Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa

El objetivo general de este procedimiento es electrohilasar un andamio tridimensional bifásico, lo que permite el cultivo conjunto de células humanas adultas completamente diferenciadas con el fin de replicar la matriz extracelular natural que estas células encuentran en C dos. Esto se logra primero mediante la electrospun, un andamio de microfibras alineadas al azar. El segundo paso consiste en formar un andamio bifásico mediante la electrospun de una capa de nanofibras alineadas al azar directamente sobre el andamio de microfibras.

A continuación, se electrohilaza un andamio de nanofibras alineadas por separado. El paso final consiste en sembrar cada andamio con su tipo celular respectivo y co-cultivar los andamios en un sistema de biorreactor perfundido como un único constructo. En última instancia, las interacciones multicelulares pueden analizarse mediante la medición de la liberación de mediadores y la inmunotinción.

El constructo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las membranas transformadas en 2D es que los andamios eléctricos proporcionan un entorno fibroso tridimensional que puede adaptarse para ofrecer una morfología fisiológicamente relevante. Es una estructura más porosa y permite el cultivo central de múltiples tipos celulares.

Este método proporciona una plataforma estable utilizando células humanas cohortes, enfermas o sanas como modelo in vitro. Esto ayudará a reducir nuestra dependencia de los modelos animales, que tienen limitaciones en cuanto a su relevancia para las enfermedades humanas, y disminuirá el número de animales utilizados en experimentación. Aunque este método puede ofrecer información sobre enfermedades como el asma y la EPOC, también puede aplicarse a otros sistemas, por ejemplo, para el estudio de enfermedades inflamatorias del intestino o para el desarrollo de un modelo de piel destinado a pruebas químicas.

Para comenzar, prepare tres soluciones diferentes de PET de 10 mililitros disolviendo 8%, 10% y 30% de PET en mezclas uno a uno de clorometano y ácido tricloroacético. Agite las soluciones durante la noche a temperatura ambiente para disolver el PET al día siguiente. Transfiera las soluciones de PET a jeringas y coloque una aguja de calibre 23 en la jeringa que contiene la mezcla al 8% y agujas de calibre 18 en las otras dos jeringas que contienen las soluciones de PET al 10% y al 30%.

Prepare el andamio de microfibra. Primero, cargue la jeringa que contiene la solución de PET al 30 % en la bomba de jeringa con la punta de la aguja en la parte inferior. Coloque el tambor a 15 centímetros de la punta de la aguja y asegúrese de que la aguja apunte al centro del tambor.

Conecte la línea de alimentación eléctrica positiva a la punta de la aguja utilizando un clip cocodrilo metálico y conecte a tierra el colector conectando la línea de tierra al conector banana. Encienda el motor y ajuste la velocidad del colector a 60 RPM. Encienda la bomba de jeringa para proporcionar un caudal de 2,0 mililitros por hora.

Mientras se crean los andamios de microfibras, deje que la bomba funcione hasta que la solución sea extruida desde la punta de la aguja para cebra el sistema y eliminar cualquier aire presente en la aguja. Luego detenga la bomba del bomba de jeringa.

Establezca el volumen total de la solución que se va a expulsar en dos mililitros e inicie la bomba. A continuación, aplique un potencial de 14 kilovoltios entre la aguja y el mandril para realizar la electrospinning durante una hora, hasta que se hayan electrohilado dos mililitros de la solución de PET al 30%, con el andamio de microfibras aún sobre el mandril; luego, apague el potencial eléctrico. Retire la pinza cocodrilo y sustituya la jeringa que contiene la solución de PET al 30% por la jeringa que contiene la solución de PET al 8%.

Luego, reconecte la pinza cocodrilo a la aguja de calibre 23. Cambie el caudal de la bomba de jeringa a 0,5 mililitros por hora y purgue la aguja haciendo funcionar la bomba de jeringa hasta que la solución fluya por la punta. Mientras el mandril continúa girando a 60 RPM, aplique el potencial de 14 kilovoltios entre la punta de la aguja y el mandril, y establezca el volumen total que debe extruirse por la bomba de jeringa en dos mililitros.

Electrohilado durante cuatro horas hasta que se hayan electrohilado dos mililitros de la solución de PET al 8%. Cuando el electrohilado esté completo, apague la fuente de alimentación y el motor que hace girar el mandril. Corte el andamio bifásico con una hoja a lo ancho del mandril para producir una lámina bidimensional del andamio del tamaño del área superficial del mandril.

Para preparar andamios de PET alineados, cargue la jeringa que contiene la solución de PET al 10 % en la bomba de jeringa con la punta de la aguja en la parte inferior. Luego, conecte el clip cocodrilo a la aguja. Establezca un caudal de 0,5 mililitros por hora y purgue la aguja con la solución de PET.

Luego encienda el motor y ajuste la velocidad de giro del mandril a 2000 RPM. A continuación, encienda la bomba de jeringa. Establezca la fuente de voltaje en 14 kilovoltios y active la fuente de alimentación para el electrohilado durante cuatro horas hasta que se hayan electrohilado dos mililitros de solución.

Una vez finalizado el electrohilado, apague la fuente de alimentación y el motor. Corte el andamio con una hoja a lo ancho del mandril para producir una lámina bidimensional de andamio alineado. Almacene los andamios electrohilados en papel de aluminio para reducir la carga electrostática.

Utilice un punzón de biopsia de 0,8 milímetros de diámetro para extraer discos de andamios bifásicos o alineados de las láminas de SPU. Luego, pegue el disco del andamio bifásico a una junta utilizando pegamento no tóxico para acuarios. Coloque las juntas y los andamios en una placa de cultivo celular de 12 pocillos.

Sterilice las juntas y los andamios utilizando radiación ultravioleta tipo I durante 30 minutos por cada lado de los andamios. A continuación, sumérjalos en una solución antibiótico antimicótica al 20 % durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Lave los andamios con PP S tres veces y almacénelos en PBS a cuatro grados Celsius hasta su uso.

Transfiera los andamios bifásicos desde el PBS a una nueva placa de 12 pocillos y caliéntelos en medio DMEM suplementado con 10 % FCS durante una hora a 37 grados Celsius. Retire el medio DMEM suplementado y coloque la fase de microfibras de los andamios; siembre 15.000 células de fibroblastos MRC-5 en 30 microlitros de medio DMEM suplementado sobre cada andamio para ayudar a que los fibroblastos penetren en el andamio. Coloque la placa sobre un agitador orbital y agite los andamios a 100 rpm durante dos horas.

Luego, agregue dos mililitros de medio DMEM suplementado a cada andamio e incube los andamios durante la noche a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, retire el medio de los pocillos y dé la vuelta a los andamios para que la fase de nanofibras de los andamios quede orientada apicalmente. A continuación, siembre 30.000 células epiteliales Cali tres en 30 microlitros de medio D-M-E-M-F 12 suplementado con 10% de FCS sobre la fase de nanofibras del andamio.

Incube el andamio durante dos horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono antes de sumergir los andamios en una mezcla 70:30 de D-M-E-M-F 12 y medio DMEM suplementado y continuar con la incubación estática durante 12 horas adicionales para cultivar las células de músculo liso de la vía aérea. En primer lugar, transfiera los andamios alineados desde el PBS a una placa nueva de 12 pocillos y caliente los andamios y el medio DMEM suplementado durante una hora a 37 grados Celsius. Retire el medio DMEM suplementado y agregue 25.000 células de músculo liso de la vía aérea en 30 microlitros de medio DMEM suplementado a cada andamio e incube durante dos horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Una vez fijados, sumerja los andamios en medio DMEM suplementado. Devuélvalos al incubador y déjelos durante la noche antes de establecer un cultivo tricelular en el biorreactor. Al día siguiente, coloque el andamio sembrado bifásico en la cámara del biorreactor con la fase epitelial orientada hacia arriba, dentro de la cámara.

Luego, coloque el andamio alineado debajo del andamio bifásico de manera que quede adyacente a la fase de microfibras del andamio bifásico. Bloquee las dos cámaras del biorreactor juntas. A continuación, ensamble dos circuitos de flujo de perfusión dentro de una incubadora según se describe en el protocolo de texto adjunto y bombee medio a través de los dos circuitos a aproximadamente 0,1 mililitros por minuto utilizando una bomba peristáltica después de una semana.

Retire el medio del compartimento apical y cultive. Las células epiteliales en la interfase aire-líquido durante una semana adicional antes del análisis, tras dos semanas en el biorreactor. El andamio de tricultivo mostrado aquí fue fijado y seccionado para mostrar núcleos celulares distribuidos a través de las tres capas del constructo; los núcleos celulares fueron teñidos con DAPI y aparecen azules, mientras que el material del andamio aparece gris. A continuación se muestran imágenes de microscopía electrónica de barrido de los andamios de nanofibras y microfibras electrospray y alineados, preparados para sembrar células epiteliales, fibroblastos y células musculares lisas, respectivamente.

Los tres tipos de células mostraron un aumento en viabilidad cuando se cultivaron sobre sus andamios individuales durante un período de dos semanas. Cada uno también continuó expresando proteínas específicas del tipo celular tras el período de cultivo de dos semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar investigar la matriz extracelular nativa que se intenta recrear con las fibras electrostáticas.

Las células se comportarán de manera diferente al adherirse a distintas topografías 3D. Por ejemplo, las células epiteliales solo formarán una barrera funcional cuando se cultiven sobre nanofibras. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo construir un sistema de co-cultivo multicapa, que puede utilizarse para el estudio de las interacciones intercelulares dentro de un entorno de cultivo dinámico.

No olvide que es importante ajustar los parámetros de electrohilado, como la velocidad de flujo y el voltaje, según el polímero y el sistema disolvente que pretenda utilizar durante este procedimiento. Esto es crucial para generar las fibras deseadas. Además, recuerde realizar el electrohilado en una campana o armario ventilado para permitir la extracción adecuada de los disolventes.