Método de aislados Ex Vivo Perfusión pulmonar en un modelo de rata: Lecciones Aprendidas de Desarrollo de un Programa EVLP Rata
25 de febrero de 2015
Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Aquí se describe el desarrollo de un programa EVLP rata y mejoras que permitan un modelo reproducible para una futura expansión.
El objetivo general de este procedimiento es establecer un modelo consistente de perfusión pulmonar ex vivo en ratas que produzca resultados reproducibles. El primer paso es canular la tráquea e iniciar la ventilación mecánica. A continuación, se canulan la arteria pulmonar y la aurícula izquierda.
El paso final es retirar el bloqueo corazón-pulmón de la cavidad torácica y colocarlo en el circuito de perfusión pulmonar ex vivo. En última instancia, se utilizan sensores de presión, transductores de peso y un analizador de gases en sangre para mostrar el estado del pulmón en tiempo real mediante la medición de la presión arterial pulmonar y otros parámetros. La profusión pulmonar ex vivo es una tecnología notable que nos ha permitido ampliar el grupo de donantes para el trasplante pulmonar.
Anticipamos que a través de esta tecnología que sirve como plataforma para la evaluación de órganos, podemos mejorar la calidad de los órganos que se llevan a trasplante y los resultados generales del trasplante. Aquí en el laboratorio de Copper, hemos acuñado la frase armar el órgano, es decir, evaluar, remodelar o reparar, y luego modificar el órgano para mejorar la calidad y, por lo tanto, mejorar los resultados del trasplante. Hemos desarrollado un modelo robusto y reproducible de perfusión pulmonar ex vivo en ratas
animales pequeñas.A través de este video, demostraremos los pasos clave y críticos para que desarrolle este modelo de perfusión pulmonar ex vivo, que luego puede servir como plataforma para la investigación de perfusión y trasplante. Comience configurando el circuito EVLP y haciendo circular la perfusión caliente ocho por todo el sistema. Ajuste el baño de agua caliente, el intercambiador de calor y el tórax artificial a 37 grados centígrados.
Pase un gas de oxigenación a través del PERFUSE ocho en el filtro de gas para asegurarse de que tenga aproximadamente un 6% de oxígeno disuelto para el experimento. Después de abrir el programa de adquisición de datos, conecte el transductor de presión de la arteria pulmonar, la traqueal, el transductor de presión diferencial, el flujo respiratorio, el transductor de presión diferencial, el transductor de peso pulmonar y el transductor de velocidad de la bomba a la caja convertidora de analógico a digital. Finalmente, configure la mesa de operaciones y prepare todas las herramientas y suministros operativos necesarios para el procedimiento.
Después de verificar la sedación por dedo del pie, pellizco, coloque al animal anestesiado en posición supina sobre la mesa de operaciones. Comience a registrar datos utilizando el programa de adquisición de datos. Cuando esté listo, ingrese a la cavidad abdominal e inyecte heparina en la vena cava inferior.
Siguiendo los procedimientos estándar, canula la tráquea y conecte la cánula a un circuito de ventilación. Encienda el ventilador mecánico para comenzar a ventilar mecánicamente los pulmones. A continuación, retraiga la cavidad torácica para exponer los pulmones teniendo cuidado de evitar tocarlos.
Retire el timo y desplace el contenido abdominal hacia un lado para exponer la vena cava inferior o la vena mesentérica. Después de la eutanasia, coloque una sutura de seda detrás de la arteria pulmonar y la aorta. En preparación para asegurar la cánula de la arteria pulmonar, haga una incisión de dos a tres milímetros en la superficie anterior del tracto de salida del ventrículo derecho e inserte la cánula en la arteria pulmonar principal.
Asegurado con sutura de seda, elimine los coágulos de la vasculatura pulmonar mediante la perfusión de aproximadamente 15 mililitros de una solución de electrolitos positivos con bajo contenido de potasio a través de la arteria pulmonar y hacia afuera a través del ápice del corazón. A continuación, coloque una sutura de seda detrás del corazón y alrededor de los ventrículos. Para dilatar la válvula mitral y facilitar la canulación, inserte un pequeño par de pinzas quirúrgicas en el ápice a través de la válvula mitral y en la aurícula izquierda.
Cuando esté listo, inserte una cánula en el ápice a través de la válvula mitral y en la aurícula izquierda. Asegure la cánula de la aurícula izquierda con la sutura de seda. A continuación, conecte la cánula de la arteria pulmonar al circuito EVLP.
Asegúrese de que la línea de entrada que proviene del circuito esté cebada con perfusión ocho. Para evitar que el aire entre en el corazón y los pulmones, encienda la bomba peristáltica principal y ajústela a una velocidad baja. Esto permitirá que la perfusión ocho corra a través de la arteria pulmonar y salga por el ventrículo izquierdo hasta la cavidad torácica.
Controle la presión de la arteria pulmonar para asegurarse de que no se dispare, lo que indica una obstrucción o una mala canulación. Cuando esté listo, apague la bomba peristáltica. Conectar la cánula de la arteria pulmonar al circuito de perfusión pulmonar ex vivo.
No conecte la cánula de la aurícula izquierda al circuito hasta que el bloqueo cardíaco-pulmonar se haya retirado del cuerpo. Retire el bloqueo cardíaco-pulmonar pinzando el esófago con un hemostático y cortando por debajo de la pinza para que el esófago se pueda usar para elevar las estructuras cardiopulmonares sin contacto, diseccionar el tejido circundante y cortar la aorta descendente y los vasos auxiliares para liberar el bloqueo cardíaco-pulmonar mientras se eleva a través del esófago. Transecte la tráquea para liberar el bloqueo cardíaco-pulmonar y colóquelo en la ubicación designada en el circuito EVLP.
A continuación, conecte la cánula de la aurícula izquierda a la línea de salida y ponga en marcha la bomba peristáltica. Para registrar los datos de ventilación y controlar la presión rápidamente, retire la línea de ventilación de la parte superior del aparato EVLP y conecte la carcasa con los sensores de presión. A continuación, vuelva a insertar la línea de ventilación en la parte superior del aparato EVLP.
Asegúrese de que la trampa de burbujas esté adecuadamente llena con perfusión ocho. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los pulmones durante los primeros 15 minutos, cambie lentamente los ajustes de ventilación y perfusión a los niveles experimentales deseados. Aumente el caudal de perfusión a la tasa y la presión deseadas también durante esta fase inicial de aceleración.
Se recomienda programar el ventilador para que produzca respiraciones laterales intermitentes para facilitar el movimiento del líquido fuera del espacio pulmonar y retrasar la aparición del edema. Defina el tiempo cero como el tiempo en que los parámetros de ventilación están en un volumen corriente de cuatro mililitros por kilogramo positivo. Finalizar la presión espiratoria a los dos centímetros.
Los parámetros de H2O y perfusión se encuentran en sus niveles esperados y permanecen constantes. Si lo desea, tome ocho muestras de la congelación instantánea del puerto de muestras en nitrógeno líquido y anote la hora en que se tomaron las muestras. Una vez finalizado el experimento, aísle las piezas anatómicas necesarias para la recolección y congélelas rápidamente en nitrógeno líquido o colóquelas en una solución de fijación para estudios posteriores.
El peso pulmonar de las ratas Sprague macho no cambió significativamente a lo largo de los 60 minutos de perfusión pulmonar ex vivo después de los primeros 10 minutos. Tampoco hubo cambios en la presión arterial pulmonar. Del mismo modo, la resistencia vascular pulmonar no se alteró a lo largo de la duración del estudio.
Después de una hora de ventilación a altos volúmenes corrientes y alta observación, las concentraciones de citocinas proinflamatorias aumentaron en el PERFUSE eight, mientras que las concentraciones de citocinas antiinflamatorias permanecieron sin cambios. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de los pasos clave necesarios para establecer un modelo de profusión pulmonar ex Viva en ratas en su laboratorio.
Descripción general
Este artículo describe el establecimiento de un modelo de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) en rata dirigido a mejorar los resultados del trasplante pulmonar. El modelo permite la evaluación en tiempo real del estado pulmonar, ampliando así el grupo de donantes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del trasplante
- Perfusión pulmonar ex vivo
- Preservación de órganos
Antecedentes
- La tecnología de perfusión pulmonar ex vivo permite una mejor evaluación de los pulmones donantes.
- Tiene el potencial de mejorar los resultados del trasplante mediante la evaluación de la calidad del órgano.
- El desarrollo de un modelo animal reproducible es crucial para el avance de la investigación.
- El laboratorio de Copper tiene como objetivo perfeccionar las técnicas de evaluación de órganos.
Objetivo del estudio
- Crear un modelo de rata consistente para la perfusión pulmonar ex vivo.
- Facilitar la investigación sobre trasplante pulmonar y mejora de la calidad del órgano.
- Mostrar los pasos críticos para establecer el modelo de EVLP.
Métodos Utilizados
- Canulación de la tráquea, la arteria pulmonar y la aurícula izquierda.
- Uso de sensores de presión y adquisición de datos para monitoreo en tiempo real.
- Configuración de perfusión tibia y mantenimiento de condiciones fisiológicas.
- Ejecución paso a paso de los procedimientos quirúrgicos para la extracción pulmonar.
Resultados principales
- Establecimiento exitoso de un modelo de EVLP en rata con resultados reproducibles.
- Monitoreo en tiempo real del estado pulmonar durante la perfusión.
- Demuestra técnicas para mejorar la calidad del órgano destinado al trasplante.
- Potencial para mejorar los resultados en el trasplante pulmonar mediante este modelo.
Conclusiones
- El modelo de EVLP en ratas es una herramienta valiosa para la investigación en trasplante pulmonar.
- Los perfeccionamientos en el modelo pueden conducir a una mejor evaluación y preservación de órganos donantes.
- Este estudio contribuye a los esfuerzos continuos para mejorar las tasas de éxito del trasplante.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de un modelo reproducible de perfusión pulmonar ex vivo (EVLP) en ratas proporciona una plataforma preclínica para evaluar estrategias de preservación pulmonar y analizar la calidad del órgano antes del trasplante. Este modelo permite reducir de forma mecanicista los riesgos asociados a intervenciones terapéuticas dirigidas a lesiones pulmonares inducidas por ventilación y otras patologías relevantes para la optimización del pulmón donante. Al permitir el monitoreo en tiempo real de parámetros pulmonares, el sistema mejora la confiabilidad predictiva en flujos de trabajo de descubrimiento temprano centrados en la biología del trasplante y la reparación de órganos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con los mecanismos de lesión y reparación pulmonar bajo condiciones de perfusión controladas.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de objetivos al permitir la evaluación de vías moleculares en un sistema de órgano intacto.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor Científico: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para preparar sistemas biológicos validados destinados a probar compuestos dirigidos a mejorar la calidad pulmonar.
- Valor Operativo: Facilita la normalización de ensayos mediante la medición en tiempo real de la presión arterial pulmonar, el peso pulmonar y los parámetros de gases en sangre.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela la lesión pulmonar inducida por ventilación (VILI) para evaluar las respuestas fisiopatológicas y probar estrategias potenciales de mitigación.
- Valor operativo: Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de condiciones fisiológicas durante la perfusión.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo de EVLP en rata se integra en la continuidad del descubrimiento al apoyar la prueba de hipótesis en biología temprana, permitir la preparación de ensayos para la selección de compuestos y proporcionar resultados cuantitativos para decisiones de avance o interrupción en el desarrollo preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aclarar la participación de vías en los procesos de lesión y reparación pulmonar.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles, como la presión pulmonar y el peso del pulmón, para comparar condiciones experimentales.
- Análisis: Permite la adquisición de datos en tiempo real mediante sensores de presión, transductores de peso y análisis de gases sanguíneos para evaluar la función pulmonar.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización del daño pulmonar inducido por la ventilación (VILI), una patología clínicamente relevante en el trasplante pulmonar.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para pruebas iterativas de soluciones de preservación, estrategias ventilatorias y agentes farmacológicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad en la respuesta pulmonar a intervenciones.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante protocolos definidos de canalización, perfusión y monitoreo.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones ajustada al riesgo en la investigación sobre preservación de órganos, reduciendo los fracasos en etapas avanzadas del desarrollo de trasplantes.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización de candidatos basada en resultados funcionales pulmonares en lugar de marcadores sustitutos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la canulación microvascular y en la anatomía cardiopulmonar en modelos de roedores.
- Depende de instrumentación que incluye bombas peristálticas, transductores de presión, sensores de peso y analizadores de gases sanguíneos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los parámetros de perfusión, configuraciones del ventilador y protocolos de adquisición de datos.
- Incluye consideraciones de adaptación al trasladar el método desde ratas a modelos de mamíferos más grandes o a la evaluación pulmonar humana.
- Comprende limitaciones prácticas, como la complejidad técnica de la extracción del bloque corazón-pulmón y el mantenimiento de la esterilidad durante la perfusión.
