Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Este método puede ayudar con una pregunta clave en el campo de la ingeniería de células madre, como es cómo el microambiente celular altera los fenotipos y la función celular. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona el entorno múltiple creado artificialmente para las células en una sola placa, lo que no se podría realizar con un método convencional en placa de microcontacto, demostrando que este procedimiento lo harán los técnicos de Koki, Yoshimoto y Risako Sakai de nuestro laboratorio. Después de crear imágenes 3D de máscaras para matrices de nanofibras y moldes a partir de estructuras microfluídicas de acuerdo con el protocolo de texto.

Utiliza una impresora 3D para imprimir las mascarillas y el molde. Para preparar soluciones poliméricas para electrohilatura, diluya el líquido PMGI al 13 por ciento con tetrahidrofurano al nueve por ciento. Disuelva 0,08 gramos de PS en una proporción de volumen de uno a uno de THF a dimetilformamida y use un regente líquido para aumentar el volumen hasta el mililitro final de la solución de PS del ocho por ciento de peso por volumen.

Disuelva 0,1 gramos de GT en agua, ácido ácido y acetato de etilo y use la solución de solvente mezclado para aumentar el volumen hasta el mililitro final de 10 por ciento de peso por volumen de solución GT. A continuación, utilizando una máquina de pulverización catódica de magnetrón, deposite una capa de platino de cinco nanómetros de espesor sobre una placa base de poliestireno que sirve como cátodo en la configuración de electrohilado. Cargue cada solución de polímero en una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja roma de acero inoxidable de calibre 23.

A continuación, ancle las jeringas en una bomba de jeringa a 12 centímetros del colector del dispositivo de electrogiro. Conecte la aguja de la jeringa a una fuente de alimentación de alto voltaje y ajústela a 11 kilovoltios. Luego ajuste la velocidad de bombeo a 20 mililitros por hora y mantenga la temperatura y la humedad a 30 grados centígrados y menos del 30 por ciento en volumen, respectivamente.

Ahora coloque la mascarilla en la placa base. Luego, a través de los orificios de la máscara, fabrique nanofibras en la placa base con densidades distintas cambiando el tiempo de electro hilado. Retire la mascarilla de la placa base y repita la fabricación de nanofibras.

Cuando la matriz esté completa, colóquela en un desecador a 25 grados centígrados durante 16 horas para evaporar el solvente restante. Para reticular las nanofibras GT, trátelas con EDC 0,2 molar y NHS 0,2 molar en etanol. E incubar las muestras a 25 grados centígrados durante cuatro horas.

Para enjuagar las nanofibras GT, use etanol al 99,5 por ciento dos veces y seque las placas al vacío a 25 grados Celsius durante 16 horas. Para fabricar estructuras microfluídicas, mezcle 2 gramos de agente de curado PDMS y 20 gramos de base PDMS. A continuación, vierta la mezcla pre-PDMS en el molde fabricado.

En un desecador, desgasifique la mezcla pre PDMS durante 30 minutos. A continuación, cure la mezcla pre PDMS en un horno a 65 grados centígrados durante 16 horas. Para ensamblar matrices de Macme, retire la estructura de PDMS curada del molde y use etanol al 70 por ciento para limpiarla.

A continuación, descargue la corona atmosférica en la parte inferior de la estructura del PDMS. Ensamble rápidamente la estructura PDMS con la matriz de nanofibras. A continuación, hornee el conjunto a 65 grados centígrados durante dos días.

Con DPBS, lave los H9HESC cultivados en un plato de 35 milímetros. A continuación, añada 0,5 mililitros de tripsina proteasa ligera recombinante a la placa e incube a 37 grados centígrados durante un minuto. Aspire cuidadosamente sobre la mezcla de proteasa sobrenadante.

Agregue inmediatamente el medio HPSC y dispense suavemente el medio contra la superficie del plato repetidamente para disociar las células. A continuación, transfiera las células separadas a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifuga el tubo a 200 veces la gravedad durante tres minutos.

Aspirar el sobrenadante y suspender las células en medio HPSC precalentado. A continuación, pipetee 12 microlitros de la suspensión celular en cada cámara microfluídica. Después de marcar fluorescentemente las células de acuerdo con el protocolo de texto, retire la estructura microfluídica de PDMS de la matriz Macme.

A continuación, retire el PBMS residual de la matriz Macmé, añada un 90 por ciento de glicerol en PBS a las células teñidas y aplique un cubreobjetos. Por último, coloque la placa boca abajo sobre la platina de un microscopio de fluorescencia invertida. Y utilice el software de imágenes del microscopio para adquirir imágenes en color de 12 bits.

Aquí se muestran imágenes de inmunofluorescencia de H9HPSCs cultivadas a una alta densidad de siembra inicial en nanofibras de gelatina y teñidas con 3 marcadores fenotípicos celulares. Se utilizó el análisis SOM para convertir conjuntos de datos multiparamétricos de alta dimensión en mapas 2D de baja dimensión para comparar la homogeneidad y heterogeneidad de los niveles de expresión para los cuatro marcadores fenotípicos en cada conjunto de datos, y se realizó un agrupamiento jerárquico no supervisado para los nodos SOM. Como se indicó aquí, todos los grupos exhibieron una mayor expresión de OCT4 que la observada en la matriz de gel de membrana basal, o MG. El grupo uno mostró señales altas de EdU, lo que indica que la mayoría de las células estaban proliferando activamente.

Por lo tanto, los microambientes del grupo uno fueron adecuados para el mantenimiento de HPSC porque las HPSC indiferenciadas proliferan rápidamente cuando se acortan las fases de brecha del ciclo celular. El grupo dos incluyó células sembradas a una densidad inicial insuficiente y células cultivadas en andamios GT 2D que no admitían la autorrenovación de HPSC. Por ejemplo, la señal EdU de esta muestra se perdió y los niveles de anexina V aumentaron ligeramente, lo que indica que las células habían perdido su tallo y se habían vuelto gradualmente apoptóticas.

PMGI MidNF HighCD del grupo tres, que representa los microambientes que comprenden las matrices de nanofibras PMGI, mostró las mayores variaciones en las señales OCT4 y EdU en comparación con las otras condiciones. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que el investigador en el campo de las células STEM explorara la ingeniería de tejidos y el cribado avanzado.