La correlación de Gene-específica de ADN de metilación cambios con la expresión y actividad transcripcional de astrocíticos KCNJ10 (Kir4.1)

El objetivo general de este procedimiento es evaluar el estado de metilación del ADN de KCNJ 10 en una población enriquecida de astrocitos y correlacionar los cambios en la metilación del ADN del promotor con la actividad transcripcional opcional. Esto se logra aislando primero una población enriquecida de astrocitos corticales de todo el cerebro de un roedor a través de la clasificación de hechos: el ADN se aísla de la población enriquecida de astrocitos. Luego, el estado de metilación del ADN de KC J 10 se evalúa mediante el uso de un análisis de fusión de alta resolución o MS sensible a la metilación. HRMA.

Finalmente, el promotor KC J 10 está hipermetilado y se utiliza el ensayo de luciferes para correlacionar los cambios en la metilación del ADN del promotor con la actividad transcripcional. En última instancia, la MS. La HRMA y el ensayo de luciferasa se utilizan para medir el estado de metilación del ADN de KCNJ 10 y correlacionar los cambios en la metilación del promotor y la actividad transcripcional del gen. Como becario postdoctoral de mi laboratorio, todos los animales fueron manejados de acuerdo con las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud, el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham aprobó el uso de animales.

Todos los tampones y reactivos se prepararon de acuerdo con el protocolo de texto. Después de diseccionar las cortezas de la cabeza de un animal sacrificado, de acuerdo con el protocolo de texto, corte o haga un agujero en la parte superior de un tubo cónico de 50 mililitros para permitir que el tubo se introduzca en el tubo. Luego agregue la solución de papin al tubo.

Coloque las cortezas disecadas en una placa de cultivo de 10 milímetros que contenga un medio de disociación equilibrado a 95% de O2 a 5% de CO2, y use una hoja de afeitar limpia para picar el tejido en trozos de uno por milímetros cuadrados. Con una pipeta de 10 mililitros, los hombres transfieren el tejido al tubo de 50 mililitros que contiene la solución de pepano. Deje que el tejido se asiente en el fondo de la pipeta de transferencia antes de descargarlo.

Para minimizar la cantidad de medio de disociación arrastrado sin burbujear la solución de pepano, aplique un flujo constante de 95% de O2 a 5% de CO2 a través del intercambio de gases superficiales mientras incuba en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 20 minutos. Después de la incubación, utilice una pipeta de transferencia de 10 mililitros para tatear lentamente el tejido 10 veces y centrifugar la suspensión de células turbias a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Equilibrar la solución inhibidora de la albúmina del ADN mediante el intercambio de gases superficiales y resuspender las células peletizadas en tres mililitros de la solución.

A continuación, prepare un gradiente de densidad discontinuo comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. Gire el gradiente de densidad discontinuo a 70 G durante seis minutos. A continuación, aísle las células disociadas del fondo del tubo mediante el uso de una pipeta para aspirar los medios.

Utilice de dos a tres mililitros de DPBS con 0,02% de albúmina sérica bovina y un miligramo por mililitro de ADN o medio preferido. Para reutilizar, suspenda las células disociadas. Pase las células a través de un filtro de 40 microgramos antes de realizar la clasificación de hechos y la extracción de ADN o ARN de acuerdo con el protocolo de texto.

Después de diseñar cebadores contra una secuencia de ADN convertida en bisulfito y amplificar el ADN de acuerdo con el protocolo de texto mediante sulfito, convierta de 500 a 1000 nanogramos de ADN de cada muestra y patrones de ADN metilado que van de cero a 100% de la misma especie animal utilizando una ADN polimerasa preferida y cinco cebadores micromolares. Configure reacciones de 20 microlitros para la amplificación Ms HRM. De acuerdo con esta tabla, ejecute todas las muestras, incluidos los estándares de fax, ADN y metilados, por triplicado según el software de análisis establecido, los parámetros previos y posteriores al inicio y la parada alrededor de las transiciones de la curva de fusión.

Establezca los parámetros de fusión previa, inicio y finalización de la fusión previa. Por lo tanto, la diferencia entre ambos es de 0,2 a 0,5 grados centígrados. Establezca el post-fusión, el inicio y la parada de manera similar y extraiga datos de diferencia de temperatura máxima para cada muestra utilizando estándares de porcentaje metilado y sus correspondientes diferencias de temperatura máxima.

Genere una ecuación de regresión lineal. Utilice esta ecuación de regresión lineal para estimar el estado de metilación de muestras desconocidas después de identificar las islas CPG de interés y amplificar y clonar el plásmido Luke de la isla CPG dos de acuerdo con el protocolo de texto. Utilice el software de corte preferido para verificar los sitios de digestión de restricción para evitar cortes dobles y linealizar 30 microgramos de plásmido una vez que la muestra se haya digerido con las enzimas adecuadas.

El calor inactiva las enzimas a la temperatura y duración adecuadas en reacciones de 50 microlitros. Use cinco unidades de metilato de CPG para metilar. 700 microgramos de plásmidos linealizados a 30 grados centígrados durante 13 a 19 horas.

Después de limpiar el ADN como se describe en el protocolo de texto, realice una digestión de restricción HPA dos en muestras de un microgramo de ADN metilado incubando a 37 grados Celsius durante una hora. Después de limpiar el ADN, ejecute muestras en un gel de ADN al 1% a 100 voltios durante 45 minutos para su visualización. A continuación, plásmidos metilados y no metilados a doble digestión con enzimas de restricción apropiadas durante la noche para liberar los fragmentos de la isla de CPG y dos vectores Luke de longitud completa.

El calor inactiva las enzimas después de la digestión. Ejecute las muestras de doble digestión en un gel agros de ADN al 1% a 100 voltios durante una hora para separar el vector y el inserto, luego, mientras usa protección contra la luz ultravioleta, coloque el gel sobre una luz negra y con cuchillas quirúrgicas limpias, extirpe los insertos metilados y no metilados después de extraer el ADN en gel de acuerdo con el protocolo de texto, use T cuatro ADN ligasa y una proporción de uno a cuatro del vector a insertar para relegar las inserciones metiladas y no metiladas en un vector no metilado. Incubar a 20 grados centígrados bajo cero o en hielo durante la noche después de la ligadura.

Limpie el ADN y verifique la religación mediante el análisis de muestras en un gel de AROS al 1% de ADN y evalúe la concentración de células plasmídicas CD 54 religadas en una placa de 12 pocillos a 140.000 células por pocillo 24 horas después. Utilice un reactivo de transfección comercial para transfectar células con concentraciones iguales de bucle de CPG no metilado, dos plásmidos más RAN, vainilla u otro vector feroz de control o c pg Luke, dos plásmidos metilados más ELLA u otro vector de luciferes de control. Permita que las células transfecten durante 24 horas antes de realizar un ensayo de luciferes.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante, use el luminómetro para leer cada pocillo por triplicado. Calcule la relación entre la actividad de luciferes luciferes de lucifer y la vainilla corrida u otro control. La actividad de Lucifer.

Normalizar la actividad de la luciferasa de control de lucimosca metilada a la actividad de luciferasa de control de luciferasa no metilada dividiendo la actividad metilada por la actividad luc metilada. Como se demostró aquí, se adquirió una población enriquecida de astrocitos mediante la clasificación por fax de animales transgénicos E-G-F-P-S 100 beta. Se seleccionó una población cerrada en función de la dispersión frontal y lateral, y se determinó una población de células vivas utilizando un indicador de células muertas de bromuro y la compuerta se muestra aquí como imágenes representativas de astrocitos positivos para EGFP después de la disociación, pero antes de la clasificación, así como después de la clasificación, esta figura muestra una población de células positivas para EGFP aislada que demostró un aumento de 40 veces en el ARNm para el marcador específico de astrocitos.

A LDH uno L uno. Además, a pesar de la expresión compartida de S 100 beta y NG dos OPC positivos y astrocitos, se observó una reducción de cuatro veces en el marcador de NG dos ARNm A, para las células precursoras de oligodendrocitos, lo que indica el aislamiento de una población de células astrocíticas enriquecidas. Esta tabla enumera el ARN y el ADN totales, aislados de diferentes edades y número de animales, y se enumera como referencia para el rendimiento esperado de moléculas moleculares según los hechos.

Finalmente, se utilizó un ensayo de luciferes duales para evaluar la actividad transcripcional de las regiones hipermetiladas del gen de interés después de mover el inserto metilado a un vector no metilado. El HPA dos, que digiere solo el ADN no metilado, se utilizó para verificar el estado de metilación del plásmido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una población enriquecida de astrocitos utilizando hechos, así como cómo medir la metilación del ADN de un gen y correlacionar los cambios en la metilación del ADN del promotor con la actividad transcripcional utilizando el análisis de fusión de alta resolución sensible a la metilación y el ensayo de luciferasa, respectivamente.