Split-ve-havuz Sentezi ve Peptit Tersiyer Amid Kütüphanesi Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, peptid tersiyer amid veya PTA birimleri içeren kombinatoryal kütüphanelerin nasıl sentezleneceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle doğal amino asitlerden bir PTA alt monomeri hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım ise katı bir destek üzerinde peptid bağlayıcı bölgesinin sentezlenmesidir.

Ardından, PTA ve peptit alt birimleri içeren kombinatoryal bir kütüphane sentezlenir. Son adım, sentezin kalitesini doğrulamak amacıyla sentezlenen kütüphanenin karakterize edilmesidir. Nihayetinde, konformasyonel olarak kısıtlanmış PTA alt birimleri içeren kombinatoryal bir kütüphane sentezlenmiş olur ve böyle bir kütüphane, protein ligandları sağlamak ve yeni ilaç keşiflerine yol açmak için yüksek kapasiteli tarama amacıyla kullanılabilir.

Bu makaleye konu olan kimya, daha önce üzerinde çalıştığımız bazı peptidlerden ve diğer maddelerden çok daha sert moleküller bulma çabasıyla geliştirilmiştir. Buradaki temel fikir, daha sert moleküllerden oluşan kütüphaneler belirlenirse, bunların protein hedeflerine çok daha yüksek afinitelerle bağlanacağıdır; bunun, gelecekte ilaçlar ve hatta ilgi çekici prob molekülleri geliştirmeye çalışırken çok önemli olduğunu düşündük. PTA alt sıra sentezinin görsel demonstrasyonu gerçekten kritiktir; çünkü sıcaklık ve zamanlama kontrolü başarılı bir sentez için çok kritik olduğundan, bu sentezi öğrenmek zordur.

Öncelikle, bir manyetik karıştırma çubuğu ile birlikte 8,9 gram dine ve 11,9 gram potasyum bromürü 500 mililitrelik üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir balona ekleyin. Ardından, daha önce hazırlanmış 100 mililitre %30 hidrojen bromür çözeltisini balona ekleyin. Balonu -10 °C etilen glikol, kuru buz banyosuna yerleştirdikten sonra, uzun bir iğne aracılığıyla balonun tabanından 10 dakika boyunca argon gazı geçirin.

Çözeltiyi manyetik karıştırıcı ile 300 RPM hızında karıştırın. Ardından, önceden hazırlanmış sodyum nitrit çözeltisini, üç boyunlu yuvarlak tabanlı balona bağlı basınç dengeleyici damlatma hunisine ekleyin ve huniyi bir septuml ile kapatın. Damlatma hunisinin vanasını yavaşça açarak sodyum nitrit çözeltisinin balona damlamasını sağlayın.

Damlama hızını saniyede yaklaşık iki damla olacak şekilde ayarlamak için vanayı kontrol edin. Sodyum nitrit eklemesi tamamlandıktan sonra, sıcaklığın -10 °C'den oda sıcaklığına yükselmesine izin vererek çözeltiyi üç saat daha karıştırmaya devam edin. Çözeltinin rengi çok koyuysa, reaksiyon sırasında oluşan fazla azot oksitleri ve olası bromu uzaklaştırmak için vakum uygulayın.

Çözelti bir ayırma hunisine aktarıldıktan sonra, ürünü üç kez 35 mililitre etil eter ile ekstrakte edin. Organik fazı birleştirip doygun tuzlu su ile yıkadıktan sonra, bir balona toplayın ve altı saat boyunca sodyum sülfat üzerinde kurutun. Sodyum sülfatı filtreledikten sonra, berrak veya açık sarı renkli bir yağ elde etmek için solventi vakum altında evaporate edin.

Ham ürünü, üç bir oranında heksan etil asetat ile silika jel kolon kromatografisi kullanarak saflaştırın. İzotopik etiketleme için 300 mg L-alanini, 50 ml'lik bir polietilen tüp içerisinde 10 ml döteryumlanmış su ile çözün. Ko-substrat olarak 10 mg alfa-ketoglutarat ekledikten sonra tüpü 37 °C'ye ısıtın. İşlem tamamlandığında, 1 M sodyum döteryum oksit çözeltisi ve pH test şeritleri kullanarak pH'ı 8,5 ile 8,7 arasına ayarlayın.

Ardından, çözeltiye 0,1 mg alanin transaminaz ekleyin. Tüpü 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve 10 ila 30 RPM arasında hafif çalkalama ile gece boyunca inkübe edin. Bu aşamada, bir 12 mL şırınga reaktöründe, hafif çalkalama ile 10 mL dimetilformamid içerisinde 1 g 90 µm, 10 gel boncuğunu Ram linker ile üç saat boyunca şişirin; dimetilformamidi reaktörden boşaltın ve rinkamid linker'daki FOC grubunu korumasız hale getirmek için 10 mL %20'lik piperidin dimetilformamid çözeltisi ekleyin.

Boncuklar %20 Pepperdine çözeltisi ile 30 dakika boyunca çalkalandıktan sonra, tüm Pepperdine'ı uzaklaştırmak için dimetilformamid ile beş kez yıkayın. Ardından, şırıngadan birkaç boncuk çıkarın ve bunları kloral testi ile test edin. Boncuklara iki mililitre iki molar bromoasetik asit dimetilformamid çözeltisi ekleyin ve nazikçe çalkalayın.

Ardından boncukların üzerine iki mililitre iki molar diop propil karbodiamin dimetilformamid çözeltisi ekleyin. Şırıngayı bir pistonla kapattıktan sonra boncukları bir çalkalayıcıda 10 dakika boyunca çalkalayın. Boncuklar dimetilformamid ile iyice yıkandıktan sonra, üzerlerine önceden hazırlanmış iki mililitre bir molar metoksi etil dimetilformamid çözeltisi ekleyin.

Boncuklar çalkalandıktan ve beş kez dimetilformamid ile yıkandıktan sonra, boncuklardan birkaçını kloral testi ile kontrol edin. Bunu takiben, daha önce kullanılan şırıngaya 10 mililitre bire bir dikloral metan dimetilformamid çözeltisi ekleyin. Tüm bir gram boncuğu, ucu kesilmiş bir pipet ucu ve 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak üç adet beş mililitrelik şırınga reaktörüne eşit şekilde paylaştırın.

Üç şırıngayı üç kez klorometan ile yıkadıktan sonra, r ve s etiketli şırıngaları üç kez anhidroz tetrahidrofüran ile, B etiketli şırıngayı ise üç kez dimetilformamid ile yıkayın. Bromo propan NOIC asidin tristin eşleşmesi için, çeker ocak içinde bir viyale yaklaşık 200 miligram tristin ekleyin. Viyal kapaklandıktan sonra, viyalin içindeki tristin miktarını tartın.

Ardından, 20 mg/mL'lik bir trifosgen tetra hidro furan çözeltisi hazırlamak için şişeye uygun miktarda susuz tetra hidro furan ekleyin. Bromo asit trifosgen karışımını hazırlamak için, iki küçük şişeye ayrı ayrı 89 µL R-2-bromopropanoik asit ve S-2-bromopropanoik asit-d4 ekleyin; her bir şişeye beş mL trifosgen tetra hidro furan çözeltisi ilave edin. Şişeleri kapattıktan sonra, 20 dakika boyunca -20 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin.

Bu sırada, r ve s şırıngalarına 1,125 µL oranında ikiye bir tetra hidro furan di izopropil amin çözeltisi ekleyin. Soğutulmuş bromo asit fosgen karışımlarını içeren flakonların her birine, beyaz çökelekler oluşacak şekilde ayrı ayrı 356 µL 2,4,6-trimetil purin ekleyin. İlgili süspansiyonu derhal doğrudan modifiye edilmiş boncuklara uygulayın ve ardından 120 RPM'de iki saat boyunca çalkalamak üzere bir çalkalayıcıya yerleştirin.

Bromoasetik asidin diizopropilkarbodiamid ile kenetlenmesi için, şırınga B'ye beş mililitre iki molar bromoasetik asit dimetilformamid çözeltisi ekleyin. Çalkaladıktan sonra, aynı şırıngaya beş mililitre iki molar dipropilkarbodiamid dimetilformamid çözeltisi ekleyin ve nazikçe çalkalayın; ardından şırınga B'yi şırınga r ve s ile aynı çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra şırıngaları diklormetan ve dimetilformamid ile iyice yıkadıktan sonra iki saat boyunca çalkalayın. R, s ve B şırıngalarındaki tüm boncukları tek bir 12 mililitrelik şırınga reaktöründe toplayın.

Boncuklar dimetilformamid ile beş kez yıkandıktan sonra, şırıngaya 10 mililitre bir bire bir diklorometan dimetilformamid çözeltisi ekleyin. Tüm boncukları, boşaltma için ucu kesilmiş 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak yedi adet iki mililitrelik ayrı şırıngaya eşit şekilde paylaştırın; ardından, önceden hazırlanmış yedi farklı iki molar amin çözeltisinden beşer mililitreyi ilgili şırıngalara ekleyin. İnkübasyonun ardından, yedi şırınganın tamamını 60 °C'lik bir inkübatörde gece boyunca çalkalayarak inkübe edin.

Kesilecek boncukları diklorometan ile beş kez yıkayın. Boncukları 15 dakika sallayıp tekrar diklorometan ile yıkadıktan sonra, şırıngadaki diklorometanı boşaltın. Ardından her bir boncuğu ayrı ayrı 96 kuyucuklu plakaya aktarın.

Bir ışık mikroskobu ve ucu kesilmiş bir pipet kullanarak 96 kuyucuklu plakayı bir lamel ile kapatın ve -20 °C dondurucuya 15 dakika boyunca yerleştirin. Plaka dondurucudan çıkarıldıktan sonra, içerisinde boncuk bulunan her bir kuyucuğa, önceden hazırlanmış soğutulmuş bir bölü bir TFA diklorometan çözeltisinden 20 µL ekleyin. Lameli tekrar kapatın ve 96 kuyucuklu plakayı bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek yeniden -20 °C dondurucuya koyun.

20 dakika boyunca çalkaladıktan sonra 96'lı duvar plakasını dondurucudan çıkarın ve üzerindeki örtü camını soyun. Her bir kuyucuğun üzerinden hava üfleyerek diklorometanı kurutun. %50 TFA diklorometan çözeltisi kullanılarak oda sıcaklığında koparma işlemi gerçekleştirildiğinde, belirgin bir bozunma gözlenir.

593 ve 484 pikleri sırasıyla bağlayıcıya ve PTA trimerine karşılık gelmekte olup, tüm molekülün boncuk üzerinde başarıyla sentezlendiğini ancak cleavage sırasında bozunduğunu göstermektedir. Yukarıda açıklandığı gibi düşük sıcaklık koşulları altında cleavage yapıldığında, TFA kaynaklı bozunma miktarı önemli ölçüde baskılanır. Cleavage mekanizması önceki literatürde tanımlanmıştır ve bir olaine ara ürünü üzerinden ilerlediğine inanılmaktadır PTA molekülleri Ms.MS ile sekanslanabilir ve fragmantasyon paterni peptitler ve peptitler ile benzerdir.

S-2-bromopropiyonik asit D-4 ile sentezlenen PTA molekülleri, S-2-bromopropan ve NOIC asit D-3 gibi tamamlanmamış reaksiyon ürünlerinin varlığı nedeniyle MS ve msm'de genellikle daha geniş pikler verir. Bu durum, sekanslama prosedürü sırasında R kiral merkezinin varlığının bir göstergesi olarak kullanılabilir; ayrıca PTA molekülleri peptidlere göre daha fazla adükt oluşturma eğilimindedir. Bu nedenle, düşük sodyumlu su ve plastik ekipmanlar tercih edilir.

Diğer bir potansiyel yan ürün, aminasyon sırasındaki brom eliminasyonu ile oluşan akrilamiddir. Akrilamid oluştuktan sonra sekans sonlanır. Bu durum, çözeltiyi azaltmak amacıyla birincil amin konsantrasyonunun bir molar seviyeye düşürülmesiyle çözülebilir.

Bazisite, iyi bir şekilde uygulandığında, yeterli büyüklükte bir kütüphane iki gün içinde hazırlanabilir. Bu kimya tamamen geliştirildiğine ve sentez oldukça etkili hale geldiğine göre, diğer araştırmacıların ilaç geliştirme ve prob geliştirme amacıyla konformasyonel olarak kısıtlanmış peptid mimetikleri üretmek için bu güçlü teknolojiyi benimsemelerini umuyorum.