Hazırlanması ve Bireysel Karakterizasyonu ve Multi-ilaç Fiziksel, polimerik misellerin Entrapped Loaded

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilaç yüklü hücrelerimi ilgilenilen hastalık durumlarında değerlendirmeden önce, bunların hazırlanması ve karakterize edilmesine yönelik adım adım bir süreç özetlemektir. Bu, çalışma için tekrarlanabilir hücreler üretmek amacıyla çözücü döküm yöntemiyle hücrelerimin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, hücrelerimin klinik olarak ilgili konsantrasyonları yükleme ve tutma kapasitesini belirleyen hücre yükleme stabilitesi ve boyutu değerlendirilir.

Ardından, in vivo stabiliteyi değerlendirmeden önce hücrelerin uygun in vitro salım özelliklerine sahip olduğundan emin olmak amacıyla, hücrelerden ilaç salım hızı belirlenir. Sonuçlar, tekrarlanabilir şekilde üretilen stabil hücrelerin, burada sunulan değerlendirme tekniklerine dayanarak çeşitli hastalık durumlarında ilaç iletimini yürütmek için bir platform sağlayabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin; denge yüklemesi veya diyaliz yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, miyozinlerin tekrarlanabilir ilaç yüklemesi ve boyutuyla çok daha hızlı hazırlanabilmesidir.

Nanölçekli ilaçlar geleneksel formların ötesinde fırsatlar sunduğundan, bu tekniğin etkileri çeşitli hastalık durumlarının tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Genellikle, yeni başlayan bireyler bu teknikler basit olsa bile zorlanabilirler; çünkü salım çalışmalarını gerçekleştirmeniz gerekir, aksi takdirde burst etkisini gerçekten değerlendiremezsiniz. Bu prosedürleri lisansüstü öğrencim Shaman Duke ve iş birlikçim Deepa gösterecekler. İlk olarak, çift ilaç yüklü miseller veya DDM için 1 mg DTX, 1 mg EVR ve 15 mg Peg 4,000 blok PLA 2200 tartın. Tartım işleminden sonra, ilaçları ve polimeri 0.5 mL asetonitrilde çözün, ardından çözeltiyi 5 mL'lik bir yuvarlak tabanlı balona aktarın; bir döner evaporatör kullanarak ilaç-polimer aseto çözeltisini indirgenmiş basınç altında buharlaştırarak ince bir ilaç dağılımlı polimer film oluşturun.

Ardından, ilaç polimer filmini 50 °C'de ön ısıtmaya tabi tutulmuş 0,5 mL deiyonize su ile yeniden hidrate edin ve miselleri oluşturmak için balonu 50 °C'lik bir su banyosunda hafifçe çalkalayın. Çözeltiyi bir santrifüj tüpüne aktarın ve 3 dakika boyunca 7.200 ×g hızında santrifüjleyin. Çözeltiyi bir iğne ile çekin ve çözünmemiş ilaç veya kontaminantları uzaklaştırmak için 0,2 µm naylon filtre kullanarak oluşan misel çözeltisini yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne filtreleyin. Bu aşamada, asetonitril ve su mobil fazı ile izokratik modda, 40 °C'de dengelenmiş bir C8 kolonu kullanarak ters faz HPLC analizi gerçekleştirin. Başlangıç ilaç yüklemesini belirlemek amacıyla, ters faz HPLC ile analiz etmeden önce yeni hazırlanan miselleri asetonitril ile 1:100 oranında seyreltin.

Seyreltilmemiş hücrelerimi oda sıcaklığında 48 saat boyunca sakladıktan sonra, ters faz HPLC ile yeniden değerlendirmek ve hücrelerimdeki ilaç stabilitesini 48 saat üzerinden belirlemek için taze seyreltilmiş örnekler hazırlayın. DTX ve DVR piklerini, sırasıyla 1,7 ve 5,7 dakikalık alıkonma süreleri ile 227 ve 279 nanometrelerde izleyin. Verileri, ilaç yüklemesinin ortalaması artı veya eksi standart sapma olarak sunun.

Ardından, taze hazırlanmış hücrelerimi ve deiyonize suyu, nihai polimer konsantrasyonu 1,5 mg/mL olacak şekilde 1:20 oranında seyreltin. Çözeltiyi dinamik ışık saçılması ölçümü için bir kaba aktarın. Saçılmayı belirlemek için 173 derecedeki helyum neon lazerin yoğunluğunu ölçün.

Verileri, ortalama Z boyutunun ortalaması artı veya eksi standart sapma ve dağılımın polidispersite indeksi veya PDI ile birlikte sunun. DDM'yi daha önce açıklandığı şekilde hazırladıktan sonra, 2,5 mililitre hücreyi, 7.000 g/mol moleküler ağırlık kesim noktasına sahip üç mililitrelik bir diyaliz kasetine yükleyin. Kaseti, aşağıdaki aralıklar boyunca 2,5 litre 10 mM pH 7,4 fosfat tamponuna yerleştirin.

Çözeltiden 150 µL çekin ve yerine 150 µL taze tampon ekleyin. Senkronizasyon koşullarını sağlamak için tamponu her üç saatte bir değiştirin. İlaç konsantrasyon eğrisini belirlemek için örnekleri ters faz HPLC kullanarak analiz edin.

İlaç salınım verilerini, D-T-X-E-V-R istatistiksel yazılımını kullanarak tek fazlı eksponansiyel ilişkilendirmeli basit bir difüzyon modeline göre uyarlayın; DDM, PEG 2000 blok PLA 1800 veya PEG 2000 blok PLA 2200 içerisinde 48 saat boyunca benzer bir stabilite göstermiştir. Tüm hücrelerim, oda sıcaklığında 48 saatte başlangıç yüklemesinin %97'sini veya daha fazlasını korumuştur. Dinamik ışık saçılım sonuçlarına dayanarak, tüm hücrelerim 0,2'den küçük PDI değerleri ile unimodal bir dağılım sergilemiştir.

Verilere dayanarak, tekil misellerden ve DDM'den DTX salınımı 48 saat boyunca yaklaşık %60 idi. Tekil misellerden ve DDM'den EVR salınımı sırasıyla %60 ve %50 idi. Tekil misellerden ve DDM'den %50 ilaç salınımı için gereken süre ve uyum iyiliği verileri burada sunulmuştur.

EVR bireyi dışındaki tüm hücrelerim için eğri uydurma iyiliği 0,950'nin üzerindedir; bu durum, birinci derece salınım varsayımının, bireysel hücrelerimden ve DDM'den ilaç salınımını açıklamak için iyi bir yaklaşım olduğu anlamına gelir. Bu tekniklerde uzmanlaşıldıktan sonra, hücrelerimdeki ilaç ve polimer kütüphanesi üzerinde rutin olarak birkaç saat ile bir hafta arasında işlem yapılabilir. Bu prosedür uygulanırken, hücre kültürüne veya hayvan modellerine erişmeden önce hücrelerin tamamen karakterize edilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır. Tedavinin etkinliğinde ilaç taşıyıcı sistemin rolüne ilişkin soruları yanıtlamak amacıyla, lipozomal taşıyıcı sistemler gibi diğer taşıyıcı sistemler de değerlendirilebilir veya karakterize edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ilaç yüklü hücreleri hastalık durumunda değerlendirmeden önce nasıl hazırlayacağınız ve karakterize edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.