Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el ADN. La metilación y los cambios en la expresión génica tras el estrés en los primeros años de vida. Esto se logra sometiendo primero a las crías de ratón recién nacidas a la separación materna para inducir el estrés temprano en la vida como segundo paso, las áreas de interés del cerebro aquí, el PVN se obtienen por microdisección in loco y el ADN y el ARN se aíslan simultáneamente de un solo punzón de tejido.

A continuación, el ADN obtenido se trata con sulfito y la región de interés se amplifica mediante PCR de bisulfito. A continuación, se liga en un vector y se transforma en bacteria. Las transformaciones correctas se identifican por la expresión del marcador y el tamaño del fragmento de PCR.

Y, por último, la secuenciación de bisulfuro se utiliza para evaluar el estado de metilación. La principal ventaja de este flujo de trabajo es que permite un análisis conveniente de la programación epigenética en respuesta a estímulos ambientales. Este método puede proporcionar información sobre la programación epigenética por la adversidad de la vida temprana.

También se puede aplicar a otros sistemas. Dondequiera que se analice la metilación y la expresión génica en un entorno altamente específico de tejido y donde la disponibilidad de tejido sea limitada para inducir estrés en los primeros años de vida. La separación materna se realiza en crías de madres C 57 negras seis N preñadas cronometradas para afectar la separación materna.

Transfiera cada camada a una jaula limpia y con calefacción durante tres horas diarias, desde el primer día postnatal hasta el 10, deje a los cachorros de control sin estrés sin molestar. Aparte de las tres horas de separación, todas las camadas se quedan con sus madres hasta el destete el día 21 postnatal. Luego, los cachorros se alojan en grupos emparejados por sexo, de tres a cinco ratones por jaula en condiciones de alojamiento estándar para iniciar la recolección de tejido cerebral, los cerebros de los ratones se extraen de los cráneos e inmediatamente se congelan en hielo seco y se almacenan a menos 80 grados centígrados.

Cuando esté listo para recoger los punzones de pañuelo, retire los sesos del congelador a menos 80 grados y póngalos en hielo seco. Comience criseccionando los cerebros en secciones coronales de 10 micras, desde el rostral hasta el mimón. Monta las secciones en portaobjetos de vidrio súper escarchados y sécalas para teñirlas de color violeta cresta.

Se pueden tomar portaobjetos adicionales y almacenarlos a menos 20 grados para análisis posteriores, como la hibridación in situ dos. Cuando esté listo para recibir golpes, tiña los portaobjetos con violeta crestal para identificar las estructuras cerebrales de interés. A continuación, con una aguja de perforación, realice punzones de 0,8 milímetros de las regiones de interés mediante microdisección in loco.

Los punzones deben almacenarse a menos 80 grados centígrados. Es de vital importancia que el micropunzonado se realice de manera estandarizada, ya que la expresión génica y la metilación son altamente específicas de los tejidos. Homogeneizar los punzones en 400 microlitros de tampón de tiocianato de qadio utilizando una pipeta y luego vórtice a temperatura ambiente.

A continuación, pase el lisado resultante a través de una jeringa de calibre 29. Varias veces el puñetazo ya no debería ser visible. Divide el lisado en partes iguales.

Uno para procesar el ARN, que debe hacerse primero y el otro para procesar el ADN, que puede almacenarse a temperatura ambiente hasta que el ARN se procesa para la purificación del ARN a un décimo volumen de acetato de sodio, un volumen de aguafenol y medio volumen de 24 a un cloroformo a un vórtice de AML de isoamilo. Mezcle vigorosamente después de cada adición e incube el brebaje final en hielo durante 10 minutos. A continuación, centrifuga la mezcla.

Recoja la fase acuosa y agréguele un volumen igual de 70% de etanol. Usando un kit de columna de centrifugación de ARN. Realizar una digestión del ADN en columna y lavar el ARN en 25 microlitros de agua.

Ahora purifique el ADN utilizando un protocolo de kit modificado para incluir la adición de la digestión de un RN a, y para calentar el tampón elucian y la columna eluciana a 70 grados Celsius antes de su uso. 10 minutos a 70 grados Celsius son suficientes para las columnas. Por último, utilice un espectrofotómetro para determinar las concentraciones de ADN y ARN.

Un punzón típico de PVN produce alrededor de 600 nanogramos de ADN y alrededor de 400 nanogramos de AR reservados, alrededor de 100 nanogramos de ARN para el análisis de expresión génica por PCR cuantitativa antes de la amplificación por sulfito. Trate 200 nanogramos del ADN aislado con un kit disponible comercialmente para amplificar el ADN de las regiones metiladas. Pida cebadores diseñados específicamente para el ADN convertido en bisulfito El diseño óptimo del cebador en bi PCR es esencial, ya que la calidad y la especificidad del amplicón de PCR determinan el éxito de los siguientes pasos.

Cuando lleguen los cebadores, determine su temperatura óptima y de rodillas con experimentos piloto. Utilice dos microlitros de ADN tratado con sulfito bis como molde por cada 25 microlitros. Mezcla de PCR.

Amplifique la mezcla comenzando con una desnaturalización de seis minutos a 95 grados Celsius, seguida de 45 a 50 ciclos de amplificación antes de una elongación final de cinco minutos a 72 grados Celsius. Analice siete microlitros del producto PCR mediante electroforesis en gel Agros para verificar el tamaño del amplicón. Purifique el producto de PCR restante para la ligadura posterior utilizando un kit de limpieza de PCR disponible en el mercado.

Si se obtienen productos de PCR no deseados, utilice la purificación en gel para aislar el producto de interés para este protocolo. Se emplea un kit de clonación comercial. La eficiencia de la clonación depende fundamentalmente de la plaquita.

Por lo tanto, si se obtiene repetidamente un número bajo de clones recombinantes, pruebe con un vector de clonación diferente. Configure una reacción de ligadura de 10 microlitros con un microlitro de vector y tres microlitros de producto de PCR limpio. Mezclar la reacción por pipeteo e incubarla durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente.

Limpie la reacción de ligadura mediante la precipitación clásica de etanol y transforme las bacterias con el producto. Agregue un mililitro de medio SOB precalentado directamente después de la entrega de pulsos y transfiera las bacterias transformadas a un tubo de reacción. Después de recuperar las bacterias durante una hora a 37 grados centígrados, esparce 100 microlitros de cada suspensión en una placa de ampicilina LB recubierta con IPTG.

Los xal incuban las placas durante la noche una vez que se pueden recoger las colonias. Configure 25 reacciones de PCR de colonias de microlitros en una placa de 96 pocillos utilizando tres microlitros de cloruro de magnesio de 2,5 milimolares en cada reacción. Elija clones blancos positivos con una punta de pipeta y transfiéralos a una mezcla de PCR con una simple inmersión.

Comience la PCR con un ciclo de fusión de cuatro minutos. Siga con 10 ciclos de amplificación con una temperatura de 56 grados centígrados. Cada paso de estos ciclos es de 30 segundos.

Luego disminuya la temperatura de fermentación a 48 grados Celsius durante 30 ciclos de amplificación más. Termina con un ciclo de elongación de cinco minutos. Ahora cargue cinco microlitros de cada producto en un gel aros e identifique las reacciones que contienen el inserto del tamaño adecuado.

Utilice un kit disponible en el mercado para limpiar los productos de PCR de interés, de modo que se puedan secuenciar mediante la secuenciación cíclica de terminación de tinte grande. En una placa de 96 pocillos, los pocillos cargan con tres microlitros de mezcla maestra de reacción DI grande, seguidos de dos microlitros de producto PCR de colonia limpia. Ejecute la reacción en un termociclador comenzando con un minuto a 96 grados Celsius, seguido de 35 ciclos de 10 segundos a 96 grados Celsius, cinco segundos a 50 grados Celsius y cuatro minutos a 60 grados Celsius.

Una vez finalizada la reacción de la matriz grande, limpie la reacción con una placa de purificación de matriz grande. Después de obtener las secuencias, analícelas utilizando el gran analizador en línea o la herramienta B-I-S-M-A para derivar el patrón de metilación de la región de ADN investigada para obtener información sobre la influencia del estrés de la vida temprana o ELS en la expresión de VP y el estado de metilación. Se procesaron 57 palos negros y ratones de acuerdo con el protocolo descrito, se perforó el núcleo paraventricular y el núcleo supraóptico para aislar el ADN y se trató con bisulfito R-N-A-D-N-A, se amplificó con cebadores específicos para el potenciador VP y se clonaron los productos de PCR y se secuenciaron al menos 20 clones recombinantes de cada ratón.

Se analizaron las PCR para determinar las frecuencias de metilación de las GPC contenidas en el amplicón de PCR en el tejido de la P-V-N-E-L-S inducida por una hipometilación significativa en cuatro ubicaciones del potenciador A VP, lo que sugiere un marcado epigenético de esta región reguladora a través de experiencias de vida tempranas. En contraste con la metilación de PVN del potenciador A VP que no se vio afectada por ELS en el SON, lo que ilustra la especificidad tisular del efecto epigenético en animales control, el estado de metilación del ADN en CPG 10 se correlacionó negativamente con la expresión de un gen VP, lo que apunta a un papel de la metilación del ADN en el ajuste fino de la expresión génica de VP. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar fácilmente otros métodos como el UPCR en el ARN aislado para responder a preguntas adicionales como los cambios en la expresión génica en el tejido analizado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar los cambios en la metilación del ADN en respuesta a estímulos ambientales o dependientes experimentados.