Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa In Vitro Modelo de la pared de la vía aérea

El objetivo general de este procedimiento es electro girar un andamio fásico tridimensional, lo que permite el cocultivo de células humanas adultas completamente diferenciadas con el fin de replicar la matriz extracelular natural que estas células encuentran en C dos. Esto se logra mediante el primer electrohilado, un andamio de microfibra alineado aleatoriamente. El segundo paso es formar un andamio bifásico mediante electrohilado de una capa de nanofibras alineada aleatoriamente directamente sobre el andamio de microfibra.

A continuación, se hace girar un andamio de nanofibras alineado por separado. El paso final es sembrar cada andamio con su respectivo tipo de célula y cocultivar los andamios en un sistema de biorreactor profuso como una sola construcción. En última instancia, las interacciones multicelulares se pueden analizar a través de la medición de la liberación de mediadores y la inmunotinción.

El constructo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las membranas transformadas en 2D, es que los andamios eléctricos proporcionan un entorno fibroso en 3D que se puede adaptar para proporcionar una morfología fisiológicamente relevante. Es una estructura más porosa y permite el cultivo central de múltiples tipos de células.

Este método proporciona una plataforma estable utilizando células humanas en cohortes, enfermas o sanas como modelo in vitro. Esto ayudará a reducir nuestra dependencia de los modelos animales, que tienen una limitación en su relevancia para las enfermedades humanas, y disminuirá el número de animales utilizados en la experimentación. Aunque este método puede proporcionar información sobre enfermedades como el asma y la EPOC, también se puede aplicar a otros sistemas, como para el estudio de enfermedades inflamatorias del intestino o para el desarrollo de un modelo de piel para pruebas químicas.

Para comenzar, prepare tres soluciones diferentes de PET de 10 mililitros disolviendo 8%10% y 30%PET en mezclas uno a uno de clorometano y ácido tricloroacético. Revuelva las soluciones durante la noche a temperatura ambiente para disolver el PET al día siguiente. Transfiera las soluciones de PET a jeringas y coloque una aguja de calibre 23 en la jeringa que contiene la mezcla al 8% y agujas de calibre 18 en las otras dos jeringas que contienen las soluciones de PET al 10% y al 30%.

Prepara el andamio de microfibra. Primero, cargue la jeringa que contiene la solución de PET al 30% en la bomba de jeringa con la punta de la aguja en la parte inferior. Coloque el manl a 15 centímetros de la punta de la aguja y asegúrese de que la aguja esté apuntando al centro del tambor.

Conecte la línea de suministro eléctrico positivo a la punta de la aguja con un clip de cocodrilo metálico y conecte a tierra la manl conectando la línea de tierra al enchufe banana. Encienda el motor y ajuste la velocidad de encendido a 60 RPM. Encienda la bomba de jeringa para proporcionar un caudal de 2,0 mililitros por hora.

Mientras se crean los andamios de microfibra. Deje que la bomba funcione hasta que la solución se extruya de la punta de la aguja para cebar el sistema eliminando el aire de la aguja. A continuación, detenga la bomba de la jeringa.

Ajuste el volumen total de solución a expulsar a dos mililitros y encienda la bomba. A continuación, aplique un potencial de 14 kilovoltios entre la aguja y el mandril electro spin durante una hora hasta que dos mililitros de la solución de PET al 30% hayan sido electros girados con el andamio de microfibra aún en el mandril para apagar el potencial de voltaje. Retire la pinza de cocodrilo y sustituya la jeringa que contiene la solución de PET al 30 % por la jeringa que contiene la solución de PET al 8 %.

A continuación, vuelva a conectar la pinza de cocodrilo a la aguja de calibre 23. Cambie el caudal de la bomba de jeringa a 0,5 mililitros por hora y cebe la aguja haciendo funcionar la bomba de jeringa hasta que la solución fluya desde la punta. Con el mandril continuando girando a 60 RPM, aplique el potencial de 14 kilovoltios entre la punta de la aguja y el mandril, y configure el volumen total a extruir por la bomba de jeringa en dos mililitros.

Electrocentrifugar durante cuatro horas hasta que dos mililitros de la solución de PET al 8% se hayan electrocentrifugado. Cuando se complete el electrogiro, apague la fuente de alimentación y el motor que hace girar el mandril. Corte el andamio bifásico con una cuchilla a lo largo del ancho del mandril para producir una lámina de andamio 2D del tamaño de la superficie del mandril.

Para preparar andamios de PET alineados, cargue la jeringa que contiene una solución de PET al 10% en la bomba de jeringa con la punta de la aguja en la parte inferior. A continuación, conecte la pinza de cocodrilo a la aguja. Ajuste el caudal a 0,5 mililitros por hora y cebe la aguja con solución de PET.

Luego encienda el motor y ajuste la velocidad de giro del mandril a 2000 RPM. A continuación, encienda la bomba de jeringa. Ajuste el suministro de voltaje a 14 kilovoltios y encienda la fuente de alimentación electro spin durante cuatro horas hasta que dos mililitros de solución hayan sido electro girados.

Cuando se haya completado el electrogiro, apague la fuente de alimentación y el motor. Corte el andamio con una cuchilla a lo largo del ancho del mandril para producir una hoja de andamio 2D alineada. Guarde los andamios electrohilados en papel de aluminio para reducir la carga electrostática.

Utilice una pluma de biopsia de 0,8 milímetros de diámetro para perforar discos de andamios bifásicos o alineados de las láminas de SPU. A continuación, pegue el disco de andamio bifásico a una junta con pegamento de acuario no tóxico. Coloque las juntas y los andamios en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos.

Esterilice las juntas y los andamios con radiación ultravioleta I durante 30 minutos a cada lado de los andamios. A continuación, sumérjase en una solución antimicótica al 20% durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente. Lave los andamios con PP S3 varias veces y almacene los andamios en PBS a cuatro grados centígrados hasta que se utilicen.

Transfiera los andamios bifásicos del PBS a una placa nueva de 12 pocillos y caliéntelos en medios DMEM suplementados con 10% FCS durante una hora a 37 grados centígrados. Retire el medio suplementado con DMEM y coloque la fase de microfibra de los andamios aply seed 15, 000 células de cinco fibroblastos MRC en 30 microlitros de medio suplementado con DMEM en cada andamio para ayudar a que los fibroblastos penetren en el andamio. Coloque la placa en un agitador orbital y agite los andamios a 100 RPM durante dos horas.

A continuación, añada dos mililitros de medios suplementados con DMEM a cada andamio e incube los andamios durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, retire los medios de los pocillos y voltee los andamios para que la fase de nanofibras de los andamios quede orientada apicalmente. A continuación, siembre 30.000 células epiteliales de Cali en 30 microlitros de D-M-E-M-F 12 medios suplementados con 10%FCS en la fase de nanofibras del andamio.

Incubar el andamio durante dos horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono antes de sumergir los andamios en una mezcla 70 30 de D-M-E-M-F 12 y medios suplementarios DMEM y continuar con la incubación estática durante 12 horas adicionales para cultivar las vías respiratorias. En primer lugar, transfiera los andamios alineados del PBS a una placa fresca de 12 pocillos y caliéntelos junto con los medios suplementados con DMEM durante una hora a 37 grados centígrados. Retire el medio suplementado con DMEM y agregue 25.000 células de músculo liso de las vías respiratorias en 30 microlitros de medio suplementado con DMEM a cada andamio e incube durante dos horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Una vez colocados, sumerja los andamios en medios complementarios con DMEM. Devuélvalos a la incubadora y déjelos toda la noche antes de configurar un tricultivo en el biorreactor. Al día siguiente, coloque el andamio bifásico de semillas en la cámara del biorreactor con la fase epitelial hacia arriba en la cámara.

A continuación, coloque el andamio alineado debajo del andamio bifásico de modo que quede adyacente a la fase de microfibra del andamio bifásico. Bloquee las dos cámaras del biorreactor juntas. A continuación, ensamble dos circuitos de flujo de perfusión dentro de una incubadora como se describe en el protocolo de texto adjunto y bombee los medios alrededor de los dos circuitos a aproximadamente 0,1 mililitros por minuto utilizando una bomba peristáltica después de una semana.

Retire el medio de la cámara apical y el cultivo. Las células epiteliales en la interfaz aire-líquido durante una semana adicional antes del análisis, después de dos semanas en el biorreactor, el andamio de tres cultivos que se muestra aquí se fijó y seccionó para mostrar que los núcleos celulares distribuidos en las tres capas de la construcción de los núcleos celulares se tiñeron con DPI y aparecen de azul donde el material del andamio aparece gris. Aquí están las imágenes de microscopio electrónico de barrido de los electros, la microfibra de nanofibra hilada y los andamios alineados que se prepararon para sembrar células epiteliales, fibroblastos y células de músculo liso, respectivamente.

Los tres tipos de células mostraron un aumento en la viabilidad cuando se cultivaron en sus andamios individuales durante un período de dos semanas. Cada uno de ellos también continuó expresando proteínas específicas del tipo celular después del período de cultivo de dos semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar investigar la matriz extracelular nativa que está tratando de recrear con las fibras electros.

Las celdas se comportarán de manera diferente cuando se adjunten a diferentes topografías 3D. Por ejemplo, las células epiteliales solo formarán una barrera funcional cuando se cultiven en nanofibras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un sistema de cocultivo de múltiples capas, que se puede utilizar para el estudio de las interacciones intercelulares dentro de un entorno de cultivo dinámico.

No olvide que es importante adaptar sus parámetros de electrohilado, como el caudal y el voltaje, para que se adapten al sistema de polímero y solvente que pretende utilizar mientras realiza este procedimiento. Esto es crucial para generar las fibras deseadas. Además, recuerde elegir girar una campana o armario ventilado para permitir que los solventes se extraigan correctamente.