بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجنيس قطع الأنسجة البشرية بسرعة لتحويلها إلى معلق من الخلايا المفردة دون الحاجة إلى الهضم الإنزيمي، وذلك لإجراء التحاليل النوعية والكمية وعزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا اللمفاوية. يتم تحقيق ذلك أولاً باستخدام مشرط معقم لتقطيع قطع الأنسجة إلى أجزاء صغيرة. بعد ذلك، يتم نقل ملاط الأنسجة إلى أنبوب تفكيك ميكانيكي حيث يتم تجنيس القطع بشكل أكبر لتحويلها إلى معلق من الخلايا المفردة.

يتم بعد ذلك جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لإجراء التحاليل اللاحقة. وفي النهاية، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل الخلايا اللمفاوية المتسللة والمجموعات الفرعية منها. لقد طور مختبري هذه التقنية لأننا كنا نبحث عن طريقة تمكننا من تصوير الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم دون التأثير بشكل كبير على حالتها الطبيعية.

لقد رغبنا في توفير وسيلة تتيح لنا عزل الخلايا بسرعة وتحليلها كما كانت وقت الجراحة. وقد استُخدمت هذه التقنية في مختبرنا على أكثر من 300 من أورام الثدي والأنسجة الطبيعية، وهي سهلة الاستخدام ويمكن تطبيقها بشكل يومي. كما يمكن استخدامها لفحص المؤشرات الإنذارية، والاستجابة للعلاج، والنتائج السريرية على المدى الطويل.

سيقوم جون نيكولا لويك، الفني في مختبري، باستعراض هذه التقنية اليوم. ابدأ بوزن عينة النسيج، ثم قم بقياس طول النسيج وعرضه وارتفاعه. بعد ذلك، انقل قطعة النسيج إلى طبق بتري صغير يحتوي على 1 mL من وسط زراعة خلايا مكونة للدم الخالي من المصل والمعرّف كيميائياً والمناسب، واستخدم مشرطاً معقماً لتقطيع العينات إلى قطع صغيرة تتراوح مساحتها بين 1 إلى 2 mm².

بعد ذلك، انقل محتويات الطبق إلى أنبوب C الخاص بالتفكيك الميكانيكي، واغسل الطبق والمشرط بـ 2 mL من الوسط. أضف سائل الغسيل إلى أنبوب C، ثم قم بتشغيل برنامج التفكيك الميكانيكي 0.01 مرتين متتاليتين لتجنيس قطع الأنسجة بلطف إلى معلق من الخلايا المفردة. بعد الدورة الثانية، قم بصب المتجانس عبر مصفاة خلايا بمسامية 40 µm في أنبوب مخروطي سعة 50 mL.

بعد ذلك، استخدم الماصة ذات الرأس الماضي (pest pipette) التي استُخدمت في غسل طبق بتري لنقل أي سائل متبقٍ في أنبوب C إلى مصفاة الخلايا. بعد ذلك، استخدم ماصة دقيقة سعة 1 ml لنقل السائل المُرشح إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ml، ثم اشطف أنبوب C بـ 3 ml إضافية من الوسط الغذائي. انقل سائل الغسيل هذا عبر مصفاة الخلايا إلى أنبوب سعة 50 ml.

بعد ذلك، قم بتحريك النسيج غير المتجانس بلطف حول المصفاة باستخدام رأس ماصة نظيف سعة 1 milliliter لعصر أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي المحتبس في النسيج داخل أنبوب سعة 50 milliliter. الآن، ضع مصفاة الخلايا مقلوبة فوق الأنبوب C الأصلي واشطف المصفاة بـ 3 milliliters إضافية من الوسط بحيث يسقط النسيج غير المتجانس مرة أخرى في الأنبوب C. أعد تجنيس النسيج لدورتين إضافيتين كما تم توضيحه للتو، ثم صب هذا المتجانس الثاني عبر مصفاة الخلايا.

قم بشطف الأنبوب C مرة أخرى باستخدام ثلاثة مليلترات أخرى من الوسط. ثم قم بترشيح السائل الطافي عبر المصفاة واعصر السائل المتبقي من النسيج كما تم توضيحه للتو. في هذه المرحلة، يجب أن يكون هناك حجم يبلغ 2.5 مليلتر تقريباً من معلق الخلايا المفردة في أنبوب 15 مليلتر، ويجب ملاحظة وجود تسعة مليلترات تقريباً في أنبوب 50 مليلتر.

لفصل المادة الطافية للأنسجة عن الخلايا، ابدأ بطرد مركزي لأنبوبي المتجانس لمدة 15 دقيقة عند 600 Gs وفي درجة حرارة الغرفة، ثم صب المادة الطافية من الأنبوب سعة 15 milliliter في أنبوب سعة 1.5 milliliter، مع حفظه عند درجة حرارة أربعة درجات Celsius، وتخلص من المادة الطافية الموجودة في الأنبوب سعة 50 milliliter. بعد ذلك، قم بالنقر برفق على كل أنبوب فوق سطح صلب لتفتيت كتل الخلايا المترسبة. أعد تعليق كتلة الخلايا المفككة في الأنبوب سعة 50 milliliter باستخدام 500 microliters من الوسط، ثم انقل الخلايا إلى الأنبوب سعة 15 milliliter لإعادة تعليق الكتلة المترسبة الثانية.

بعد ذلك، اشطف الأنبوب سعة 50 milliliter بـ 500 microliters أخرى من الوسط، وانقل سائل الغسيل إلى الأنبوب سعة 15 milliliter لتحقيق أقصى استعادة للخلايا. وبعد عد عدد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد tripan blue، قم بترسيب معلق الخلايا. وأخيراً، قم بطرد السائل الطافي للأنسجة المحفوظ مركزياً.

بعد ذلك، انقل السائل الطافي بعناية إلى أنبوب نظيف واحد على الأقل دون لمس أو تحريك الراسب، وقم بتخزينه في درجة حرارة 80- درجة مئوية من أجل التحليلات اللاحقة. وتظهر هذه الرسوم البيانية مخططات نقطية ممثلة لتقنية قياس التدفق الخلوي لمجانسات الخلايا الورمية المفككة، تليها عملية الوسم بأجسام مضادة محددة ضد كريات الدم البيضاء وعلامات الخلايا الظهارية كما هو موضح. ولا يغير هذا البروتوكول بشكل كبير من حيوية الخلايا الموجبة لـ CD 45.

ومع ذلك، هناك فقدان ملحوظ للخلايا الحية الموجبة لـ EPAM. ورغم ذلك، يمكن فصل المجموعات الفرعية الحية الموجبة لـ EPAM والموجبة لـ CD 45 بناءً على حجمها وبنيتها إلى خلايا ورمية ظهارية كبيرة، أو خلايا ظهارية صغيرة، أو خلايا موجبة لـ CD 45 كبيرة وصغيرة. تظهر هنا مخططات نقطية ممثلة لقياس التدفق الخلوي للمجموعات الفرعية الرئيسية المرتشحة في الورم، مع تحديد بوابات الخلايا اللمفاوية بناءً على حيوية الخلايا الموجبة لـ CD 45.

أخيرًا، يمكن مقارنة تعبير السيتوكينات أو إجمالي الغلوبولين المناعي الموجود في طافي سرطان الثدي مع الطافي المستخلص من أنسجة الثدي الطبيعية، مما يكشف ــ كما هو موضح في هذه التجربة التمثيلية ــ عن زيادات في كلا النوعين من البروتينات المرتبطة بالأنسجة الورمية. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل بسرعة ودقة واستعادة أقصى كمية من المواد في كل خطوة من خطوات الإجراء للحصول على عدد كافٍ من الخلايا لتحليل نقطة النهاية الخاصة بك.