Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

El objetivo general del siguiente experimento es interrogar la confirmación de las glicoproteínas de una envoltura del VIH RIC con anticuerpos monoclonales. Esto se logra seccionando primero las células de adherencia para expresar las proteínas quiméricas VIH one E NV en la superficie celular. Como segundo paso, las células se incuban con anticuerpos monoclonales anti ENV, que se unirán a ENV dependiendo de la exposición al epítopo.

A continuación, se añade un anticuerpo secundario conjugado HRP para cuantificar la interacción del anticuerpo mediante un ensayo de quimioluminiscencia. Se obtienen resultados que muestran los niveles relativos de anticuerpos unidos al VNV en función de las unidades de luz relativas adquiridas para cada uno. Bueno, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el atado basado en hechos, es que esta técnica se puede realizar con una baja cantidad de anticuerpos y con un alto rendimiento, un postdoctorado en el laboratorio realizará esta técnica.

Las células de osteosarcoma humano se utilizan en este experimento un día antes de la placa de transfección, dos veces 10 por la cuarta célula por pocillo. En una placa opaca de cultivo celular de 96 pocillos adecuada para la lectura de luminiscencia. El medio de águila modificado delcos usado, suplementado con suero fetal bovino y estreptomicina penicilina, incuba las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono al día siguiente.

Prepara la mezcla de transfección. Primero, coloque dos tubos, dos bahías y dos bahías B a dos bahías. Agregue cinco microlitros de DMEM suplementado con 25 milimolares hippies, seguidos de 10 nanogramos de tat y plásmido de recubrimiento, y 150 nanogramos de plásmido codificante de glicoproteína de una envoltura quimérica para el VIH.

Tenga en cuenta que el plásmido que codifica TAT solo es necesario cuando se utiliza el plásmido que codifica la glicoproteína de una envoltura del VIH dependiente de TAT a dos B a cinco microlitros de DMM y 450 nanogramos de polietalina o PEI. Las cantidades de los reactivos y del ADN deben ajustarse de acuerdo con el número de pocillos que se van a transfectar con la misma glicoproteína del VIH de una envoltura. A continuación, agregue el contenido de dos B a dos bahías y mezcle bien mediante vórtice durante 10 segundos.

Incubar la mezcla de transfección durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, agregue 10 microlitros de la mezcla de transfección por pocillo de la placa de 96 pocillos incubar durante 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de óxido de carbono. El Ali SA para estudiar el reconocimiento de la glicoproteína quimérica del VIH de una envoltura por anticuerpos monoclonales se realiza dos días después de la transfección de las células de osteosarcoma humano.

Prepare 250 mililitros de tampón de lavado por plato que se esté utilizando al mismo tiempo. Prepare 125 mililitros de tampón de bloqueo por plato agregando 1% de leche en polvo descremada y cinco milimolares de tris pH 8.0 al tampón de lavado. Retire el medio de cultivo celular y la mezcla de transfección de la placa de 96 pocillos.

Agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo por pocillo e incube durante 20 minutos. A temperatura ambiente, retirar el sobrenadante y añadir 50 microlitros de anticuerpo por pocillo diluido hasta la concentración adecuada en tampón bloqueante. Incubar durante una hora a temperatura ambiente.

Lavar tres veces con 100 microlitros de tampón bloqueante y luego repetir el proceso de lavado tres veces. Lavar tres veces con 100 microlitros de tampón de bloqueo y luego lavar tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado después del último lavado. Retire el sate.

Añadir 100 microlitros de tampón de bloqueo e incubar durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante y agregue 50 microlitros de anticuerpo secundario diluido de uno a 3000 en tampón de bloqueo. Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente después de 40 minutos.

Lavar tres veces con 100 microlitros de tampón de bloqueo, seguido de tres lavados con 100 microlitros de tampón de lavado. Para preparar las muestras para la adquisición de datos, retire el sobrenadante de la placa de 96 pocillos y agregue 30 microlitros de un sustrato de quimioluminiscencia mejorada por pocillo. Adquiera la señal de quimioluminiscencia durante un segundo por pocillo en un lector de placas adecuado.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el impacto de CD cuatro soluble o S CD cuatro en la exposición de los epítopos de CD cuatro I en las glicoproteínas de la envoltura o ENV fue la interacción del ensayo de CD cuatro con ENV induce cambios de confirmación de ENV que exponen epítopos 17 B y 48 D que se superponen al sitio de unión del correceptor, pero no afecta al anticuerpo de reconocimiento de dominio externo dos G 12. Para evaluar el impacto de las mutaciones puntuales en la confirmación de NV, se utilizaron dos mutantes ENV: H 66 A, que tiene una menor propensión a muestrear espontáneamente la confirmación unida a CD cuatro y S3 75 W, que predispone a NV al estado unido a CD cuatro. La normalización de los datos brutos de acuerdo con los niveles de expresión, revela que H 66 A disminuye el reconocimiento de CD cuatro I 17 B, mientras que S3 75 W mejora la señal 17 B y es suficiente para restaurar el fenotipo de H 66.

Un mutante de células de ensayo transfectadas con cantidades crecientes de un expresor de CD cuatro. Junto con las barras azules NV, revelaron señales crecientes para los anticuerpos monoclonales CD cuatro I, A tres, dos y C 11, que reconocieron epítopos discontinuos en el dominio interno de la glicoproteína ENV. El reconocimiento de GP one 20 ENV por los dos anticuerpos G 12 no se vio afectado.

Por último, los datos brutos se normalizaron a dos G 12, la ausencia de una modulación 32 y C 11 cuando ENV se transfectó con un mutante CD cuatro con capacidad disminuida para interactuar con ENV indica que el aumento de las señales dependió de la interacción de E NV CD cuatro Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas.