Método de aislados Ex Vivo Perfusión pulmonar en un modelo de rata: Lecciones Aprendidas de Desarrollo de un Programa EVLP Rata

El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo consistente de perfusión pulmonar ex vivo en ratas que produzca resultados reproducibles. El primer paso es canular la tráquea e iniciar la ventilación mecánica. A continuación, se canulan la arteria pulmonar y la aurícula izquierda.

El paso final es retirar el bloqueo corazón-pulmón de la cavidad torácica y colocarlo en el circuito de perfusión pulmonar ex vivo. En última instancia, se utilizan sensores de presión, transductores de peso y un analizador de gases en sangre para mostrar el estado del pulmón en tiempo real mediante la medición de la presión arterial pulmonar y otros parámetros. La profusión pulmonar ex vivo es una tecnología notable que nos ha permitido ampliar el grupo de donantes para el trasplante pulmonar.

Anticipamos que a través de esta tecnología que sirve como plataforma para la evaluación de órganos, podemos mejorar la calidad de los órganos que se llevan a trasplante y los resultados generales del trasplante. Aquí en el laboratorio de Copper, hemos acuñado la frase armar el órgano, es decir, evaluar, remodelar o reparar, y luego modificar el órgano para mejorar la calidad y, por lo tanto, mejorar los resultados del trasplante. Hemos desarrollado un modelo robusto y reproducible de perfusión pulmonar ex vivo en ratas

A través de este video, demostraremos los pasos clave y críticos para que desarrolle este modelo de perfusión pulmonar ex vivo, que luego puede servir como plataforma para la investigación de perfusión y trasplante. Comience configurando el circuito EVLP y haciendo circular la perfusión caliente ocho por todo el sistema. Ajuste el baño de agua caliente, el intercambiador de calor y el tórax artificial a 37 grados centígrados.

Pase un gas de oxigenación a través del PERFUSE ocho en el filtro de gas para asegurarse de que tenga aproximadamente un 6% de oxígeno disuelto para el experimento. Después de abrir el programa de adquisición de datos, conecte el transductor de presión de la arteria pulmonar, la traqueal, el transductor de presión diferencial, el flujo respiratorio, el transductor de presión diferencial, el transductor de peso pulmonar y el transductor de velocidad de la bomba a la caja convertidora de analógico a digital. Finalmente, configure la mesa de operaciones y prepare todas las herramientas y suministros operativos necesarios para el procedimiento.

Después de verificar la sedación por dedo del pie, pellizco, coloque al animal anestesiado en posición supina sobre la mesa de operaciones. Comience a registrar datos utilizando el programa de adquisición de datos. Cuando esté listo, ingrese a la cavidad abdominal e inyecte heparina en la vena cava inferior.

Siguiendo los procedimientos estándar, canula la tráquea y conecte la cánula a un circuito de ventilación. Encienda el ventilador mecánico para comenzar a ventilar mecánicamente los pulmones. A continuación, retraiga la cavidad torácica para exponer los pulmones teniendo cuidado de evitar tocarlos.

Retire el timo y desplace el contenido abdominal hacia un lado para exponer la vena cava inferior o la vena mesentérica. Después de la eutanasia, coloque una sutura de seda detrás de la arteria pulmonar y la aorta. En preparación para asegurar la cánula de la arteria pulmonar, haga una incisión de dos a tres milímetros en la superficie anterior del tracto de salida del ventrículo derecho e inserte la cánula en la arteria pulmonar principal.

Asegurado con sutura de seda, elimine los coágulos de la vasculatura pulmonar mediante la perfusión de aproximadamente 15 mililitros de una solución de electrolitos positivos con bajo contenido de potasio a través de la arteria pulmonar y hacia afuera a través del ápice del corazón. A continuación, coloque una sutura de seda detrás del corazón y alrededor de los ventrículos. Para dilatar la válvula mitral y facilitar la canulación, inserte un pequeño par de pinzas quirúrgicas en el ápice a través de la válvula mitral y en la aurícula izquierda.

Cuando esté listo, inserte una cánula en el ápice a través de la válvula mitral y en la aurícula izquierda. Asegure la cánula de la aurícula izquierda con la sutura de seda. A continuación, conecte la cánula de la arteria pulmonar al circuito EVLP.

Asegúrese de que la línea de entrada que proviene del circuito esté cebada con perfusión ocho. Para evitar que el aire entre en el corazón y los pulmones, encienda la bomba peristáltica principal y ajústela a una velocidad baja. Esto permitirá que la perfusión ocho corra a través de la arteria pulmonar y salga por el ventrículo izquierdo hasta la cavidad torácica.

Controle la presión de la arteria pulmonar para asegurarse de que no se dispare, lo que indica una obstrucción o una mala canulación. Cuando esté listo, apague la bomba peristáltica. Conectar la cánula de la arteria pulmonar al circuito de perfusión pulmonar ex vivo.

No conecte la cánula de la aurícula izquierda al circuito hasta que el bloqueo cardíaco-pulmonar se haya retirado del cuerpo. Retire el bloqueo cardíaco-pulmonar pinzando el esófago con un hemostático y cortando por debajo de la pinza para que el esófago se pueda usar para elevar las estructuras cardiopulmonares sin contacto, diseccionar el tejido circundante y cortar la aorta descendente y los vasos auxiliares para liberar el bloqueo cardíaco-pulmonar mientras se eleva a través del esófago. Transecte la tráquea para liberar el bloqueo cardíaco-pulmonar y colóquelo en la ubicación designada en el circuito EVLP.

A continuación, conecte la cánula de la aurícula izquierda a la línea de salida y ponga en marcha la bomba peristáltica. Para registrar los datos de ventilación y controlar la presión rápidamente, retire la línea de ventilación de la parte superior del aparato EVLP y conecte la carcasa con los sensores de presión. A continuación, vuelva a insertar la línea de ventilación en la parte superior del aparato EVLP.

Asegúrese de que la trampa de burbujas esté adecuadamente llena con perfusión ocho. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los pulmones durante los primeros 15 minutos, cambie lentamente los ajustes de ventilación y perfusión a los niveles experimentales deseados. Aumente el caudal de perfusión a la tasa y la presión deseadas también durante esta fase inicial de aceleración.

Se recomienda programar el ventilador para que produzca respiraciones laterales intermitentes para facilitar el movimiento del líquido fuera del espacio pulmonar y retrasar la aparición del edema. Defina el tiempo cero como el tiempo en que los parámetros de ventilación están en un volumen corriente de cuatro mililitros por kilogramo positivo. Finalizar la presión espiratoria a los dos centímetros.

Los parámetros de H2O y perfusión se encuentran en sus niveles esperados y permanecen constantes. Si lo desea, tome ocho muestras de la congelación instantánea del puerto de muestras en nitrógeno líquido y anote la hora en que se tomaron las muestras. Una vez finalizado el experimento, aísle las piezas anatómicas necesarias para la recolección y congélelas rápidamente en nitrógeno líquido o colóquelas en una solución de fijación para estudios posteriores.

El peso pulmonar de las ratas Sprague macho no cambió significativamente a lo largo de los 60 minutos de perfusión pulmonar ex vivo después de los primeros 10 minutos. Tampoco hubo cambios en la presión arterial pulmonar. Del mismo modo, la resistencia vascular pulmonar no se alteró a lo largo de la duración del estudio.

Después de una hora de ventilación a altos volúmenes corrientes y alta observación, las concentraciones de citocinas proinflamatorias aumentaron en el PERFUSE eight, mientras que las concentraciones de citocinas antiinflamatorias permanecieron sin cambios. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de los pasos clave necesarios para establecer un modelo de profusión pulmonar ex Viva en ratas en su laboratorio.