La correlación de Gene-específica de ADN de metilación cambios con la expresión y actividad transcripcional de astrocíticos

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el estado de metilación del ADN de KCNJ10 en una población enriquecida de astrocitos y correlacionar los cambios en la metilación del ADN del promotor con la actividad transcripcional opcional. Esto se logra primero aislado una población enriquecida de astrocitos corticales a partir del cerebro completo de roedores mediante clasificación FACS; luego, el ADN se aísla de la población enriquecida de astrocitos. A continuación, el estado de metilación del ADN de KCNJ10 se evalúa mediante análisis de fusión de alta resolución sensible a la metilación o MS.HRMA.

Finalmente, el promotor KCNJ10 está hipermetilado y se utiliza el ensayo de luciferasa para correlacionar los cambios en la metilación del ADN del promotor con la actividad transcripcional. En última instancia, MS.HRMA y el ensayo de luciferasa se emplean para medir el estado de metilación del ADN de KCNJ10 y correlacionar los cambios en la metilación del promotor con la actividad transcripcional del gen. Se mostrará el procedimiento. Una investigadora posdoctoral de mi laboratorio realizó todos los experimentos. Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las Guías de los Institutos Nacionales de Salud, y el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham aprobó el uso de animales.

Todos los tampones y reactivos se prepararon según el protocolo descrito en el texto. Después de diseccionar los cortices de la cabeza de un animal sacrificado, según el protocolo descrito en el texto, corte o use una dremel para hacer un orificio en la parte superior de un tubo cónico de 50 mililitros para permitir que el tubo pase al interior del recipiente. A continuación, agregue la solución de papaina al tubo.

Coloque los córtices disecados en una placa de cultivo de 10 milímetros que contenga medio de disociación equilibrado a 95%O2 y 5%CO2, y utilice una cuchilla limpia para picar el tejido en trozos de un milímetro por un milímetro. Con una pipeta de 10 mililitros, transfiera el tejido al tubo de 50 mililitros que contiene la solución de pepaina. Permita que el tejido se sedimente en el fondo de la pipeta de transferencia antes de expulsarlo.

Para minimizar la cantidad de medio de disociación arrastrado sin formar burbujas en la solución de pepane, aplique un flujo constante de 95% O₂ y 5% CO₂ mediante intercambio gaseoso en la superficie mientras incuba en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Después de la incubación, utilice una pipeta de transferencia de 10 mililitros para mezclar lentamente el tejido 10 veces, luego centrifugue la suspensión celular turbia a 300 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Equilibre la solución inhibidora de albúmina del ADN mediante intercambio gaseoso en la superficie y re suspenda las células en pelotón en tres mililitros de la solución.

Luego, prepare un gradiente de densidad discontinuo comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. Centrifugue el gradiente de densidad discontinuo a 70 G durante seis minutos. A continuación, aísle las células disociadas de la parte inferior del tubo utilizando una pipeta para aspirar el medio.

Utilice de dos a tres mililitros de DPBS con albúmina sérica bovina al 0,02 % y un miligramo por mililitro de ADN o medio preferido. Para reutilizar, suspenda las células disociadas. Pase las células a través de un filtro de 40 microgramos antes de realizar la clasificación por citometría y la extracción de ADN o ARN según el protocolo descrito en el texto.

Después de diseñar cebadores frente a una secuencia de ADN convertida con bisulfito y amplificar el ADN según el protocolo descrito, convierta con bisulfito de 500 a 1000 nanogramos de ADN de cada muestra y estándares de ADN metilado que varíen desde 0 hasta 100% de la misma especie animal utilizando una ADN polimerasa preferida y cebadores a cinco micromolares. Prepare reacciones de 20 microlitros para la amplificación por Ms HRM. Según esta tabla, ejecute todas las muestras, incluyendo ADN de control y estándares metilados, por triplicado dependiendo del software de análisis, y establezca los parámetros iniciales y finales antes y después de las transiciones de la curva de fusión.

Configure los parámetros de inicio del prederretido y final del prederretido, de modo que la diferencia entre ambos sea de 0,2 a 0,5 grados Celsius. Establezca de manera similar el inicio y final del posderretido y extraiga los datos de la diferencia de temperatura pico para cada muestra utilizando estándares de porcentaje de metilación y sus diferencias correspondientes de temperatura pico.

Genere una ecuación de regresión lineal. Utilice esta ecuación de regresión lineal para estimar el estado de metilación de muestras desconocidas tras identificar islas CPG de interés y amplificar y clonar la isla CPG Luke dos plásmido según el protocolo descrito en el texto. Utilice el software preferred cutter para verificar los sitios de digestión con enzimas de restricción y evitar cortes dobles, y linealice 30 microgramos de plásmido una vez que la muestra haya sido digerida con las enzimas adecuadas.

Inactive las enzimas por calor a la temperatura y duración adecuadas en reacciones de 50 microlitros. Utilice cinco unidades de metilasa CPG para metilar 700 microgramos de plásmidos linealizados a 30 grados Celsius durante 13 a 19 horas.

Después de purificar el ADN según se describe en el protocolo escrito, realice una digestión doble con HPA en muestras de un microgramo de ADN metilado incubando a 37 grados Celsius durante una hora. Después de purificar el ADN, corra las muestras en un gel de agarosa al 1 % a 100 voltios durante 45 minutos para su visualización. A continuación, someta los plásmidos metilados y no metilados a digestión doble con las enzimas de restricción apropiadas durante la noche para liberar el vector completo de Luke dos y los fragmentos de la isla CPG.

Inactive los enzimas por calor tras la digestión. Corra las muestras doblemente digeridas en un gel de agarosa al 1 % a 100 voltios durante una hora para separar el vector y el inserto; luego, mientras usa protección contra la luz UV, coloque el gel bajo luz negra y, con hojas quirúrgicas limpias, excave los insertos metilados y no metilados. Después de extraer el ADN según el protocolo descrito, use la ADN ligasa T4 y una relación de uno a cuatro de vector respecto al inserto para ligar los insertos metilados y no metilados en un vector no metilado. Incube a menos 20 grados Celsius o sobre hielo durante la noche tras la ligación.

Limpie el ADN y verifique la ligación nuevamente mediante la electroforesis de muestras en un gel de agarosa al 1% y evalúe la concentración del plásmido re-ligado. Siembre células CD54 en una placa de 12 pocillos a 140.000 células por pocillo. 24 horas después, utilice un reactivo de transfección comercial para transfectar las células con concentraciones iguales de cualquiera de los siguientes: plásmido CPG no metilado con bucle dos más RAN vanilla, u otro vector control ferroso, o plásmido CPG metilado con bucle dos más ELLA, u otro vector control luciferasa. Deje que las células se transfecten durante 24 horas antes de realizar un ensayo de luciferasa.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilice un luminómetro para leer cada pocillo por triplicado. Calcule la relación entre la actividad de la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa de vainilla o cualquier otro control. Actividad de las luciferasas.

Normalice la actividad de luciferasa de control de luciérnaga metilada respecto a la actividad de luciferasa de control de luciérnaga no metilada dividiendo la actividad metilada por la actividad de luciferasa metilada. Como se demuestra aquí, se obtuvo una población enriquecida de astrocitos mediante clasificación por FACS de animales transgénicos E-G-F-P-S 100 beta. Se seleccionó una población compuerta basándose en la dispersión directa y lateral, y se determinó una población de células viables utilizando un indicador de células muertas con bromuro; las compuertas mostradas aquí son imágenes representativas de astrocitos positivos para EGFP tras la disociación, pero antes del ordenamiento y también después del mismo. Esta figura muestra una población celular aislada positiva para EGFP que demostró un aumento de 40 veces en el ARNm del marcador específico de astrocito.

Una LDH por L uno. Además, a pesar de la expresión compartida de S-100 beta y OPCs NG dos positivos y astrocitos, se observó una reducción cuatro veces mayor en el ARNm de NG dos, un marcador para células precursoras de oligodendrocitos, lo que indica el aislamiento de una población celular astrocítica enriquecida. Esta tabla enumera el ARN y ADN totales, aislados de animales de diferentes edades y números variables, y se presenta como referencia para el rendimiento esperado de moléculas moleculares tras los hechos.

Finalmente, se utilizó un ensayo de luciferasa dual para evaluar la actividad transcripcional de las regiones hipermetiladas del gen de interés tras trasladar el inserto metilado a un vector no metilado. Se empleó HPA II, que digiere únicamente ADN no metilado, para verificar el estado de metilación del plásmido. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo aislar una población enriquecida de astrocitos utilizando FACS, así como de cómo medir la metilación del ADN de un gen y correlacionar los cambios en la metilación del ADN del promotor con la actividad transcripcional mediante análisis de fusión de alta resolución sensible a la metilación y ensayo de luciferasa, respectivamente.