Name: Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Aprende a analizar metilación del ADN y expresión génica en tejido cerebral específico de ratones sometidos a estrés temprano mediante separación materna. Este protocolo optimizado permite estudiar cambios epigenéticos en regiones anatómicamente definidas con muestras limitadas.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Max Planck de Psiquiatría y Marie de la Unión Europea Red de Curie de Formación Inicial (Contrato NINA 238 665).

1. Programación por la adversidad temprana de la vida Separación de la madre (EM) se lleva a cabo para inducir primeros años de vida el estrés (ELS) en las crías entregadas por los ratones C57BL/6N cronometrada embarazadas (después del día 0 (P0) en el día de nacimiento). <ol><li> Camadas individuales están colocados en jaulas limpias (con almohadilla térmica) durante 3 horas todos los días de P1-10. </li><li> Control (no-ELS), las crías permanecen inalteradas en el nido materno en todas partes. </li><li> Los cachorros se mantienen con sus madres hasta el destete (P21) después de lo cual se encuentra en grupos emparejados por sexo (3-5 ratones por jaula) en condiciones estándar de laboratorio de alojamiento de animales. </li></ol> 2. El aislamiento y la disección del tejido cerebral <ol><li> Los ratones mueren a edades más deseados por la dislocación del cuello uterino Nota:. Ya que este protocolo implica un paradigma de estrés, sin anestesia se administra antes de la dislocación cervical, para evitar interferir con la regulación fisiológica normal de las hormonas del estrés. Cráneos se abren ycerebros se retiran cuidadosamente e inmediatamente congelaron rápidamente por inmersión en hielo iso-pentano-seca, antes de ser almacenado a -80 ° C. </li><li> Los cerebros son cryosectioned (10 micras de espesor); secciones están montados sobre portaobjetos de vidrio Superfrost y se mantuvo a -20 ° C. La referencia a un estándar de ratón estereotáxica atlas (por ejemplo Paxinos 6) se utiliza para verificar la precisión anatómica y para garantizar la inclusión de la región de interés (por ejemplo, para las neuronas en el núcleo paraventricular - PVN - recoger las secciones que empiezan en el nivel de la rostral PVN, bregma -0,75 a -0,85). </li><li> Las secciones se tiñeron con violeta de cresilo para facilitar la identificación de las estructuras cerebrales diferentes. Punzones (0,8 mm) de las regiones de interés (por ejemplo NPV) se obtienen por microdisección en loco. </li></ol> 3. Extracción de ácidos nucleicos a partir de Golpes del cerebro Un protocolo optimizado para al mismo tiempo la extracción de ADN y el ARN de pequeño neuroanatómicamente definida registro cerebraliones para análisis de expresión génica y bisulfito se describe 7. Nota: Teniendo en cuenta que el ARN es menos estable que el ADN en el GTC-buffer, se recomienda el procesamiento del ARN en primer lugar. El homogeneizado utilizado para la purificación del ADN puede mantenerse a temperatura ambiente (TA) durante ese tiempo. <ol><li> Homogeneizar golpes utilizando una pipeta y vórtice en 400 l de tiocianato de guanidinio (GTC) tampón (4,5 M de tiocianato de guanidinio, 2% de N-lauroilsarcosina, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M de beta-mercaptoetanol, 0,2% antiespumante A) a temperatura ambiente, pasando varias veces a través de una jeringa hipodérmica (29G) (Figura 2). </li><li> Dividir lisado en partes iguales; tanto ARN y ADN puede ser extraído, al mismo tiempo o por separado, dependiendo de las necesidades particulares de experimentación. </li><li> Para la purificación del RNA añadir volumen 1/10 de NaOAc, 1 AquaPhenol volumen (Appligene) (pH 4) y el volumen 1/2 de cloroformo: isoamílico (24:1) para lisado. Vigorosamente en el vórtex después de cada paso yincubar en hielo durante 10 min, se centrifuga (20 min a 10.000 ga 4 ° C); añadir un volumen igual de 70% de EtOH a la fase aequous. </li><li> Transfiera la mezcla a una columna de giro de ARN (por ejemplo, Nucleospin II del RNA de Macherey-Nagel) y realizar los pasos en la columna DNasa digestión y lavado (seguir el protocolo del fabricante); eluyen RNA en 25 l de H 2 O. </li><li> Para la purificación del ADN de un protocolo optimizado de la Sangre Qiagen DNeasy Tissue Kit, y se utiliza. Equilibre el lisado con un volumen igual de tampón AL y 100% de EtOH, la carga en una centrífuga de columna de centrifugación (1 min a 10.000 g a temperatura ambiente) y deseche de flujo continuo. </li><li> Añadir 500 l tampón AW1 incluyendo 5 l RNasa (1 mg / ml) a la columna y se incuba 10 minutos a TA. Spin (1 min a 10.000 g, RT) y deseche de flujo continuo. </li><li> Lavar la columna con 500 l Buffer AW2, deseche el filtrado y centrifugado en seco columna vacía (1 min a 15.000 g). </li><li> Añadir precalentado (70 ° C) tampón AE y columnas incubar durante 10 min a 70 ° C. Eluir por centrifugación (1 minuto, 10.000 g), volver a aplicar el filtrado y repita el paso de la centrifugación. </li></ol> Utilizar un espectrofotómetro para determinar el ADN y las concentraciones de ARN. Un típico PVN punzón rendimientos ~ 600 ng de ADN y ARN ~ 400 ng. Para el análisis de la expresión de genes por PCR cuantitativa (qPCR), que suelen utilizar ~ 100 ng de ARN en la reacción de transcripción inversa. 4. Bisulfito de conversión Bisulfito de sodio se utiliza para convertir a los no metilados de citosinas uracilos. En contraste, citosinas metiladas están protegidos de la conversión. Por lo tanto, todas las citosinas que se detectan en la secuenciación final del bisulfito PCR amplicón representan citosinas metiladas. El bisulfito de conversión provoca la degradación del ADN sustancial que puede ser un factor limitante en el análisis de PCR. Optimizado condiciones de reacción que maximizan la conversión citosina, reducir la fragmentación del ADN y mantener una sola cadena de ADN incluso a temperaturas más bajas se puede lograr utilizandoKit de bisulfito de Epitect de Qiagen. En nuestras manos ~ 200 ng de ADN purificado de micropunches proporcionar una cantidad suficiente de material de partida para la reacción de bisulfito. Para evitar diferencias en la eficacia de la reacción de conversión, la cantidad de ADN molde debe mantenerse constante entre todas las muestras procesadas durante un experimento. Además, la secuencia se lee debe ser analizado para la eficiencia de conversión mediante el examen de la tasa de no-convertidos no CpGs. Esta tasa debería superar el 98%. Los valores más bajos indican la conversión de bisulfito incompleto o ineficiente y las secuencias subyacentes deben ser excluidos del análisis. 5. Bisulfito PCR <ol><li> Bisulfito de diseño cebadores de secuenciación que son específicos de ADN bisulfito convertido (véase la discusión); metilo software Primer Express ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ Es / EE.UU. / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602121) ayudará a esto y ayudar a determinar óptimas temperaturas de recocido en experiencias piloto. </li><li> Preparar PCR-Master-Mix (para una reacción) como sigue: 2,5 l tampón 10x PCR 0,5 l de 10 mM dNTPs 1 l de 10 mM Cebador 1 l 10 mM cebador inverso 0,125 l Qiagen Hotstart Taq Plus completar hasta 23 ml con H 2 O </li><li> Añadir 2 l bisulfito tratados con ADN de reacción. </li><li> Amplificar utilizando las siguientes condiciones: 1 ciclo de 6 min 95 ° C 45-50 ciclos de 1 min 95 ° C, 1 min a una temperatura óptima de recocido, 1 min 72 ° C Un ciclo de 5 minutos a 72 ° C </li></ol> Analizar 7 l de producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar el tamaño de la amplificación de la reacción y purificar restante de PCR para la posterior ligación con un disponible en el mercado de PCR kit de limpieza (por ejemplo, Macherey-NaNucleospin gel de extracto). En caso adicionales no deseados productos de PCR se obtienen, purificación en gel se recomienda. 6. La secuenciación de bisulfito De alta resolución perfiles de metilación del ADN se deducen de las lecturas solo clon puede detectar pequeños cambios en la metilación del ADN y la identificación de regiones reguladoras que responden al tratamiento (la programación del medio ambiente). El proceso de secuenciación de bisulfito se compone de tres pasos consecutivos de trabajo. En primer lugar, los productos de PCR obtenidos por bisulfito antes de PCR se ligó en un vector y se transforma en una bacteria. En segundo lugar, colonia PCR a partir de clones individuales se emplea para determinar el tamaño correcto del inserto. En tercer lugar, PCR positiva colonia se limpian y se someten a la reacción de secuenciación Big-Dye. Después de un paso de limpieza, productos se someten a electroforesis en un secuenciador capilar. 6.1 La ligadura y la Transformación Nota: Se utilizan de forma habitual el vector pGEM-T clcañoning kit (Promega). En nuestra experiencia, la eficiencia de la clonación depende críticamente de la inserción que se ligó. Vectores diferentes deben ser probados en el caso de un bajo número de clones recombinantes son repetidamente obtenido. <ol><li> Establecer reacción de ligación: 5 Buffer l Ligadura 2x 1 l vector pGEM-T 1 l de T4-ligasa 3 l limpiado en marcha del producto de PCR </li><li> Mezclar reacción pipeteando y se incuba durante la noche a 4 ° C. Nota: La ligación también puede llevarse a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente también. Para aumentar el número de clones recombinantes, sobre la ligadura de la noche a 4 ° C es la preferida. </li><li> La limpieza de productos de ligación por precipitación con etanol: <ol class="lalpha"><li> Añadir 1 l de glucógeno, 1 l NaAc 3M y 25 l de EtOH al 100% a la reacción de ligación y precipitado durante 1 minuto en nitrógeno líquido. </li><li> Centrífuga (15,0000 g durante 30 min a 4 ° C) y desechar el sobrenadante. </li><li> Lavar con 300 l70% de EtOH y se centrifuga (15.000 g durante 20 min a 4 ° C), desechar el sobrenadante y sedimento seco a temperatura ambiente (10 min). </li><li> Resuspender el precipitado en 10 l de H 2 O. </li></ol></li></ol> 6,2 Transformación de productos de ligación en bacterias electrocompetent <ol><li> Prerrefrigerar cubetas de electroporación (1 mm de ancho) en el hielo y el deshielo de parte alícuota de electrocompetentes DH5a bacterias en hielo. </li><li> Añadir 45 bacterias DH5a l a 10 l limpiado producto de ligación (véase más arriba) y transferir a la cubeta. </li><li> Transformar las bacterias a 1,5 kV, 200 Ω, 15 mF y añadir 1 ml de medio SOB precalentado directamente después de la entrega del pulso. </li><li> Recuperar bacterias durante 1 hora a 37 ° C, se extendió 100 l de suspensión en LB / ampicilina placas recubiertas con IPTG / X-Gal. </li><li> Incubar las placas durante la noche a 37 ° C. </li></ol> 6,3 colonia PCR Nota: la colonia PCR a partir de clones individuales se lleva a cabo para asegurar que los insertos sonde tamaño predicho. Retraso en el desarrollo del color de la investigación azul / blanco, los eventos no deseados de recombinación durante la ligadura, la incorporación de parejas de cebadores oligoméricos o truncados productos de PCR de lo contrario puede conducir a resultados erróneos de secuenciación. Habitualmente usamos cebadores T7 y SP6 para amplificar insertos clonados, este enfoque se traduce en secuencias de vectores adicionales de aproximadamente 150 pb. Cebador T7 se utiliza en la reacción de secuenciación en un paso posterior. <ol><li> Establecer la colonia reacción de PCR en placas de 96 pocillos. Para una reacción utilizar: 3 l 2,5 mM MgCl 2 2,5 l tampón 10x Taq 1,5 l de 10 mM dNTP 2 l 2,5 mM T7 cebador 2 l 2,5 mM SP6 cebador 1 l Fermentas Taq polimerasa llenar hasta 25 ml con H 2 O </li><li> Vierta 25 l / pocillo de mezcla maestra en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. </li><li> Elige positivo (blanco) en los clones de la placa con la punta de la pipeta y la inmersión en la reacción de PCR. </li><li> Amplificar utilizando FOLguientes condiciones: 1 ciclo de 4 min a 95 ° C 10 ciclos de 30 sa 94 ° C, 30 s a 56 ° C y 30 s a 72 ° C 30 ciclos de 30 sa 94 ° C, 30 s a 48 ° C y 30 s a 72 ° C Un ciclo de 5 min a 72 ° C </li><li> Cargar 5 l de colonia PCR sobre un gel de agarosa y determinar las reacciones que contienen el inserto de tamaño correcto. </li><li> PCR colonia que contiene los amplicones esperados se limpian utilizando un kit disponible comercialmente (Machery Nagel Nucleofast). </li></ol> 6.4 Big-Dye terminator reacción y la secuenciación <ol><li> Prepare la mezcla de Maestro de Big-Dye reacción. Para una reacción utilizar: 1 l de H 2 O 0,5 l Big-Dye reactivo 1.5 Secuencia de búfer l </li><li> Dispense 3 l / pocillo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, a cada pocillo añadir 2 l de colonia limpiado producto de PCR y ejecutar la reacción en un termociclador con los siguientes parámetros: 35 ciclos de 10 a 96 s ° C, 5 a 50 s ° C y 4 min a 60 ° C </li><li> La reacción de Big-Dye, se limpia utilizando un kit comercial (Millipore Montage 96 Secuenciación Clean-Up Kit) y se procesa en un secuenciador capilar (por ejemplo ABI 3100 DNA). </li><li> Las secuencias se analizaron con el analizador de BIQ ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) o la herramienta en línea BISMA ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) para derivar el patrón de metilación de la región de ADN investigado (Figura 4). </li></ol> 7. Los resultados representativos Para conocer mejor la influencia de ELS en la expresión de AVP y estado de metilación, los ratones C57BL/6N fueron procesadas según el flujo de trabajo se ha descrito anteriormente. Brevemente, un grupo de ratones fue C57BL/6N subjected a ELS, mientras que el grupo de control se quedó sin ser molestados. El PVN y el núcleo supraóptico (SON) fueron perforados y el ADN y el ARN se aislaron de forma simultánea desde los golpes simples. El ARN se transcribe inversa y los niveles de transcritos avp se midieron por análisis qPCR y normalizado para la expresión de los genes HPRT y Gapdh limpieza. ADN fue tratada bisulfito, amplificado con los cebadores específicos para el potenciador AVP (Figura 4a) y los productos de PCR fueron clonados y secuenciados. Al menos 20 clones recombinantes a partir de cada ratón / PCR se analizaron para determinar las frecuencias de metilación de los CpGs contenidas en la amplificación de PCR (Figura 4b). En comparación con los controles, ELS indujo una hipometilación significativo en CpG10, CpG12, CpG13 Cpg14 y potenciador de la AVP (p &lt;0.05, n = 6-8 animales) lo que sugiere epigenética marcado de esta región regulatorio a través de las primeras experiencias de la vida. En contraste con el PVN, la metilación deel potenciador Avp no fue afectada por ELS en la especificidad HIJO tejido que ilustra de epigenética marcado (Figura 4c). Análisis del estado de metilación de ADN en CpG10 y la expresión de genes Avp en los animales control (n = 6) se evidencia una correlación negativa que apunta a un papel de la metilación del ADN en el perfeccionamiento de la expresión del gen AVP (Figura 4d). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Micropunches Figura 1. Se obtienen a partir de cerebros disecados de control y principios de la vida los ratones estresados. Después de ADN y el aislamiento de ARN, la expresión génica está determinada por QRT-PCR mientras que el ADN bisulfito tratada es amplificada y productos purificados se clonó en un vector adecuado que permite la identificación de clones recombinantes por azul / blanco de selección. Tamaños correctos de inserción son verificadas porcolonia PCR antes de llevar a cabo Big-Dye reacción y el tratamiento en un secuenciador capilar. Patrón de metilación son visualizados por las herramientas de software adecuadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Figura 2. Línea de tiempo a partir del ADN / ARN de extracción para la secuenciación de bisulfito. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Figura 3. Flujo de trabajo para la extracción simultánea de ADN y ARN. El punzón del núcleo hipotalámico paraventricularis, un gen que expresa Avp pequeña región del cerebro, se coloca en 400 l tampón GTA, vortex hasta interrumpido y se homogeneiza más al pasar a través de una jeringa (29G). El homogeneizado se divide entonces para la purificación de ARN y ADN. La división puede ser de 1:1 o de diferentes proporciones, dependiendosobre la cuestión experimental particular. Los homogeneizados se debe procesar a las pocas horas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Figura 4. Metilación de CpG en el locus de control de la AVP en 6 semanas de edad y los animales ELS. (A) Esquema de la cola de los genes AVP y oxitocina orientada a la cola y separados por la región intergénica (IGR). Los exones son representados por abiertos (numerada) cajas. La distribución de los residuos CpG está indicada y el tamaño y la posición del respectivo amplificación de PCR que contiene CpG 10 a CpG14 está marcada por una línea gruesa. (B) La metilación del potenciador de AVP en el PVN en los animales control y ELS (n = 6-8). (C) La metilación del mejorador de la AVP en el Hijo en el control y los animales ELS (n = 8-10). (D) la expresión del gen se correlacionó Avpcon la metilación en CpG10 (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Programación epigenética es cada vez más reconocido como un importante mecanismo que subyace a la salud y la enfermedad. Aquí presentamos un método perfeccionado para el aislamiento simultáneo de ADN y ARN de micropunches y los pasos posteriores para obtener perfiles de metilación del ADN a través de la secuenciación de bisulfito. El flujo de trabajo optimizado permite el análisis práctico de la programación epigenética en el cerebro en respuesta a los estímulos ambientales. Por otra parte, este enfoque facilita la investigación de la relación funcional entre la metilación del ADN y la expresión de genes ya que ambos se analizan de la misma muestra. Finalmente, el número de animales necesarios para el experimento se puede reducir significativamente. Ciertas precauciones y directrices deben ser seguidas mientras se realiza el flujo de trabajo presentado. Considerando la extraordinaria complejidad y heterogeneidad del cerebro y desde patrón de metilación y expresión puede variar en una celda de manera específica de tejido y es de sumaimportancia que micropunching se realiza en una forma estandarizada. Como un ejemplo de ello, la programación epigenética de AVP es detectado en el paravaventriuclar, pero no en el núcleo supraóptico (Figura 4b-d), dos Avp expresando las regiones del hipotálamo 4. A este respecto, la disponibilidad de ADN y el ARN del punzón mismo tejido es ventajosa como la expresión del ARN de ciertos genes marcadores específicos de tejido se puede utilizar en algunos casos para certificar que el área correcta fue perforado. Aunque micropunching puede reducir la heterogeneidad celular, tiene que tenerse en cuenta que este enfoque no conduce al aislamiento de los tipos de células individuales o grupos. Los pasos adicionales de purificación puede ser considerado para hacer frente a este tema. Para la secuenciación de bisulfito primer diseño óptimo para el tratamiento de amplificación de PCR de bisulfito siguiente es esencial. Los productos PCR de más de 400 pb de longitud puede ser problemático debido a la degradación del ADN por el bisulfite tratamiento. Cabe señalar también que la PCR anidada puede dar resultados sesgados si sólo unas pocas plantillas intactas contribuir al proceso de amplificación. Pares de cebadores que son específicos para la amplificación modificada debe ser diseñado; sus secuencias no debe contener dinucleótidos CpG con el fin de evitar la metilación de polarización amplificación. Además, los cebadores deben contener no CpG citosinas para evitar la amplificación de ADN no modificado o convertidos incompletamente. La amplificación de algunas plantillas pueden beneficiarse de la realización de arranque en caliente de PCR. En cualquier caso, la idoneidad de parejas de cebadores deben ser verificada en experimentos piloto con el fin de prevenir el deterioro de valiosas muestras experimentales. Secuenciación bisulfito representa un método estándar para el análisis de metilación específica del sitio, ya que es capaz de detectar con fiabilidad y precisión la metilación de los residuos individuales CpG en una forma específica de alelo 8. La secuenciación directa del producto de PCR no se aconseja como metilación o mixtaFA residuos CpG aparece como un pico de C / T doble en el electroferograma, que puede impedir que la cuantificación de la metilación en el sitio en cuestión. Por esta razón un paso intermedio se lleva a cabo la clonación y varios clones se secuenciaron (~ 20-30) para determinar el grado de metilación. Pyrosequencing constituye un método alternativo para cuantificar la metilación del ADN. También utiliza conversión bisulfito y bisulfito PCR, pero en lugar de clonación y secuenciación del amplicón se somete a una reacción pirosecuenciación directa cuando se lee el estado de metilación de un residuo CpG como un C / T polimorfismo de un solo nucleótido que puede ser fácilmente cuantificado. Ambos métodos detectar niveles similares de metilación 9 pero dado que la clonación paso se puede omitir pirosecuenciación es más eficiente en el tiempo. Sin embargo, dependiendo de la plantilla de sólo 40-100 nucleótidos pueden ser secuenciados a la vez de manera que varias rondas de pirosecuenciación con cebador de secuenciación diferentes son necesarias. Esta es una limitación crítica, dado Thacantidades superiores t de ADN (aproximadamente 1 g por reacción) son necesarios, que previsible exceder las cantidades disponibles de diminutos golpes de tejido cerebral. Así, la digitalización inicial de las regiones en el intervalo de varias kilobases por pirosecuenciación aparece menos adecuado como lectura solo clon. Sin embargo, tras la identificación de una pequeña región de pirosecuenciación de interés debe ser considerado. En conjunto, el protocolo descrito anteriormente proporciona un enfoque preciso, eficiente y funcional para el análisis rápido y rentable de micropunches cerebro de los cambios epigenéticos. Múltiples muestras se pueden procesar en una única prueba y los métodos son adecuados cuando se ejecuta muestras de tamaño intermedio experimentos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sangre y DNeasy Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin II del RNA </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740,955.50 </td></tr><tr><td> Epitect Kit de bisulfito </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Extracto Nucleospin </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740,609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector de clonación de kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743,100.50 </td></tr><tr><td> Montaje de 96 Secuenciación de Limpieza </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> HotStar Taq Polimerasa </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq polimerasa </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

análisis optimizado de la metilación del adn y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

La exposición a la dieta, las drogas y la adversidad primeros años de vida durante las ventanas sensibles de la vida 1,2 puede dar lugar a cambios duraderos en la expresión de genes que contribuyen a la visualización de los fenotipos fisiológicos y de comportamiento. De programación del medio ambiente Tal es probable que aumente la susceptibilidad a las enfermedades metabólicas, cardiovasculares y mentales 3,4. Metilación del ADN y las histonas modificaciones se consideran los procesos clave en la mediación del diálogo gen-medio ambiente y también parecen subyacer programación del medio ambiente 5. En los mamíferos, la metilación del ADN comprende típicamente la adición covalente de un grupo metilo en la posición 5 de citosina en el contexto de dinucleótidos CpG. CpG metilación se produce en una forma altamente tejidos y células específicas por lo que es un desafío para estudiar regiones discretas, pequeñas del cerebro donde la heterogeneidad celular es alta y limita la cantidad de tejido. Por otra parte, bebido a la expresión de genes y la metilación están estrechamente vinculados eventos, mayor valor se puede obtener mediante la comparación de ambos parámetros en la misma muestra. En este caso, un protocolo de paso a paso (Figura 1) para la investigación de la programación epigenética en el cerebro se presenta utilizando el paradigma de la &quot;separación de la madre &#39;de la adversidad primeros años de vida con fines ilustrativos. El protocolo se describe la preparación de micropunches de cerebro de ratón diferencialmente en edad desde el cual el ADN y el ARN puede ser simultáneamente aisladas, permitiendo así metilación del ADN y análisis de expresión génica en la misma muestra.

Un flujo de trabajo simplificado para estudiar la metilación del ADN y los cambios de expresión génica a principios del estrés de la vida se muestra. A partir de la separación materna de los ratones recién nacidos y el aislamiento de los tejidos cerebrales discretas, que representan un protocolo para aislar al mismo tiempo el ADN y el ARN de golpes de tejido cerebral para la secuenciación de bisulfito y posterior análisis de RT-PCR.

Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

La exposición a la dieta, fármacos y adversidades en las primeras etapas de la vida durante periodos sensibles 1,2 puede provocar cambios duraderos en la expresión génica que contribuyen a ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el ADN. Los cambios en la metilación del ADN y en la expresión génica tras el estrés en la primera infancia. Esto se logra primero sometiendo a crías recién nacidas de ratón a separación materna para inducir estrés en la primera infancia; como segundo paso, se obtienen las áreas cerebrales de interés, en este caso el PVN, mediante microdisección in situ, y se aíslan simultáneamente ADN y ARN a partir de un único troquel de tejido.A continuación, el ADN obtenido se trata con sulfito y la región de interés se amplifica mediante PCR con bisulfito. Luego, esto se inserta en un vector y se transforma en bacterias. Las transformaciones exitosas se identifican mediante la expresión del marcador y el tamaño del fragmento de PCR.Y por último, la secuenciación de bisulfito se utiliza para evaluar el estado de metilación. La principal ventaja de este procedimiento es que permite un análisis conveniente de la programación epigenética en respuesta a estímulos ambientales. Este método puede proporcionar información sobre la programación epigenética provocada por adversidades en la primera infancia.También puede aplicarse a otros sistemas. Dondequiera que se analice la metilación y la expresión génica en un entorno altamente específico de tejido y donde la disponibilidad de tejido sea limitada para inducir estrés en la primera infancia. La separación materna se realiza en crías procedentes de hembras C 57 black six N preñadas con cronología controlada para provocar separación materna.Transfiera cada camada a una jaula limpia calentada durante tres horas diarias desde el primer hasta el décimo día posnatal; deje a las crías de control sin estrés sin perturbar. Aparte de la separación de tres horas, todas las camadas permanecen con sus madres hasta el destete en el día posnatal 21. Luego, las crías se alojan en grupos homogéneos por sexo, de tres a cinco ratones por jaula, en condiciones estándar de alojamiento. Para iniciar la recolección de tejido cerebral, los cerebros de los ratones se extraen de los cráneos y se congelan inmediatamente en isopentano sobre hielo seco y se almacenan a menos 80 grados Celsius.Cuando esté listo para recolectar los fragmentos de tejido, retire los cerebros del congelador a menos 80 grados y colóquelos sobre hielo seco. Comience por seccionar criogénicamente los cerebros en cortes coronales de 10 micrones de rostral a caudal. Monte los cortes sobre portaobjetos de vidrio super frosts y séquelos para la tinción con violeta de genciana.Se pueden tomar diapositivas adicionales y almacenarlas a menos 20 grados para análisis posteriores, como hibridación in situ. Cuando esté listo para obtener los fragmentos, tiña las diapositivas con violeta cresta para identificar las estructuras cerebrales de interés. Luego, utilizando una aguja de perforación, obtenga fragmentos de 0,8 milímetros de las regiones de interés mediante microdisección in loco.Los fragmentos deben almacenarse a menos 80 grados Celsius. Es de vital importancia que el microcorte se realice de manera estandarizada, ya que la expresión génica y la metilación son altamente específicas del tejido. Homogenice los fragmentos en 400 microlitros de tampón de tiocianato de guanidinio utilizando una pipeta y luego vortexee a temperatura ambiente.A continuación, pase el lisado resultante a través de una jeringa de calibre 29. Repita varias veces hasta que el punzón ya no sea visible. Divida el lisado en partes iguales.Uno para procesar ARN, que debe hacerse primero, y otro para procesar ADN, que puede almacenarse a temperatura ambiente hasta que se procese el ARN para la purificación de ARN con un décimo de volumen de acetato de sodio, un volumen de fenol acuoso y medio volumen de cloroformo:isoamil alcohol (24:1). Agitar vigorosamente la mezcla tras cada adición e incubar la mezcla final en hielo durante 10 minutos. Luego, centrifugar la mezcla.Recolecte la fase acuosa y añádale un volumen igual de etanol al 70%. Utilizando un kit de columna de centrifugación para ARN, realice una digestión de ADN en columna y lave para luego eluir el ARN en 25 microlitros de agua.Ahora purifique el ADN utilizando un protocolo de kit modificado para incluir la adición de una digestión con RNasa, y para calentar el tampón de elución y la columna de elución a 70 grados Celsius antes de su uso. Son suficientes 10 minutos a 70 grados Celsius para las columnas. Finalmente, utilice un espectrofotómetro para determinar las concentraciones de ADN y ARN.Un troquelado típico del NPM produce aproximadamente 600 nanogramos de ADN y unos 400 nanogramos de ARN apartados, de los cuales unos 100 nanogramos de ARN se destinan al análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa antes de la amplificación mediante sulfito. Trate 200 nanogramos del ADN aislado con un kit disponible comercialmente para amplificar el ADN procedente de regiones metiladas. Encargue cebadores diseñados específicamente para ADN convertido con bisulfito. Un diseño óptimo de cebadores en la PCR con bisulfito es esencial, ya que la calidad y especificidad del amplicón de PCR determinan el éxito de los pasos siguientes.Cuando lleguen los cebadores, determine su temperatura óptima y de hibridación mediante experimentos piloto. Utilice dos microlitros de ADN tratado con bisulfito como molde para cada mezcla de PCR de 25 microlitros.Aumente la mezcla comenzando con una desnaturalización de seis minutos a 95 grados Celsius, seguida de 45 a 50 ciclos de amplificación antes de una elongación final de cinco minutos a 72 grados Celsius. Analice siete microlitros del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa para verificar el tamaño del amplicón. Purifique el producto restante de PCR para la ligación posterior utilizando un kit de limpieza de PCR disponible comercialmente.Si se obtienen productos de PCR no deseados, utilice la purificación en gel para aislar el producto de interés para este protocolo. Se emplea un kit comercial de clonación. La eficiencia de clonación depende críticamente del inserto.Por lo tanto, si se obtienen repetidamente bajos números de clones recombinantes, pruebe con un vector de clonación diferente. Prepare una reacción de ligación de 10 microlitros con un microlitro de vector y tres microlitros de producto de PCR purificado. Mezcle la reacción mediante pipeteo e incúbele toda la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente.Depure la reacción de ligación mediante precipitación clásica con etanol y transforme las bacterias con el producto. Añada un mililitro de medio SOB precalentado directamente después de la aplicación del pulso y transfiera las bacterias transformadas a un tubo de reacción. Después de recuperar las bacterias durante una hora a 37 grados Celsius, siembre 100 microlitros de cada suspensión en una placa de LB con ampicilina recubierta con IPTG.Incube las placas durante la noche una vez que las colonias puedan ser seleccionadas. Prepare reacciones de PCR de colonia de 25 microlitros en una placa de 96 pocillos utilizando tres microlitros de cloruro de magnesio 2,5 milimolar en cada reacción. Seleccione los clones blancos positivos con la punta de una pipeta y transfiera a una mezcla de PCR con una simple inmersión.Comience la PCR con un ciclo de desnaturalización de cuatro minutos. A continuación, realice 10 ciclos de amplificación con una temperatura de hibridación de 56 grados Celsius. Cada paso de estos ciclos dura 30 segundos.Luego, disminuya la temperatura de recocido a 48 grados Celsius durante 30 ciclos adicionales de amplificación. Finalice con un ciclo de elongación de cinco minutos. Ahora, cargue cinco microlitros de cada producto en un gel de aros e identifique las reacciones que contienen el inserto de tamaño adecuado.Utilice un kit disponible comercialmente para purificar los productos de PCR de interés, de modo que puedan ser secuenciados mediante la técnica de terminación con colorante (big dye terminator). En una placa de 96 pocillos, cargue los pocillos con tres microlitros de la mezcla maestra de reacción big DI, seguidos de dos microlitros del producto de PCR de colonia purificado. Ejecute la reacción en un termociclador comenzando con un minuto a 96 grados Celsius, seguido de 35 ciclos de 10 segundos a 96 grados Celsius, cinco segundos a 50 grados Celsius y cuatro minutos a 60 grados Celsius.Después de finalizar la reacción de bisulfito, purifique la reacción utilizando una placa de purificación para reacciones de bisulfito. Después de obtener las secuencias, analícelas mediante la herramienta en línea big analyzer o la herramienta B-I-S-M-A para determinar el patrón de metilación de la región de ADN estudiada y obtener información sobre la influencia del estrés temprano en la vida o ELS en la expresión y el estado de metilación de VP. Se procesaron ratones C57BL/6 según el protocolo descrito; se microdisectaron el núcleo paraventricular y el núcleo supraóptico para aislar ADN, el ADN-RNA fue tratado con bisulfito, amplificado con cebadores específicos para el potenciador de VP y los productos de PCR fueron clonados y secuenciados, analizando al menos 20 clones recombinantes de cada ratón.Se analizó la PCR para determinar las frecuencias de metilación de los CPG incluidos en el amplicón de PCR en tejido de la P-V-N-E-L-S, que indujo una hipometilación significativa en cuatro ubicaciones del potenciador de A VP, lo que sugiere una marca epigenética en esta región reguladora a través de experiencias en la primera infancia. En contraste con la PVN, la metilación del potenciador de A VP no se vio afectada por ELS en el SON, lo que ilustra la especificidad tisular del efecto epigenético en animales control. El estado de metilación del ADN en el CPG 10 se correlacionó negativamente con la expresión del gen VP, lo que indica un papel de la metilación del ADN en el ajuste fino de la expresión génica de VP. Tras seguir este procedimiento, otros métodos como la UPCR pueden realizarse fácilmente con el ARN aislado para responder preguntas adicionales, como los cambios en la expresión génica en el tejido analizado.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar los cambios en la metilación del ADN en respuesta a estímulos dependientes del entorno o de experiencias.

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