica de la replicación del VIH en las células vivas a través de la expresión de GFP.

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

El protocolo describe un método de alto rendimiento para la determinación de estructuras de proteínas de membrana con la crio-tomografía electrónica y procesamiento de imágenes 3D. Que cubre los detalles de la preparación de muestras, la recopilación de datos, procesamiento e interpretación de datos, y concluye con la producción de un objetivo representante para la aproximación, la pandemia del VIH-1 glicoproteína de la envoltura. Estos procedimientos de cálculo han sido diseñados de una manera...

Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Varios fluoro-2'-aptámeros de ARN del VIH-1BA-L con gp120 nanomol afinidad están aisladas de la biblioteca de ARN...

Desarrollo de programas específicos de células de tipo anti-gp120 del VIH aptámeros para la entrega de siRNA

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Ilustramos aquí un ensayo de unión a membranas in vitro en el que las interacciones entre el Gag del VIH-1 y las membranas lipídicas se analizan visualmente utilizando Gag marcado con YFP sintetizado en un sistema de traducción in vitro basado en germen de trigo y GUVs preparados por una técnica de electroformación.

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

Descrito es una metodología para cuantificar la expresión de 96 genes y 18 proteínas de la superficie de células ex vivo, lo que permite la identificación de diferencialmente expresan genes y proteínas en células virus-infectadas en comparación con las células no infectadas. Aplicamos el enfoque de estudio CD4 infectados por SIV+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India.

Sola célula cuantificación del mRNA y la expresión de la proteína de superficie de CD4 infectados por el Virus de la inmunodeficiencia de los simios+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India

Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

Aquí, presentamos un protocolo para detectar epítopos de neutralización en partículas similares a virus (VLP) que muestran antígenos. La inmunoprecipitación de las VLP derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se realiza utilizando anticuerpos monoclonales específicos de glicoproteínas de la envoltura acoplados a perlas magnéticas conjugadas con proteína g. Las VLP capturadas se someten posteriormente a SDS-PAGE y western blot-análisis empleando anticuerpos específicos de gag de...

Detección de epítopos sensibles a la neutralización en antígenos mostrados en vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) utilizando un ensayo de captura

Aquí, describimos un inmunoensayo fluorescente multiplex recientemente desarrollado que utiliza un sistema citométrico de flujo de doble reportero para detectar simultáneamente dos epítopos únicos de proteína de pico en partículas virales intactas del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que habían sido capturadas por microesferas magnéticas acopladas a la enzima convertidora de angiotensina-2.

Perfil de epítopos de proteínas de superficie en partículas virales mediante la estrategia Multiplex Dual-Reporter

Aquí, describimos algunos métodos establecidos para determinar el estrés del retículo endoplásmico (RE) y la activación de la respuesta proteica desplegada (UPR), con especial énfasis en la infección por VIH-1. Este artículo también describe un conjunto de protocolos para investigar el efecto del estrés del RE/UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión.

Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1

Aprende a evaluar la conformación de glicoproteínas del envoltorio del VIH-1 mediante un ensayo ELISA basado en células. Este método permite analizar la interacción de anticuerpos monoclonales con menor cantidad de reactivos y alto rendimiento.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

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