Evaluación Funcional de neurotoxinas Biológica en Culturas en Red de Células Madre deriva-Sistema Nervioso Central Neuronas

El objetivo de este procedimiento es medir con precisión el efecto que las neurotoxinas clostridiales tienen sobre la transmisión sináptica en cultivos en red de neuronas derivadas de células madre embrionarias de ratón. Esto se logra primero adaptando las células madre embrionarias a un cultivo en suspensión libre de células alimentadoras y manteniendo las células adaptadas en un estado pluripotente. El segundo paso consiste en diferenciar las células madre adaptadas en suspensión en neuronas o ESN, utilizando una variación de la técnica de diferenciación en cuatro pasos.

A continuación, las ESN se tratan con una serie de medios para promover su maduración hacia neuronas en red con actividad sináptica. El paso final consiste en tratar las ESN con neurotoxinas clostridiales u otras neurotoxinas y medir los efectos sobre la actividad monosináptica mediante electrofisiología de parche en célula íntegra. En última instancia, los cambios en la producción espontánea de actividad monosináptica se cuantifican a partir de grabaciones electrofisiológicas normalizadas respecto a neuronas de control emparejadas por edad y lote, y se comparan entre diferentes condiciones, como dosis, tiempos o tratamientos farmacológicos.

La principal ventaja de esta técnica es que las MNE son el primer modelo basado en células que replica las patologías funcionales responsables de las manifestaciones clínicas del botulismo y el tétanos. Tuvimos la idea de este método cuando descubrimos que las MNE eran altamente susceptibles a todas las neurotoxinas clostridiales basadas en la escisión de las proteínas SNARE, y que también mostraban actividad sináptica espontánea en el comportamiento emergente de la red. La persona que demostrará el procedimiento será la Sra. Megan Lyman, una técnica de mi laboratorio. Comience transfiriendo un cultivo en suspensión libre de células alimentadoras adaptado.

Transferir los agregados de ESC a un tubo cónico de 15 mililitros y permitir que los agregados se sedimenten formando un pellet compacto. Una vez que los agregados hayan sedimentado, aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular. A continuación, añadir cinco mililitros de PBS para lavar las células y centrifugar a 100 × g durante 2,5 minutos.

Aspire cuidadosamente el PBS y luego agregue 500 microlitros de tripsina e invierta el tubo varias veces para deshacer suavemente el sedimento celular. A continuación, coloque el tubo en el baño de agua a 37 grados Celsius e incube durante tres minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, regrese el tubo a la cabina de cultivo celular y agregue 500 microlitros de medio ESC para diluir la tripsina.

Luego, pase la suspensión de CEL cinco a 10 veces a través de la pipeta P1000 para obtener una suspensión de células individuales. Cuente una alícuota de las células utilizando un hemocitómetro y centrifugue el resto de la suspensión celular a 200 × g durante tres minutos. Después de aspirar el sobrenadante, suspenda las células hasta una concentración final de 1 × 10⁷ células por mililitro con medio ESC.

A continuación, transfiera 150 microlitros de la suspensión a 10 mililitros de medio ESC en una placa bacteriana de 10 centímetros e incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Las CEE se pasan rutinariamente utilizando este protocolo. Cada 48 horas, la diferenciación de las CEE en neuronas comienza durante un pase celular rutinario.

Disocie las CSE como antes, pero incluya una placa adicional para la diferenciación neuronal. Transfiera 350 microlitros de la suspensión celular a un recipiente de 10 centímetros con fondo de baja adhesión que contenga 25 mililitros de medio de diferenciación. Coloque el recipiente sobre un agitador orbital ajustado a 30-45 RPM dentro de un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, e incube durante 48 horas.

Después de 48 horas, utilice una pipeta de 25 mililitros para transferir los agregados celulares en diferenciación a un tubo cónico de 50 mililitros. Inmediatamente después, agregue 25 mililitros de medio de diferenciación fresco a la placa de Petri.

Deje reposar los agregados durante dos a cinco minutos, formando un precipitado visible de uno a dos milímetros de profundidad. Aspire cuidadosamente el medio, ignorando cualquier célula aislada o agregado pequeño que aún esté en suspensión, y utilice una pipeta P1000 para transferir la paleta celular de vuelta a la placa de Petri. Devuelva la placa al agitador rotatorio dentro del incubador.

Después de otras 48 horas, repita el procedimiento de cambio de medio. Esta vez con 30 mililitros de medio de diferenciación suplementado con seis micromolares de ácido retinoico todo trans. El pellet formado tendrá ahora una profundidad de dos a cuatro milímetros tras la incubación de las células.

Como antes, repita el procedimiento de cambio de medio con suplementación de ácido retinoico por última vez. Al día siguiente, en este punto, el precipitado tendrá una profundidad de cuatro a ocho milímetros. Prepare las superficies de siembra según se indica en la parte escrita del protocolo durante la tarde del día de siembra, o cinco mililitros de medio de tripsina MPC recubierto previamente y de inhibidor de tripsina de soja al 0,1 % cada uno, a 37 grados Celsius.

Luego, utilice una pipeta de 25 mililitros para transferir los agregados en diferenciación desde la placa de cultivo a un tubo cónico de 50 mililitros. Deje que los agregados sedimenten durante tres a cinco minutos y luego aspire cuidadosamente el medio sin perturbar el precipitado. A continuación, lave el precipitado con cinco a 10 mililitros de PBS y después de que los agregados hayan sedimentado.

Aspire el PBS y repita el lavado. Después del segundo lavado con PBS, agregue cinco mililitros de medio de MPCilización al precipitado e incúbelo a 37 grados Celsius durante cinco minutos.

Agite suavemente el tubo dos o tres veces durante la incubación. A continuación, agregue cinco mililitros de inhibidor de tripsina de soja al 0,1 % a las células y mezcle rápidamente invirtiendo el tubo. Luego, triture suavemente las células de 10 a 15 veces con una pipeta de 10 mililitros hasta obtener una suspensión celular relativamente homogénea.

Filtre lentamente la suspensión celular a través de un colador celular de 40 o 70 micrones colocado encima de un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, una vez que toda la suspensión haya sido filtrada, agregue un mililitro de medio N2 al filtro para lavar las células restantes a través del colador. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue durante seis minutos a 200 × g. Después de aspirar el medio sin perturbar el sedimento, resuspenda en dos mililitros de medio N2 y luego agregue medio N2 hasta un volumen total de 10 mililitros.

Centrifugar durante cinco minutos a 200 veces. G. Aspirar el medio y repetir nuevamente el proceso de lavado del sedimento. Suspender nuevamente el sedimento en 10 mililitros de medio N dos.

Retire una alícuota de las células y cuéntelas con un hemocitómetro, y luego repita la centrifugación Reese. Suspenda las células en medio N dos hasta una concentración final de uno por diez a la siete células por mililitro y siembre con una densidad de 150.000 a 200.000 células por centímetro cuadrado. Indic se prepara en DIV menos uno y se coloca en el incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius.

Mantenga las ESN según las instrucciones del protocolo escrito. Primero, diluya la neurotoxina botulínica del serotipo A hasta 100 veces la concentración final deseada en el medio de cultivo de ESN y caliente a 37 grados Celsius. Luego, agregue un volumen apropiado de toxina a los cultivos de ESN de DIV 21 o más.

Incubar el cultivo en la placa y devolverlo al incubador durante el tiempo deseado. Aspirar el medio de cultivo de ESN y lavar dos veces con tampón de registro extracelular o ERB. A continuación, añadir cuatro mililitros de ERB suplementado con cinco micromolar de tetrodotoxina para bloquear los potenciales de acción y 10 micromolar de bicuculina para antagonizar la actividad del receptor gabaa.

A continuación, transfiera el plato al equipo de electrofisiología. No se requiere perfusión ni control de temperatura para medir la inhibición de la transmisión sináptica ni para el ensayo de embrión aislado. Después de usar un tirador de micropipetas para elaborar pipetas de borosilicato con una resistencia de cinco a 10 megaohmios, rellene una pipeta con tampón intracelular para registro.

Luego, sumerja suavemente la pipeta en el reactivo de silicona. Sujete firmemente la pipeta de registro al porta-electrodo y conecte una jeringa llena de aire al tubo que está conectado al porta-electrodo. Aplique una presión positiva constante mediante la jeringa mientras introduce la pipeta de registro en la ERB.

Después de posar suavemente la pipeta de registro sobre la SOR del neutrón que se va a registrar, observe la presión positiva al romper el sello en la jeringa. Vuelva a conectar la jeringa y aplique una presión negativa sostenida mediante una inspiración suave para formar un sello de gigaohmio.

Una vez formado el sello giga ome, reduzca el voltaje de retención a menos 70 milivoltios. Luego, aplique cuidadosamente pulsos breves de presión negativa utilizando la jeringa para acceder a la configuración de célula completa. Monitoree las fluctuaciones de capacitancia durante 30 segundos para confirmar que el parche es estable.

Cancelar los picos de capacitancia en el software HEA y cambiar al modo de fijación de corriente para monitorear y registrar el potencial de membrana en reposo sin ajuste para los potenciales de unión líquida. El potencial de membrana en reposo podría estar entre menos 67 y menos 82 milivoltios. Ajustar la ganancia a dos milivoltios por picoamperio.

Cambie al modo de bloqueo de voltaje y realice una grabación continua a menos 70 milivoltios durante tres a cinco minutos para detectar corrientes postsinápticas excitatorias miniatura. Analice tres a cinco minutos de datos grabados para detectar las corrientes postsinápticas miniatura utilizando los ajustes predeterminados para las corrientes postsinápticas excitatorias de los receptores AMPA en el análisis mini, recolecte y guarde la información sobre los eventos detectados. Después de recopilar las frecuencias de corrientes postsinápticas excitatorias miniatura para ocho a 12 controles y ocho a 12 muestras tratadas con neurotoxina botulínica para cada condición de exposición.

Analice la frecuencia frente a controles apareados por edad y lote, luego determine la significancia estadística del porcentaje de inhibición de la actividad sináptica utilizando pruebas estadísticas apropiadas desde el div siete hasta el div 49, las ESN expresan compartimentos neurotrópicos y forman punciones sinápticas. Interfaces dendríticas taxonómicas. Las ESN experimentan inhibición de la actividad sináptica cuando se exponen a las serotipos A TG de la neurotoxina botulínica y a la toxina tetánica.

Estos trazos representativos de ESN se recopilaron 20 horas después de la adición en baño de serotipos de neurotoxina botulínica, A TG tétanos, neurotoxina o vehículo. Cada neurotoxina redujo la actividad sináptica en más del 95 % en comparación con los controles. Las siguientes cuatro imágenes muestran la sensibilidad del uso de mist para medir la actividad monosináptica en ESN tratados con el serotipo de neurotoxina botulínica A.

Esta primera imagen muestra trazas representativas de mediciones omitidas de la actividad sináptica 20 horas después de la adición al baño del neurotoxina botulínica del serotipo A. Los segmentos de las trazas del clampaje de voltaje exhibieron una disminución en la frecuencia de M-E-P-S-C tras la exposición a la neurotoxina botulínica del serotipo A. Esta imagen muestra la cuantificación de la frecuencia de M-E-P-S-C y confirma una reducción dependiente de la dosis en la frecuencia de M-E-P-S-C. La concentración mediana inhibitoria se determinó mediante el ajuste de mínimos cuadrados de una regresión no lineal utilizando una pendiente variable de cuatro parámetros. Nótese que el límite de detección mediante mist en SNS es de al menos 0,005 picoMolar.

Este gráfico de barras muestra la cuantificación por citometría del corte de SNAP 25 medido mediante blot de western. Observe la menor sensibilidad del corte de la proteína snare como indicador de intoxicación. En comparación con mist, un solo asterisco indica un valor P inferior a 0,05.

Un triple asterisco indica un valor P inferior a 0,001. Estos hallazgos demuestran que las poblaciones interconectadas de neuronas derivadas de células madre ofrecen un modelo celular basado en células fisiológicamente relevante para la intoxicación por neurotoxinas clostridiales. Se espera que el uso del SNS reduzca significativamente el sufrimiento y la muerte de animales al servir como un reemplazo adecuado para el ensayo de letalidad en ratones, con la ventaja adicional de una mayor rapidez, especificidad y sensibilidad.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la neurotoxicología empleen técnicas de cribado de throughput moderado basadas en la actividad de redes neuronales para facilitar el cribado terapéutico y la detección de toxinas para neurotoxinas clostridiales.