Evaluación Funcional de neurotoxinas Biológica en Culturas en Red de Células Madre deriva-Sistema Nervioso Central Neuronas

El objetivo de este procedimiento es medir con precisión el efecto que las neurotoxinas clostridiales tienen sobre la transmisión sináptica en cultivos en red de neuronas derivadas de células madre embrionarias de ratón. Esto se logra adaptando primero las células madre embrionarias a un cultivo en suspensión libre de células alimentadoras y manteniendo las células adaptadas en un estado pluripotente. El segundo paso es diferenciar las células madre adaptadas a la suspensión en neuronas o ESN, utilizando una variación de la técnica de diferenciación de cuatro cuatro.

A continuación, las ESN se tratan con una serie de medios para promover la maduración en neuronas en red sinápticamente activas. El paso final es tratar las ESN con clostridial, neurotoxinas u otras neurotoxinas y medir los efectos sobre la actividad sináptica de las monos mediante electrofisiología de pinza de parche de célula completa. En última instancia, los cambios en la producción espontánea de la actividad sináptica de las monos se cuantifican a partir de registros electrofisiológicos normalizados a neuronas de control emparejadas por edad y lotes, y se comparan entre diferentes condiciones como dosis, tiempos o tratamientos farmacológicos.

La principal ventaja de esta técnica es que las ESNs son el primer modelo basado en células que replica las patologías funcionales responsables de las manifestaciones clínicas del botulismo y el tétanos. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que las ESN eran altamente susceptibles a todas las neurotoxinas clostridiales basadas en la escisión de la proteína de trampa, y también demostramos actividad sináptica espontánea en el comportamiento de la red emergente. La demostración del procedimiento estará a cargo de la Sra. Megan Lyman, una técnica de mi laboratorio Begin mediante la transferencia de cultivo en suspensión libre de células alimentadoras adaptado.

ESC se agrega a un tubo cónico de 15 mililitros y permite que los agregados se asienten en un pellet compacto. Una vez que los agregados se hayan asentado, aspire el SUP natante teniendo cuidado de no interrumpir la pelletización de la celda. A continuación, añada cinco mililitros de PBS para lavar las células y centrifugar a 100 veces G durante 2,5 minutos.

Aspire con cuidado el PBS y luego agregue 500 microlitros de tripsina e invierta el tubo varias veces para romper suavemente la pelletización celular. A continuación, coloque el tubo en el baño de agua a 37 grados centígrados e incube durante tres minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, vuelva a colocar el tubo en la campana de cultivo de tejidos y añada 500 microlitros de medio ESC para diluir la tripsina.

A continuación, repite la suspensión CEL de cinco a 10 veces con la pipeta P 1000 para conseguir una suspensión de una sola célula. Cuente un eloquaqua de las células usando un hemo, un citómetro y centrifugue el resto de la suspensión celular a 200 veces G durante tres minutos. Después de aspirar el supinado, suspendemos las células a una concentración final de uno por ciento, las siete células por mililitro con medio ESC.

A continuación, transfiera 150 microlitros de la suspensión a 10 mililitros de medio ESC en un plato bacteriano de 10 centímetros e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Los ESC E se pasan de forma rutinaria utilizando este protocolo. Cada 48 horas comienza la diferenciación de las ESC en neuronas durante un paso celular de rutina.

Disocia las ESCs como antes, pero incluye una placa adicional para la diferenciación neuronal. Transfiera 350 microlitros de la suspensión celular a un plato de fijación de 10 centímetros de baja altura que contenga 25 mililitros de diferenciación. Medio. Coloque el plato en un agitador orbital ajustado a 30 a 45 RPM dentro de una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono e incube durante 48 horas.

Después de 48 horas, use una pipeta de 25 mililitros para transferir los agregados celulares diferenciadores a un tubo cónico de 50 mililitros. Inmediatamente después añadir 25 mililitros de diferenciación fresca. Medio a la placa de Petri.

Deje que los agregados se asienten durante dos a cinco minutos, produciendo una bolita visible de uno a dos milímetros de profundidad. Aspire cuidadosamente el medio, ignorando cualquier célula individual o agregado pequeño que aún esté en suspensión, y utilice una pipeta P 1000 para transferir la paleta de células de vuelta a la placa de Petri. Regrese el plato a la agitadora rotativa de la incubadora.

Después de otras 48 horas, repita el procedimiento de cambio de soporte. Esta vez a 30 mililitros de medio de diferenciación suplementado con seis micromolares de ácido trans retinoico. El pellet formado ahora tendrá de dos a cuatro milímetros de profundidad después de incubar las células.

Al igual que antes, repita el procedimiento de cambio de medio con suplementación con ácido retinoico por última vez. El perdigón tendrá de cuatro a ocho milímetros de profundidad en este punto al día siguiente. Prepare las superficies de recubrimiento como se describe en la parte escrita del protocolo en la tarde del día del enchapado, o cinco mililitros de medio de tripsina MPC prerrecubierto y un inhibidor de tryin de soja al 0,1% a 37 grados centígrados.

A continuación, utilice una pipeta de 25 mililitros para transferir los agregados diferenciadores de la placa de cultivo a un tubo cónico de 50 mililitros. Deje que los agregados se asienten durante tres a cinco minutos y luego aspire cuidadosamente el medio sin alterar el pellet. A continuación, lave el pellet con cinco a 10 mililitros de PBS y después de que los agregados se hayan asentado.

Aspire el PBS y repita el lavado. Después del segundo lavado de PBS. Agregue cinco mililitros de medio de mPC al pellet e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Agitar suavemente el tubo dos o tres veces durante la incubación. A continuación, agregue cinco mililitros de inhibidor de tripsinas de soja al 0,1% a las células y mezcle rápidamente invirtiendo. A continuación, tritrate suavemente las células de 10 a 15 veces con una pipeta de 10 mililitros hasta que se produzca una suspensión celular relativamente homogénea.

Filtre lentamente la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 o 70 micras colocado encima de un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, una vez que se ha filtrado toda la suspensión a un mililitro de N dos, medio al filtro para lavar las células restantes a través del colador. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue durante seis minutos a 200 veces G. Después de aspirar el medio sin perturbar el pellet, triture en dos mililitros de N dos medios, luego agregue N dos medios hasta un volumen total de 10 mililitros.

Centrifugar durante cinco minutos a 200 veces. G.Aspire el medio y repita el proceso de lavado de pellets nuevamente. Resus suspendiendo el pellet en 10 mililitros de N dos medio.

Retire una alícuota de las células y cuente con un hemocitómetro, y luego repita la centrifugación Reese. Suspenda las células en N dos medios hasta una concentración final de uno por 10 a las siete células por mililitro y coloque una placa con una densidad de 150.000 a 200.000 células por centímetro cuadrado. Indic se prepara a DIV menos uno y se coloca en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados.

Mantenga los ESN de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito. En primer lugar, diluir la neurotoxina botulínica serotipo A a 100 veces la concentración final deseada en cultivo de ESN, medio y tibio a 37 grados centígrados. A continuación, añada un volumen adecuado de toxina a los cultivos de DIV 21 más ESN.

Hinche la placa de cultivo y regrese a la incubadora a la hora deseada. Aspirar puntualmente el medio de cultivo de ESN y lavar dos veces con tampón de registro extracelular o ERB. A continuación, añada cuatro mililitros de ERB suplementado con tetrodatoxina de cinco micromolares para bloquear los potenciales de acción y 10 micromolares de colina bi para antagonizar la actividad del receptor gabaa.

A continuación, transfiera el plato a la plataforma de electrofisiología. No se requiere perfusión ni control de temperatura para la inhibición medida de la transmisión sináptica o el ensayo de niebla. Después de usar un extractor de micropipetas para extraer pipetas de silicato bo con cinco a 10 mega ohmios de resistencia, rellene una pipeta con tampón de registro intracelular.

A continuación, sumerja suavemente la pipeta en el reactivo de silicona. Fije la pipeta de registro al soporte de electrodos y conecte una jeringa llena de aire al tubo que está conectado al soporte de electrodos. Proporcione una presión positiva constante a través de la jeringa mientras baja la pipeta de registro en el ERB.

Después de aterrizar suavemente la pipeta registradora en el SOR de la neurona que se va a grabar. Vea presión positiva rompiendo el sello de la jeringa. Vuelva a conectar la jeringa y aplique una presión negativa sostenida a través de una inspiración suave para formar un sello de giga ohmios.

Una vez que se forme el sello giga ome, disminuya el voltaje de retención a menos 70 milivoltios. A continuación, aplique con cuidado pulsos cortos de presión negativa con la jeringa para romper la configuración de célula completa. Supervise los picos de capacitancia durante 30 segundos para confirmar que el parche es estable.

Cancele los picos de capacitancia en el software HEA y cambie al modo de pinza amperimétrica para monitorear y registrar el potencial de membrana en reposo sin ajuste para los potenciales de unión líquida. El potencial de membrana en reposo podría estar entre menos 67 y menos 82 milivoltios. Ajuste la ganancia a dos milivoltios por pico amperio.

Cambie al modo de pinza de voltaje y realice un registro continuo de menos 70 milivoltios durante tres a cinco minutos para detectar corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura. Analice de tres a cinco minutos de datos registrados para detectar PSC utilizando la configuración predeterminada para EPC de receptor AMPA en mini análisis, recopile y guarde información sobre los eventos detectados. Después de recolectar las frecuencias M-E-P-S-C de ocho a 12 controles y de ocho a 12 muestras tratadas con neurotoxina botulínica para cada condición de exposición.

Analice la frecuencia en función de la edad y los controles emparejados por lotes, luego determine la significación estadística del porcentaje de inhibición de la actividad sináptica utilizando pruebas estadísticas apropiadas desde div seven hasta div 49, las ESN expresan compartimentos neurotrópicos y forman punción sináptica. Interfaces taxodendríticas. Las ESN experimentan inhibición de la actividad sináptica cuando se exponen a los serotipos de neurotoxina botulínica, un TG y la toxina tetánica.

Estas trazas representativas de las ESN se recogieron 20 horas después del baño de los serotipos de neurotoxina botulínica, A TG tetanos, neurotoxina o vehículo. Cada neurotoxina redujo la actividad sináptica en más del 95% en comparación con los controles. Las siguientes cuatro imágenes muestran la sensibilidad del uso de niebla para medir la actividad sináptica de las monos en el serotipo de neurotoxina botulínica, las ESN tratadas con A.

Esta primera imagen muestra trazas representativas de mediciones omitidas de actividad sináptica 20 horas después del baño edición de la neurotoxina botulínica serotipo A.Los segmentos traza de la pinza de voltaje mostraron una disminución en la frecuencia M-E-P-S-C después de la exposición a la neurotoxina botulínica serotipo A.Esta imagen muestra la cuantificación de la frecuencia M-E-P-S-C y confirma una disminución dependiente de la dosis en la frecuencia M-E-P-S-C. La mediana de la concentración inhibitoria se determinó con el ajuste de mínimos cuadrados de una regresión no lineal utilizando una pendiente variable de cuatro parámetros. Tenga en cuenta que el límite de detección por niebla en SNS es de al menos 0,005 picaMolar.

Este gráfico de barras muestra la cuantificación citométrica de la escisión de SNAP 25 medida por Western blot. Obsérvese la reducida sensibilidad de la escisión de la proteína de la trampa como lectura de la intoxicación. En comparación con la niebla, un solo asterisco indica un valor de P inferior a 0,05.

Un triple asterisco indica un valor P inferior a 0,001. Estos hallazgos demuestran que las poblaciones en red de neuronas derivadas de células madre ofrecen un modelo fisiológicamente relevante basado en células de envenenamiento por neurotoxina clostridial. Se espera que el uso de SNS reduzca significativamente el sufrimiento y la muerte de los animales al servir como un reemplazo adecuado para el ensayo de letalidad en ratones, con el beneficio adicional de una mayor velocidad, especificidad y sensibilidad.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la neurotoxicología empleen técnicas de cribado de rendimiento moderado basadas en la actividad de la red neuronal para facilitar el cribado terapéutico y la detección de toxinas para las neurotoxinas clostridiales.