Split-ve-havuz Sentezi ve Peptit Tersiyer Amid Kütüphanesi Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, peptit üçüncül amid veya PTA birimleri içeren kombinatoryal kütüphanelerin nasıl sentezleneceğini göstermektir. Bu, önce doğal amino asitlerden bir PTA alt monomeri hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, katı bir destek üzerinde bir peptit bağlayıcı bölgesi sentezlemektir.

Daha sonra, PTA ve peptit alt birimlerini içeren bir kombinatoryal kütüphane sentezlenir. Son adım, sentezin kalitesini sağlamak için sentezlenen kütüphaneyi karakterize etmektir. Sonuç olarak, doğrulayıcı kısıtlı PTA alt birimlerini içeren bir kombinatoryal kütüphane sentezlenir ve böyle bir kütüphane, protein ligandları sağlamak ve yeni ilaç keşfine yol açmak için yüksek verimli tarama için kullanılabilir.

Bu makalenin konusu olan kimya, daha önce üzerinde çalıştığımız bazı peptitlerden ve diğer şeylerden çok daha sert moleküller bulmaya çalışmak amacıyla geliştirildi. Fikir şu ki, eğer biri daha sert molekül kütüphanelerini tanımlarsa ve bunlar çok daha yüksek afiniteye sahip protein hedeflerine bağlanırsa, ve bunun ileriye dönük ilaçlar veya hatta ilginç prob molekülleri geliştirmeye çalışırken çok, çok önemli olduğunu düşündük. Bu PTA alt düzen sentezinin görsel gösterimi gerçekten kritiktir, çünkü sentezin öğrenilmesi zordur çünkü sıcaklık ve zamanlama kontrolü başarılı bir sentez için gerçekten kritiktir.

İlk olarak, manyetik bir karıştırma çubuğu ile 500 mililitrelik üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişeye 8.9 gram yemek ve 11.9 gram potasyum bromür ekleyin. Daha sonra şişeye 100 mililitre önceden hazırlanmış% 30 hidrojen bromür çözeltisi ekleyin. Şişeyi eksi 10 santigrat derece etilen glikol içine yerleştirdikten sonra, şişenin altından 10 dakika boyunca uzun bir iğne ile kuru buz banyosu köpüğü argonu.

Çözeltiyi manyetik karıştırma çubuğu ile 300 RPM'de karıştırın. Bunu takiben, önceden hazırlanmış bir sodyum nitrit çözeltisini, üç boyunlu, yuvarlak tabanlı şişeye bağlı bir basınç dengeleyici damlatma hunisine ekleyin ve bir septum ile kapatın. Damlatma hunisinin valfini yavaşça açın ve sodyum nitrit çözeltisinin şişeye damlamasına izin verin.

Damlama hızını saniyede yaklaşık iki damlaya ayarlamak için valfi kontrol edin. Sodyum nitrit ilavesi tamamlandıktan sonra, çözeltiyi üç saat daha karıştırmaya devam edin ve sıcaklığın eksi 10 santigrat dereceden oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Çözeltinin rengi çok koyuysa, reaksiyon sırasında oluşan fazla nitrojen oksitleri ve olası bromu çıkarmak için bir vakum uygulayın.

Çözelti bir ekstraksiyon hunisine aktarıldıktan sonra, ürünü 35 mililitre datil eter ile üç kez ekstrakte edin. Organik fazı birleştirdikten ve doymuş tuzlu suyla yıkadıktan sonra, bir şişeye toplayın ve altı saat boyunca sodyum sülfat üzerinde kurutun. Sodyum sülfatın süzülmesinin ardından, berrak ila soluk sarı bir yağ elde etmek için çözücüyü vakum altında buharlaştırın.

Ham ürünü silika jel ile saflaştırın, izotopik etiketleme için üç ila bir hekzan etil asetat ile kolon kromatografisi, 300 miligram L alanini 10 mililitre döteryumlu su ile 50 mililitrelik bir polietilen tüpte çözün. Cos substratı olarak 10 miligram alfa ketoglutarat ekledikten sonra, tüpü 37 santigrat dereceye ısıtın. Bitirdiğinizde, bir molar sodyum dute oksit çözeltisi ve pH test şeritleri kullanarak pH'ı 8,5 ila 8,7'ye ayarlayın.

Daha sonra, çözeltiye 0.1 miligram alanin transaminaz ekleyin. Tüpü 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve 10 ila 30 RPM'de hafif çalkalama ile gece boyunca inkübe edin. Bu noktada, 10 mililitre dimetilformamid içinde 10 mililitre dimetilformamid içinde Ram bağlayıcı ile bir gram 10 mikron, 10 jel boncukları hafif çalkalama ile şişirin, dimetilformamidi reaktörden boşaltın ve 10 mililitre %20 pi Perine dimetilformamid çözeltisi ekleyin.

Boncukları %20 Pepperdine solüsyonu ile 30 dakika çalkaladıktan sonra, tüm Pepperdine'i çıkarmak için beş kez dimetil forma eti ile yıkayın. Daha sonra, şırıngadan birkaç boncuk çıkarın ve bunları bir klor testi ile test edin. Boncuklara iki mililitre iki molar bromo asetik asit dimetilformamid çözeltisi ekleyin ve hafifçe çalkalayın.

Daha sonra boncuklara iki mililitre iki molar diyop propil karbo diamin dimetilformamid çözeltisi ekleyin. Şırıngayı bir pistonla kapattıktan sonra, boncukları bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika çalkalayın. Boncuklar dimetilformamid ile iyice yıkandıktan sonra, üzerlerine önceden hazırlanmış bir molar metoksi etil dimetilformamid çözeltisinden iki mililitre ekleyin.

Boncukları çalkaladıktan ve dimetilformamid ile beş kez yıkadıktan sonra, boncuklardan birkaçını klor testi ile kontrol edin. Bunu takiben, daha önce kullanılan şırıngaya 10 mililitre bire bir di kloral metan dimetilformamid çözeltisi ekleyin. Kesik pipet ucuna sahip 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak tüm bir gram boncukları üç beş mililitrelik şırınga reaktörüne eşit şekilde bölün.

Üç şırıngayı üç kez kloro metan ile yıkadıktan sonra, r ve s etiketli şırıngaları üç kez susuz tet hidro furin ile ve B etiketli şırıngayı üç kez dimetilformamid ile yıkayın. Bromo propan NOIC asidin tristin bağlanması için, çeker ocaktaki bir şişeye yaklaşık 200 miligram tristin ekleyin. Flakon kapatıldıktan sonra, flakondaki tristin miktarını tartın.

Daha sonra, mililitre başına 20 miligram Tri fosgen tetra hidro ferran çözeltisi yapmak için şişeye uygun miktarda susuz tetra hidro ferran ekleyin. Bromo asitleri tri fosgen karışımını hazırlamak için, her şişeye ayrı ayrı iki küçük şişede 89 mikrolitre R iki Bromo propan NOIC asit ve S iki Bromo propan NOIC asit D dört ekleyin, beş mililitre tristin tetra hidro furan çözeltisi ekleyin. Şişeleri kapattıktan sonra, 20 dakika boyunca eksi 20 santigrat derece dondurucuya koyun.

Bu arada, şırınga r ve s'ye iki ila bir tetra hidro furan di izopropil amin çözeltisinden 1.125 mikrolitre ekleyin. Ayrı olarak, beyaz çökeltiler veren soğutulmuş bromo asitleri fosgen karışımlarını içeren şişelerin her birine 356 mikrolitre 2 4 6 trimetil pürin ekleyin. İlgili süspansiyonu hemen doğrudan onaylanmış boncuklara uygulayın ve ardından iki saat boyunca 120 RPM'nin altında sallamak için bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.

Di izopropil karbo diamin ile bromo asetik asit eşleşmesi için, şırınga B'ye iki molar bromo asetik asit dimetilformamid çözeltisinden beş mililitre ekleyin.Çalkaladıktan sonra, aynı şırıngaya iki molar di propil karbo diamin dimetilformamid çözeltisinden beş mililitre ekleyin ve bu yer şırıngasını B şırınga r ve s şırıngası ile aynı çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayın. Daha sonra şırıngaları di kloro, metan ve dimetilformamid ile iyice yıkadıktan sonra şırıngaları iki saat çalkalayın. R, s ve B şırıngalarındaki tüm boncukları 12 mililitrelik bir şırınga reaktöründe toplayın.

Boncuklar dimetilformamid ile beş kez yıkandıktan sonra, şırıngaya 10 mililitre bire bir di kloro metan dimetilformamid çözeltisi ekleyin. Yayılma için kesilmiş bir pipet ucuna sahip 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak tüm boncukları yedi ayrı iki mililitrelik şırıngaya eşit olarak bölün, ilgili şırıngaya önceden hazırlanmış yedi molar amin çözeltisinden beş mililitre ekleyin. Yedi şırıngayı da 60 derecelik bir inkübatörde inkübe edin ve inkübasyonu takiben gece boyunca çalkalayın.

Beş kez bölünmesi gereken boncukları di kloral metan ile yıkayın. Boncukları 15 dakika salladıktan ve tekrar di kloro metan ile yıkadıktan sonra, di kloro metanı şırıngadan boşaltın. Daha sonra her bir boncuğu 96 oyuklu bir plakaya aktarın.

Bir ışık mikroskobu ve kesik uçlu bir pipet kullanarak, 96 oyuklu plakayı bir kapak kayması ile örtün ve 15 dakika boyunca eksi 20 santigrat derece dondurucuya koyun. Plaka dondurucudan çıkarıldıktan sonra, bir boncuk içeren oyukların her birine önceden hazırlanmış soğutulmuş bire bir TFA DI kloro metan çözeltisinden 20 mikrolitre ekleyin. Kapak fişini değiştirin ve 96 duvar plakasını eksi 20 santigrat derece dondurucudaki bir çalkalayıcıya yerleştirin.

20 dakika çalkaladıktan sonra 96 duvar plakasını dondurucudan çıkarın ve kapak fişini soyun. Üzerine hava üfleyerek her kuyucuktan di kloro metanı üfleyerek kurutun. %50 TFA DI CHLORO metan çözeltisi kullanılarak oda sıcaklığında bölündüğünde önemli ölçüde bozulma gözlenir.

Pikler 593 ve 484, sırasıyla bağlayıcı ve PTA trimerine karşılık gelir, bu da tüm molekülün boncuk üzerinde başarılı bir şekilde sentezlendiğini, ancak bölünme sırasında bozulduğunu gösterir. Yukarıda tarif edildiği gibi düşük sıcaklık koşulları altında bölündüğünde, TFA'nın neden olduğu bozunma miktarı büyük ölçüde bastırılır. Bölünme mekanizması önceki literatürde tanımlanmıştır ve bir olain ara maddesinden geçtiğine inanılmaktadır PTA molekülleri Ms.MS ile dizilenebilir ve parçalanma paterni peptitlere ve peptitlere benzer.

S iki, bromo propol asit D dört ile sentezlenen PTA molekülleri genellikle MS ve msm'de daha geniş pikler verir. Ms.Spectra, S iki bromo propan, NOIC asit D üç gibi eksik süreli ürünlerin varlığı nedeniyle, bu, dizileme prosedürü sırasında R Kiral merkezinin varlığının bir göstergesi olarak kullanılabilir, PTA molekülleri ayrıca peptit peptitten daha fazla ek eklenti oluşturma eğilimindedir. Bu nedenle düşük sodyumlu su ve plastik aparatlar tercih edilir.

Diğer bir potansiyel yan ürün, aminasyon sırasında brom eliminasyonundan oluşan akrilamiddir. Akrilamid oluşturulduktan sonra dizi sonlandırılır. Bu, çözeltiyi azaltmak için birincil amin konsantrasyonunun bir molar kısma düşürülmesiyle çözülebilir.

Temellik Bir kez ustalaştıktan sonra iyi boyutta bir kütüphane, düzgün bir şekilde yapılırsa iki gün içinde hazırlanabilir. Artık bu kimya tamamen geliştiğine ve sentez oldukça etkili olduğuna göre, diğer araştırmacıların ilaç geliştirme ve prob geliştirme için konformasyonel olarak kısıtlı peptit taklitleri yapmak için bu güçlü teknolojiyi benimseyeceklerini umuyorum.